王凡平 王明永 楊建斌 趙東方 王紅坡 邵 峰 孫瑞利 郭慶合 凌明智 趙永新宋士軍 郭繼強 (新鄉(xiāng)醫(yī)學院醫(yī)學檢驗系，新鄉(xiāng)453003)

甘露聚糖結(jié)合凝集素(Mannan-binding lectin，MBL)是由肝細胞分泌的血漿蛋白，為天然免疫系統(tǒng)中的關(guān)鍵分子［1］。近年來一些研究發(fā)現(xiàn)，MBL作為C型凝集素家族的重要成員和天然免疫中的關(guān)鍵分子，除了其固有的抗感染作用外，還發(fā)揮多種免疫調(diào)節(jié)作用［2-7］。陳月等［8］研究發(fā)現(xiàn)，MBL 能夠誘導(dǎo)樹突狀細胞(Dendritic cell，DC)成熟，但機制并不明了。已報道，DC成熟過程中，模式識別受體Toll樣受體(Toll-like receptors，TLRs)的表達發(fā)生改變;文獻有報道，與MBL同為膠凝素家族成員的補體C1q能夠通過核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB信號途徑誘導(dǎo)DC成熟［9］。MBL誘導(dǎo)DC成熟是否也與TLRs和NF-κB有關(guān)呢?需深入研究。

本研究以 TLRs和NF-κB為切入點，旨在初步探討MBL誘導(dǎo)DC成熟機制。

1 材料與方法

1.1材料 人血漿天然MBL按文獻［10］制備;rh-GM-CSF和rhIL-4購自Pepro-Tech公司。PE標記的鼠抗人CD1a、CD80及CD86單克隆抗體(mAb)，F(xiàn)ITC標記的鼠抗人 CD83、CD86及 MHC-DR的mAb，同型 FITC-IgG1、PE-IgG1陰性參照抗體均為eBioscience公司產(chǎn)品。RPMI1640及尼龍毛柱購自Gibco公司;淋巴細胞分離液(Ficoll，密度1.077)為上海試劑二廠生產(chǎn);新生牛血清(Newborn calf serum，NCS)購自杭州四季青生物工程材料研究所;鼠抗人 NF-κB mAb p65、抗 β-actin兔多克隆抗體及HRP-羊抗鼠IgG購自Sigma公司;鼠抗人MBL pAb購自R＆D公司;核蛋白提取試劑盒為Pierce公司產(chǎn)品，凝膠電泳遷移率變動分析(EMSA)測定試劑盒為Promega公司產(chǎn)品;［γ32-P］ATP為北京亞輝生物試劑公司產(chǎn)品;結(jié)合緩沖液：20 mmol/L Tris-HCl(pH8.0)、150 mmol/L NaCl、1 mmol/L CaCl2、2 mmol/L MgCl2、5 g/L BSA、1 g/L 疊氮鈉;其它化學試劑均為進口或國產(chǎn)分析純產(chǎn)品;FACSCalibur流式細胞儀為美國BD公司產(chǎn)品。

1.2方法

1.2.1人外周血Mo的獲取 取健康成人志愿者的外周血，肝素抗凝后，用Ficoll密度梯度離心法分離單個核細胞。以PBS洗去血小板，于37℃貼壁3小時后棄上清，以37℃預(yù)溫的RPMI1640輕洗去除非貼壁的細胞，刮取貼壁的黏附細胞即為Mo，用含10%NCS的 RPMI1640調(diào)整細胞密度為1×109個/L。

1.2.2DC的體外誘導(dǎo) 向Mo懸液中加入rhGMCSF和rhIL-4，分3組進行DC培養(yǎng)。常規(guī)組：只加rhIL-4和rhGM-CSF培養(yǎng)7天;MBL刺激組：培養(yǎng)5天后加入MBL(10 mg/L)繼續(xù)培養(yǎng)2天;MBL+Anti-MBL刺激組：培養(yǎng)5天后加入MBL(10 mg/L)和Anti-MBL pAb繼續(xù)培養(yǎng)2天;人血清白蛋白(HSA)刺激組(陰性對照)：培養(yǎng)5天后加入HSA繼續(xù)培養(yǎng)2天。在誘導(dǎo)DC的過程中，每3天半量換液并補充相應(yīng)的細胞因子，于倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)。7天后收集懸浮的細胞，分析DC的表型及功能。

1.2.3DC的表型分析 用預(yù)冷PBA(0.01 mol/L PBS+20 g/L BSA+0.1 g/L NaN3)洗滌不同實驗組誘導(dǎo)7天后的懸浮細胞并調(diào)整細胞密度為5×109個/L。于100 μl細胞懸液中，分別加入兩兩組合的標記抗體，即 PE-抗 CD1a和 FITC-抗 CD83、PE-抗CD80 和 FITC-抗CD40、PE-抗 CD86 mAb 和 FITC-抗MHC-DR mAb各20 μl，同時設(shè) PE和 FITC標記的小鼠IgG1抗體作為對照，于4℃避光標記30分鐘后，用預(yù)冷PBA洗滌2次。最后用500 μl PBS懸浮細胞，于流式細胞儀上分析DC的表型。

1.2.4制備FITC-MBL 按照文獻［11］，采用透析法，以FITC標記MBL，標記產(chǎn)物FITC-MBL的F/P比值為2.4。

1.2.5細胞結(jié)合試驗 imDC用A緩沖液(調(diào)整Ca2+濃度分別為 1 mmol/L、5 mmol/L，或者用 5 mmol/L EDTA代替CaCl2)重懸并調(diào)整細胞密度為5 ×109個/L，于200 μl細胞懸液中加入 FITC-MBL，37℃避光反應(yīng)30分鐘。選擇用人血漿MBL生理濃度的上限15 mg/L作為實驗中MBL用量的標準濃度。

表1 引物序列及RT-PCR產(chǎn)物的大小Tab．1 Primer sequence and sizes of RT-PCR products

1.2.6RT-PCR分析DC TLR2、TLR4 mRNA的表達 細胞總RNA的制備：分別取上述體外誘導(dǎo)的各實驗組1×107個細胞，用無菌PBS洗1次，按Trizol法操作指南提取總RNA。以1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定其完整性，用紫外分光光度儀測定其 OD260nm/OD280nm比值。統(tǒng)一調(diào)整總RNA濃度為0.15 mg/ml，立即反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。PCR引物的設(shè)計與合成：參考文獻［12］并經(jīng)Primer premier 5.0軟件分析，由上海博亞公司合成TLR2、TLR4和GAPDH等3對特異性引物(序列見表1)。GAPDH作為內(nèi)參照。cDNA合成：分別取不同實驗組DC總RNA各1 μg、5 × RT Buffer 4 μl、dNTP Mixture(各 10 mol/L)2 μl、RNase inhibitor(10 U/ μl)1 μl、Oligo(dT)20(10 pmol/ μl)1 μl和 ReverTra Ace 1 μl，加 RNase Free H2O至總反應(yīng)體積20 μl。42℃反應(yīng)20分鐘合成cDNA第一鏈，99℃ 5分鐘滅活反轉(zhuǎn)錄酶終止反應(yīng)，4℃ 5分鐘復(fù)性。PCR：反應(yīng)體系為：10×buffer 2 μl、dNTPs 2 μl(各 0.25 mol/L)，上、下游引物各 1 μl(10 μmol/L)，模板 cDNA 1.5 μl，Taq DNA 多聚酶(5 U/μl)0.2 μl，加 DEPC 處理水至總反應(yīng)體積20 μl。TLR2的PCR反應(yīng)條件為：94℃變性30秒，60℃退火15秒，72℃延伸90秒，循環(huán)35次。TLR4的PCR反應(yīng)條件為：94℃變性30秒，60℃退火25秒，72℃延伸1分鐘，循環(huán)35次。GAPDH的 PCR反應(yīng)條件為：94℃變性30秒，63℃退火30秒，72℃延伸1分鐘，循環(huán)35次。取各PCR擴增產(chǎn)物5 μl于1%瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色，紫外燈下觀察、拍照，并用凝膠成像儀分析DNA片段的灰度值。

1.2.7EMSA和 Western blot分析 NF-κB細胞核移位 ①EMSA分析：按照Pierce公司提供的試劑盒說明書進行細胞核蛋白的提取，采用Bradford法檢測提取液蛋白濃度，核蛋白-70℃凍存?zhèn)溆?。根?jù)Promega公司提供的EMSA檢測試劑盒說明書進行各組細胞NF-κB活性的檢測。探針的制備：分別按順序取1.75 mol/ml NF-κB特異性核苷酸2 μl、10×T4多聚核苷酸激酶緩沖液1 μl、3 000 Ci/mmol［γ32-P］ATP 1 μl、無核酸酶蒸餾水 5 μl和 5 ×103～1 ×104U/μl的 T4 多聚核苷酸激酶 1 μl，混勻后于37℃水浴中反應(yīng)10分鐘，加入0.5 mol/L EDTA 1 μl終止反應(yīng)，并加入 89 μl TE 緩沖液(10 mmol/L Tris-HCl，1 mmol/L EDTA，pH7.9)，混勻置4℃保存。特異及非特異性競爭實驗：在加入標記探針前，先加未標記的特異性探針(NF-κB寡核苷酸探針)，并逐漸增加未標記的探針濃度(特異性競爭實驗);在加入標記探針前，先加入未標記的非特異性探針，并逐漸增加未標記的非特異性探針濃度(非特異性競爭實驗)。于室溫反應(yīng)10分鐘使探針與NF-κB結(jié)合，再進行PAGE。電泳后，取下凝膠制得干膠，于-70℃放射自顯影12小時。②Western blot分析：5 μg細胞核蛋白提取物進行12%SDSPAGE，樣品經(jīng)SDS-PAGE分離后;恒壓60 V轉(zhuǎn)移3小時;轉(zhuǎn)移后的PVD膜浸入含3%脫脂奶粉的PBST中封閉2小時;再將膜浸入1∶500稀釋的鼠抗人NF-κB mAb p65中，室溫反應(yīng)60分鐘;洗膜5次;加1∶1 500稀釋的HRP-羊抗鼠IgG，室溫反應(yīng)60分鐘。洗滌后以DAB顯色試劑盒顯色，終止反應(yīng)，陰干后拍照。

在諸城市龍都街道大源社區(qū)，集林木種苗栽植、綠化工程施工、現(xiàn)代林業(yè)、旅游觀光于一體的生態(tài)園林公司——大源園林生態(tài)園，現(xiàn)已建成7200多畝。該項目是由山東大源建設(shè)集團投資5億元，與大黑龍溝等6個自然村聯(lián)合，采用“企業(yè)+社區(qū)+合作社+農(nóng)戶”的模式規(guī)劃建設(shè)，整體占地10000畝。目前，該園區(qū)可提供60多個品種的瓜果采摘，帶動當?shù)?00多名老百姓就業(yè)，全年約接待游客20萬人次。讓林區(qū)變景區(qū)、田園變公園，農(nóng)產(chǎn)品變旅游商品，大源園林生態(tài)園實現(xiàn)了園區(qū)旅游收益和農(nóng)戶采摘收益的“雙豐收”，構(gòu)建起“企業(yè)+農(nóng)戶”“林業(yè)+旅游”和諧發(fā)展的新局面。

1.3統(tǒng)計學分析 應(yīng)用SPSS13.0軟件包進行統(tǒng)計處理，計量資料用

2 結(jié)果

2.1MBL對DC表面標志表達的影響 流式細胞儀分析(圖1)發(fā)現(xiàn)，與常規(guī)組相比較，MBL刺激組中CD83+、CD86+和MHC-DR+DC的數(shù)量均顯著增多，加入抗MBL pAb，MBL的刺激效應(yīng)消失。

2.2MBL以Ca2+依賴方式結(jié)合imDC FCM分析表明，MBL在無Ca2+、或含EDTA的結(jié)合緩沖液中幾乎不與imDC細胞結(jié)合，而在分別含1 mmol/L、5 mmol/L的結(jié)合緩沖液中，MBL與imDC的結(jié)合逐漸增強，呈Ca2+濃度依賴關(guān)系(圖2)。

圖1 不同刺激劑對DC表型的影響Fig．1 Effects of different stimulators on the phenotypes of DCs

圖2 MBL以Ca2+依賴方式結(jié)合imDCFig．2 Ca2+-dependent binding of MBL with imDCs

2.3MBL對imDC TLR2、TLR4 mRNA表達的影響用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定總RNA顯示28 S和18 S rRNA兩條清晰帶，紫外分光光度法測定總RNA樣品OD260/OD280nm比值均大于1.8，表明提取的總RNA均具有較高的純度和完整性。RT-PCR結(jié)果(圖3)顯示：PCR擴增產(chǎn)物為預(yù)期大小;隨著DC的成熟，TLR2、TLR4 mRNA表達減少(Lane 2)，與常規(guī)組相比，MBL組減少的更加明顯(Lane 4)，加入抗MBL pAb，MBL的作用效應(yīng)消失(Lane 5)。

圖3 MBL減弱imDC TLR2、TLR4 mRNA表達Fig．3 The decreased mRNA expressions of TLR2 and TLR4 in DCs by MBL

圖4 MBL增強DCs NF-κB活性Fig．4 MBL enhancement of NF-κB activity in DCs

2.4MBL促進NF-κB活性 為進一步探討MBL影響DC成熟的有關(guān)信號通路，我們又檢測了MBL對核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的活性影響。EMSA結(jié)果顯示：與常規(guī)組相比，MBL刺激能夠顯著增加imDC核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的DNA結(jié)合能力(圖4A)，加入抗MBL pAb，MBL的作用效應(yīng)消失;Western blot結(jié)果進一步證明，MBL刺激能夠顯著增加imDC核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB由胞漿向胞核轉(zhuǎn)位，加入抗MBL pAb，MBL的作用效應(yīng)消失(圖4B)。

3 討論

作為專職APC，DC在啟動獲得性免疫應(yīng)答中扮演著極其重要的角色。DC可以通過其模式識別受體(Patten recognition receptor，PRR)識別多種病原體相關(guān)分子模式(Pathogen-associated molecule pattern，PAMP)，誘導(dǎo)DC成熟。PRR誘導(dǎo)的DC成熟不僅增強其激活T淋巴細胞的能力，而且增強DC本身產(chǎn)生免疫調(diào)節(jié)相關(guān)的細胞因子。作為一類重要的PRR，TLR分子不僅能夠介導(dǎo)對病原微生物及其產(chǎn)物的識別，而且能夠參與獲得性免疫應(yīng)答，被視為聯(lián)系天然免疫和獲得性免疫的橋梁。已有研究資料表明，imDC高表達多種TLR分子，如TLR2、TLR4，但是隨著DC的成熟，TLR分子的表達逐漸降低，對于完全成熟的 DC，一些 TLR分子(如 TLR2和TLR4)的表達幾乎檢測不到。本研究結(jié)果顯示，與常規(guī)組相比，MBL組DC TLR2和TLR4表達減弱更加明顯，提示MBL確實有誘導(dǎo)DC成熟的功能。

許多研究結(jié)果證實NF-κB與DC的功能密切相關(guān)，它不僅決定了DC激活初始T淋巴細胞的能力，而且與多種炎性細胞因子的分泌有關(guān)(如TNF-α、IL-1、IL-6 等)［14-16］。作為一類重要的 PRR，TLR 介導(dǎo)的信號通路可以激活多種轉(zhuǎn)錄因子的表達，其中核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB對DC成熟和細胞因子產(chǎn)生至關(guān)重要，隨著DC的成熟，NF-κB活性明顯增強，TLRNF-κB信號途徑是影響DC成熟的極為重要的信號通路。我們研究發(fā)現(xiàn)，與常規(guī)組相比，MBL明顯增強NF-κB的DNA結(jié)合能力和由胞漿向胞核轉(zhuǎn)位的能力，提示MBL通過NF-κB信號途徑來調(diào)節(jié)DC成熟的。

綜上所述，MBL能夠與DC表面分子直接相互作用，減弱DC表面TLR2與TLR4的表達，增強DC NF-κB活性，提示MBL能夠通過調(diào)控 TLR/TNF-κB信號通路來發(fā)揮其調(diào)節(jié)DC成熟功能。

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