劉艷華 翟 斐 王心靜 曹志紅 楊秉芬 程小星 (解放軍第309醫(yī)院結(jié)核病研究室，北京100091)

結(jié)核病是目前世界上死亡率最高的慢性傳染病。近年來多耐藥性結(jié)核分枝桿菌的出現(xiàn)以及與HIV共感染病例的增加，使得結(jié)核病人的死亡率不斷上升，臨床特效藥的匱乏和BCG疫苗接種效果的差強(qiáng)人意，使得結(jié)核病的防治面臨嚴(yán)峻挑戰(zhàn)［1］?；顒有越Y(jié)核病人常表現(xiàn)為免疫抑制，深入開展結(jié)核病的免疫病理學(xué)研究對結(jié)核病的防治具有重要意義。

轉(zhuǎn)錄因子PLZF(Promyelocytic leukemia zinc finger)是轉(zhuǎn)錄抑制因子BTB/POZ的家族成員。研究表明，PLZF在 γδT細(xì)胞、NK細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞中廣泛表達(dá)，是iNKT細(xì)胞(Invariant CD1d-dependent natural killer-like T cells)發(fā)育的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子和發(fā)揮效應(yīng)功能必須的調(diào)節(jié)因子［2-4］。iNKT細(xì)胞是上世紀(jì)90年代后期在人類中發(fā)現(xiàn)的一類具有免疫調(diào)節(jié)作用的T細(xì)胞亞群。成熟的iNKT細(xì)胞經(jīng)過抗原刺激活化后能迅速分泌IFN-γ、IL-4、IL-10等細(xì)胞因子，調(diào)節(jié)機(jī)體的先天性免疫和獲得性免疫［5，6］。研究表明，iNKT細(xì)胞在抗 MTB 感染免疫中發(fā)揮重要作用，但是活動性結(jié)核病人外周血中iNKT細(xì)胞的數(shù)量通常減少［7，8］，具體機(jī)制還不清楚。

本研究通過熒光定量RT-PCR方法比較了活動性結(jié)核病人和健康人PBMCs中PLZF mRNA的表達(dá)差異，流式細(xì)胞術(shù)分析了兩組樣本的iNKT細(xì)胞含量，結(jié)果顯示活動性結(jié)核病人PBMCs中PLZF mRNA的表達(dá)和iNKT細(xì)胞含量均顯著低于健康對照，PLZF mRNA的表達(dá)水平與iNKT細(xì)胞的百分含量成正相關(guān)，提示活動性結(jié)核病人PBMCs中PLZF表達(dá)降低與iNKT細(xì)胞的減少相關(guān)，可能與活動性結(jié)核病人的免疫抑制相關(guān)。

1 材料與方法

1.1受試者的篩選 活動性結(jié)核病人為309醫(yī)院結(jié)核病研究所診斷明確的住院病人。結(jié)核病的診斷依據(jù)包括：痰涂片抗酸染色、分枝桿菌細(xì)菌培養(yǎng)、胸部X射線檢查、以及臨床癥狀和抗結(jié)核治療的效果。本研究選擇的活動性結(jié)核病人沒有其他基礎(chǔ)疾病，病程不超過2個月，入院治療不超過2周。對照組為309醫(yī)院體檢中心常規(guī)健康體檢項目正常(包括胸部X射線表現(xiàn)正常)的健康人。本研究經(jīng)309醫(yī)院倫理道德委員會批準(zhǔn)，所有受試者均簽署知情同意書。

1.2臨床標(biāo)本的采集 篩選21例診斷明確的活動性結(jié)核病人，平均年齡為39歲，采集其靜脈血2 ml。22例體檢中心健康人，平均年齡為37歲，采集靜脈血2 ml?？鼓谑覝胤胖茫诓杉?小時內(nèi)處理。

1.3PBMCs的分離 Ficoll淋巴細(xì)胞分離液(GE公司)分離抗凝血。具體方法為：取2 ml平衡至室溫的Ficoll到離心管中，再緩慢加入2 ml混勻的抗凝血，2 000 r/min離心20分鐘，吸取中間的白膜層，加入到裝有10 ml 1640培養(yǎng)液(Gibco公司)的離心管中洗滌，1 000 r/min離心10分鐘，去上清，沉淀即為PBMCs。

1.4細(xì)胞總RNA的提取 Trizol(Invitrogen公司)法提取細(xì)胞總RNA。具體操作為：按1×106細(xì)胞/1 ml Trizol的比例加入Trizol，渦旋使其完全裂解，室溫靜置5分鐘;按0.2 ml氯仿/1 ml Trizol加入氯仿，渦旋30秒后室溫靜置5分鐘，4℃ 11 400 r/min離心15分鐘，取上層無色水相至新離心管中;按0.5 ml異丙醇/1 ml Trizol的比例加入異丙醇，混勻后室溫放置10分鐘，沉淀RNA，4℃ 11 400 r/min離心10分鐘，棄上清;加入1 ml 75%的乙醇洗滌沉淀，4℃ 8 700 r/min離心10分鐘，棄上清，室溫干燥10分鐘;加入 100 μl DEPC處理的無 RNAase的ddH2O，-20℃保存。

1.5cDNA合成 采用Applied Biosystems公司逆轉(zhuǎn)錄試劑，按說明書操作。反應(yīng)體系為：總RNA為5 μl，dNTPs(100 mmol/L) 為 0.2 μl，MultiScribe 逆轉(zhuǎn)錄酶為 1 μl，10 × RT buffer為 2 μl，RNase inhibitor(20 U/μl)為 0.2 μl，Oligo(dT)為 2 μl，DEPC 水為 9.6 μl，共20 μl。反應(yīng)條件為16℃ 30 分鐘，42℃30分鐘，85℃ 5分鐘。

1.6PLZF和HPRT基因擴(kuò)增引物的序列與合成根據(jù)文獻(xiàn)［2］中的PLZF和HPRT引物，擴(kuò)增片段分別為73 bp和78 bp。PLZF引物：上游5＇-TAGTTTGCGGCTGAGAATGC-3＇;下游 5＇-ACCGCACTGATCACAGACAAAG-3＇。HPRT 引物：上游 5＇-GAAAGGGTGTTTATTCCTCATGG-3＇; 下 游：5＇-CTCCCATCTCCTTCATCACATC-3＇。引物由北京賽百盛公司合成。

1.7熒光定量PCR 采用北京天根生物有限公司的SYBR Green1熒光定量試劑盒檢測樣本中PLZF和HPRT的表達(dá)。反應(yīng)體系為：12.5 μl的Premix，上下游引物各 0.5 μl(工作濃度為 0.5 μmol/L)，cDNA 模板為 2.5 μl，DEPC 水為 9 μl。PCR 反應(yīng)條件：50℃ 2分鐘，95℃ 2分鐘，然后95℃ 15秒，53℃30秒，進(jìn)行45個循環(huán)。

1.8流式細(xì)胞儀檢測iNKT細(xì)胞的含量 用含2%胎牛血清(杭州四季青)的PBS緩沖液(Wash buffer)重懸分離的 PBMCs，取(2～3)×105個細(xì)胞，2 000 r/min離心5分鐘，棄上清，細(xì)胞沉淀用抗體稀釋液染色(含 25 μl Wash buffer，7 μl anti-Vα24-PE 和 7 μl anti-Vβ11-FITC 抗體，Beckman 公司)，4℃避光靜置30分鐘，然后用1 ml Wash buffer重懸，2 000 r/min離心 5分鐘，沉淀用 500 μl Wash buffer重懸，利用流式細(xì)胞儀(Beckman公司)檢測，細(xì)胞含量用Flow Jo軟件分析。

1.9數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計學(xué)分析 采用2-(CtPLZF-CtHPRT)方法計算每個樣本中 PLZF的相對表達(dá)量，采用GraphPab Prism 5.0軟件的Mann-Whitney test分析活動性結(jié)核病人PBMCs中PLZF mRNA的表達(dá)和iNKT細(xì)胞含量是否有統(tǒng)計學(xué)差異，P＜0.05為差異顯著。采用Spearman相關(guān)性分析PLZF的表達(dá)量和iNKT細(xì)胞含量的相關(guān)性，P＜0.05為顯著性相關(guān)。

2 結(jié)果

2.1細(xì)胞總RNA質(zhì)控 在RT-PCR實(shí)驗中，細(xì)胞總RNA的純度和完整性是進(jìn)行下游實(shí)驗的基本要求。通過確保所有RNA樣品純度和質(zhì)量的一致性可以降低生物學(xué)重復(fù)的差異。本實(shí)驗提取的所有RNA樣品經(jīng)OD260/280分光光度法檢測比值均在1.8～2.0之間，表明RNA質(zhì)量良好，沒有蛋白質(zhì)和苯酚的污染。本實(shí)驗經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析，可觀察到28s RNA、18s RNA和5s RNA三條帶，其中28s RNA的條帶亮度大約是18s RNA條帶亮度的2倍，提示提取的RNA樣本完整性較好(見圖1)。

2.2基因擴(kuò)增的退火溫度和特異性檢測 本實(shí)驗對PLZF和HPRT的擴(kuò)增退火溫度進(jìn)行了優(yōu)化，實(shí)驗的退火溫度范圍為50℃ ～65℃，結(jié)果顯示在退火溫度為53℃時，PLZF和HPRT的Ct值最小，表明在此溫度下擴(kuò)增效率最高。隨后本實(shí)驗對PLZF和HPRT擴(kuò)增特異性進(jìn)行檢測，PCR反應(yīng)的溶解曲線顯示PLZF和HPRT分別顯示單一峰，提示PCR產(chǎn)物為單一產(chǎn)物(見圖2)。

2.3PLZF和HPRT基因擴(kuò)增效率的檢測 采用2-△△Ct方法對目的基因進(jìn)行相對定量。條件是目標(biāo)基因和參照基因擴(kuò)增效率接近100%，且相互間效率偏差在5%以內(nèi)，因此，必須驗證目標(biāo)基因和參照基因的擴(kuò)增效率。一般用標(biāo)準(zhǔn)曲線來確定qPCR的反應(yīng)效率。本實(shí)驗將反轉(zhuǎn)錄的cDNA進(jìn)行4倍的梯度稀釋，對每個稀釋度做3次重復(fù)，取其平均Ct值，做濃度/Ct的標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果顯示PLZF基因的擴(kuò)增效率為91%，HPRT的擴(kuò)增效率為92%，擴(kuò)增效果較好，表明此反應(yīng)體系可以用于PLZF相對表達(dá)量的計算(見圖3)。

圖1 細(xì)胞總RNA的瓊脂糖凝膠電泳圖Fig．1 Agarose gel electrophoresis of cellular total RNA

圖2 PLZF和HPRT基因擴(kuò)增的溶解曲線圖Fig．2 The dissolution curve of the PLZF gene and the HPRT gene in 53℃

2.4活動性結(jié)核病人和健康人PLZF的相對表達(dá)量比較及統(tǒng)計學(xué)分析 本實(shí)驗活動性結(jié)核病人組年齡在21～65歲，平均年齡為(39±12)歲，健康對照組年齡在22～52歲，平均年齡為(37±9)歲。公2-健康人(CtHPRT-CtPLZF)。結(jié)果顯示活動性結(jié)核病人 PBMCs中PLZF mRNA的表達(dá)比健康對照的表達(dá)低，是健康對照的0.67倍，結(jié)果有顯著差異，P=0.0102(見表1和圖4)。

圖3 PLZF和HPRT的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖Fig．3 Standard curve of the PLZF and HPRT gene

圖4 活動性結(jié)核病人和健康人PLZF mRNA表達(dá)比較Fig．4 The comparison of PLZF mRNA in active TB and healthy controls

表1 活動性結(jié)核病人和健康人PBMCs中PLZF mRNA的相對表達(dá)Tab．1 The expression of PLZF mRNA in PBMCs of active TB and healthy controls

圖5 活動性結(jié)核病人和健康人iNKT細(xì)胞百分含量比較Fig．5 The comparison of iNKT percentage in active TB and healthy controlsNote：*.P＜0.05.

2.5活動性結(jié)核病人和健康人iNKT細(xì)胞含量比較及統(tǒng)計學(xué)分析 活動性結(jié)核病人外周血iNKT含量為0.03%(0.12%/0.00%)，健康人外周血iNKT含量為0.09%(0.21%/0.01%)，兩組數(shù)據(jù)差異顯著(P=0.001 2)，表明活動性結(jié)核病人外周血中iNKT細(xì)胞數(shù)量顯著下降(見圖5)，同本室之前發(fā)表的結(jié)果一致［8］。

2.6PLZF的表達(dá)和iNKT細(xì)胞含量的相關(guān)性分析為了研究PLZF mRNA的表達(dá)與iNKT細(xì)胞的含量是否相關(guān)，活動性結(jié)核病人的PBMCs分兩份，一份提取RNA，熒光定量PCR檢測PLZF mRNA的表達(dá)，一份用iNKT細(xì)胞的特異性抗體標(biāo)記，流式細(xì)胞術(shù)檢測iNKT細(xì)胞的表達(dá)。然后通過統(tǒng)計學(xué)軟件分析PLZF mRNA的表達(dá)和iNKT細(xì)胞含量的相關(guān)性。Spearman相關(guān)性分析顯示，r=0.480 4、P=0.027 5見圖6，表明活動性結(jié)核病人PLZF mRNA和iNKT細(xì)胞的含量成顯著性正相關(guān)，提示PLZF mRNA表達(dá)降低與iNKT百分含量的減少有關(guān)。

3 討論

PLZF/ZBTB16最初被鑒定為急性前髓細(xì)胞性白血病(Acute promyelocytic leukemia，APL)染色體異位的視磺酸受體(Retinoic acid receptor α，RARα)的融合蛋白。PLZF是POK(POZ and Kruppel)蛋白家族中的一個轉(zhuǎn)錄抑制子，包括一個N末端的BTB/POZ結(jié)構(gòu)域和C末端的9個C2H2Kruppel樣鋅指結(jié)構(gòu)域，BTB/POZ結(jié)構(gòu)域能介導(dǎo)同源或異源蛋白質(zhì)的二聚，Kruppel樣鋅指結(jié)構(gòu)通過與啟動子調(diào)節(jié)區(qū)相應(yīng)反應(yīng)元件的相互作用抑制啟動子轉(zhuǎn)錄，PLZF的鉸鏈區(qū)含一個PEST結(jié)構(gòu)域，能啟動泛素化降解PLZF［2］。

圖6 活動性結(jié)核病人PLZF mRNA表達(dá)與iNKT細(xì)胞含量的相關(guān)性分析Fig．6 The correlation of PLZF expression and iNKT percentage in active TB

研究表明，PLZF是iNKT細(xì)胞發(fā)育和發(fā)揮功能所必須的轉(zhuǎn)錄因子。PLZF缺陷的轉(zhuǎn)基因小鼠中CD1d限制性NKT細(xì)胞發(fā)育受損，在外周組織中的數(shù)量嚴(yán)重降低，發(fā)育的iNKT缺乏天然樣T細(xì)胞的許多特性，如聚集在淋巴結(jié)中而不是肝臟中，不表達(dá)NKT表面標(biāo)志，沒有活化表型，活化后也不能分泌大量的IL-4和IFN-γ［2-4］。此外，PLZF是高表達(dá)CD44記憶表型T細(xì)胞CD44hi MP T(包括NKT、MAIT和CD8αα等固有樣T細(xì)胞)細(xì)胞發(fā)育的調(diào)節(jié)子。這些研究提示PLZF 與宿主的免疫反應(yīng)密切相關(guān)［9，10］。

iNKT細(xì)胞在抗MTB感染免疫中發(fā)揮重要作用。MTB感染小鼠經(jīng)iNKT活化配體αGalCer治療后生存時間顯著延長。研究表明，數(shù)量有限的iNKT細(xì)胞在體外能充分抑制MTB的復(fù)制，并且將未感染MTB小鼠的原發(fā)性脾iNKT細(xì)胞轉(zhuǎn)移至感染致病性MTB小鼠體內(nèi)后，能顯著降低后者肺臟中MTB的載量。此外，MTB感染的小鼠經(jīng)anti-CD1單抗處理后，體內(nèi)MTB復(fù)制能力增強(qiáng)并且脾細(xì)胞產(chǎn)生的IFN-γ和TNF-α減少［11］。研究證實(shí)，活動性結(jié)核病人 PBMCs中iNKT 細(xì)胞數(shù)量減少［7，8］，但其機(jī)制還不清楚。

本研究通過對活動性結(jié)核病人和正常人PBMCs中PLZF的定量分析，顯示PLZF在活動性結(jié)核病人是表達(dá)降低的，通過對活動性結(jié)核病人PBMCs中PLZF mRNA的表達(dá)和iNKT細(xì)胞的含量的相關(guān)性分析，顯示PLZF mRNA的表達(dá)與iNKT細(xì)胞含量成正相關(guān)，提示活動性結(jié)核病人PBMCs中PLZF的表達(dá)降低與iNKT細(xì)胞的減少相關(guān)。進(jìn)一步研究PLZF表達(dá)降低對iNKT細(xì)胞功能的影響以及PLZF表達(dá)降低與免疫抑制的關(guān)系對結(jié)核病的免疫抑制研究和免疫防治有重要意義。

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