王平 王麗梅 張薇 柏銀蘭 康健 郝彥斐 羅泰來 徐志凱

據(jù)WHO估計全世界已有約20億人感染Mtb，其中受耐藥菌株感染者可能達到5000萬，有傳染性患者1110萬，每年新發(fā)患者約940萬，每年死亡人數(shù)高達200萬，在所有傳染病中TB死亡率僅次于AIDS［1］。WHO將TB與 AIDS、瘧疾一起列為人類最主要的傳染性殺手。BCG是用于TB預防的惟一有效疫苗，但其保護效果不理想，在不同地區(qū)免疫保護效果從0%到80%不等［2］，尤其對于成人的保護效果低下。因此，迫切需要研制新型有效的抗結核疫苗以加強對TB的預防和控制。

當前正在開發(fā)的TB新型疫苗主要包括亞單位疫苗、基因疫苗、重組BCG疫苗、減毒或增強的全菌體活疫苗及營養(yǎng)缺陷型活疫苗等。其中重組活疫苗是將編碼Mtb保護性抗原的基因導入活的微生物載體內(nèi)進行表達，一方面利用Mtb特異性的保護性抗原獲得對Mtb的保護力，另一方面利用活載體強的免疫佐劑特性加強機體產(chǎn)生的特異性免疫反應［3］。因此，在活疫苗的研究中如何獲得理想免疫效果的疫苗最關鍵的是：第一，選擇合適的具有免疫佐劑作用的載體；第二，選擇合適的靶抗原。

恥垢分枝桿菌（Mycobacterium smegmatis，M.s）是一種生長較快的非致病菌分枝桿菌。研究表明M.s具有與BCG相似的免疫學特性，能夠刺激T淋巴細胞增殖，促使分泌各種細胞因子如γ干擾素（IFN－γ）、白細胞介素－2（interleukin－2，IL－2）、白細胞介素－12（interleukin－12，IL－2）等，啟動 Th1型免疫應答，提高機體對病原體的吞噬和殺滅作用等［4］。Goldstone等［5－6］將 Mtb 4種分泌型蛋白在 M.s中進行表達，結果M.s中表達的重組蛋白與天然蛋白的生物學特性幾乎完全相同，重組蛋白的表達量為BCG中的5～10倍。

Ag85B是Mtb分泌蛋白中含量最高的一個蛋白，其與Mtb的細胞壁的合成有關，并與人纖維連接蛋白結合后參與致病過程。Ag85B具有較強的免疫原性，用Ag85B蛋白或基因疫苗免疫小鼠，對小鼠感染H37Rv毒株具有免疫保護作用。比較基因組學發(fā)現(xiàn)，ESAT－6是 Mtb的毒力相關抗原，其在BCG及非致病性分枝桿菌中均缺失。研究發(fā)現(xiàn)ESAT－6亞單位疫苗能夠激發(fā)一種強的ESAT－6特異性T細胞反應保護性，與BCG作用相當；ESAT－6還是免疫回憶效應細胞的主要靶抗原之一，可在再次Mtb感染的早期，誘導其迅速增殖和釋放高水平的IFN－γ，激活單核巨噬細胞，并控制感染［7－8］。據(jù)文獻報道，用Ag85B與ESAT－6融合蛋白亞單位疫苗免疫小鼠，對小鼠具有免疫保護作用，能夠降低小鼠對毒株H37Rv的臟器荷菌數(shù)，提高小鼠存活率［9］。本課題組前期利用基因重組技術構建表達Ag85B－ESAT－6融合蛋白基因，并利用分枝桿菌表達載體將其電穿導入M.s中表達（重組M.s命名為Ag85B－ESAT 6－r M.s，專利號：CN 101875913A），結果Ag85B－ESAT－6能夠在 M.s中特異性的表達。本研究進一步評價了 Ag85B－ESAT－6－r M.s在小鼠中的免疫原性，為其用于TB新型疫苗的研究奠定基礎。

材料和方法

1.菌株、質(zhì)粒和試劑：M.s（ATCC mc2155）、BCG，分泌表達 Ag85B－ESAT－6融合蛋白的重組M.s均由本室保存。7 H9和7H10培養(yǎng)基，油酸白蛋白葡萄糖過氧化氫酶添加劑（OADC）等均購自BD公司（Becton Dickinson公司，USA）；淋巴細胞增殖 MTS［3－（4，5－dimethylthiazol－2－yl）－5（3－carboxymethoxyphenyl ）－2－（4－sulfopheny ）－2H－tetrazolium，inner salt］檢測試劑盒、細胞因子IL－2、IL－4和IFN－γ等檢測試劑盒均購自 Mabtech公司（Mabtech AB，Stockholm，Sweden）。Ag85B－ESAT－6融合蛋白由本室前期制備保存［10］。

2.實驗動物：6周齡BALB/c雌鼠，由第四軍醫(yī)大學動物中心提供。

3.小鼠免疫：6周齡雌性BALB/c小鼠50只，數(shù)字表法隨機分為5組，每組10只。各組小鼠經(jīng)背部皮下注射方式免疫，分別為生理鹽水（saline）組（0.2 ml/只），BCG 組 1×106CFU/（0.2 ml/只），M.s組1×106CFU/（0.2 ml/只），Ag85B－ESAT－6－r M.s組1×106CFU/（0.2 ml/只），Ag85B－ESAT－6融合免疫組50μg/（0.2 ml/只）。

4.小鼠外周血CD4＋和CD8＋T細胞所占百分比分析：小鼠免疫1周后開始每周采血1次，隨機抽取3只/（組/周），持續(xù)至第6周，以尾靜脈采血方式采取乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝血約300μl，用0.83%NH4Cl紅細胞裂解液裂解紅細胞制備單個淋巴細胞懸液，用p H 7.4的磷酸鹽緩沖液（PBS）調(diào)整細胞濃度為1×105個/ml，各取100μl，加10μl熒光標記羊抗鼠單克隆抗體：異硫氰酸熒光素（FITC）標記 CD4和 R－藻紅蛋白（RPE）標記 CD8的雙抗（Becton Dickinson公司，USA））染色30 min，流式細胞儀檢測CD4＋、CD8＋T細胞所占百分比。

5.ELISPOT檢測小鼠脾淋巴細胞細胞因子：各組小鼠免疫6周后斷頸處死，無菌分離脾臟。200目銅網(wǎng)研磨制備單個脾細胞。用0.83%NH4Cl紅細胞裂解液裂解紅細胞制備脾淋巴細胞懸液，調(diào)整細胞濃度為2×106個/ml。檢測細胞量為2×105個/（100μl/孔）。分別用融合蛋白 Ag85B－ESAT－6（5μg/孔），結核菌素純蛋白衍生物（PPD）（5μg/孔）和Con A蛋白（5μg/孔）進行刺激。酶聯(lián)免疫斑點檢測（enzyme－linked immunospot assay，ELISPOT）具體實驗步驟參照試劑盒說明書進行。

6.小鼠脾淋巴細胞增殖實驗：按上述實驗方法制備小鼠的脾淋巴細胞懸液，調(diào)整細胞濃度為1×105個/ml。用MTS法檢測各組小鼠脾淋巴細胞的增殖。實驗分為空白對照組（加入培養(yǎng)液）、未刺激組、Ag85B－ESAT－6蛋白刺激組（5μg/孔），PPD 蛋白刺激組（5μg/孔）和Con A蛋白陽性對照組（5μg/孔）。每組設3個復孔，各孔加入細胞1×104/100 μl，37℃ 5%CO2培養(yǎng) 72 h后，加入 MTS 20μl/孔，繼續(xù)培養(yǎng)3 h，酶標儀490 nm可見光波長測定吸光度，計算淋巴細胞增殖指數(shù)，增殖指數(shù)（SI）＝（試驗孔A值－空白對照孔）/（陰性未刺激對照孔－空白對照孔）。

結 果

1.免疫小鼠外周血淋巴細胞CD4＋和CD8＋T細胞所占百分比：小鼠免疫后1～6周連續(xù)尾靜脈采血，分離外周血淋巴細胞，流式細胞儀檢測CD4＋和CD8＋T細胞所占百分比。結果表明，與生理鹽水組相比，各組免疫小鼠隨著免疫時間的延長，小鼠外周血中的CD4＋和CD8＋T細胞所占比率逐漸增高（圖1）。當免疫6周后，Ag85B－ESAT－6－r M.s免疫組小鼠外周血CD4＋和CD8＋T細胞所占比率達到（59.6±1.5）%，明顯高于 BCG 免疫組［（48.8±2.3）%］（t＝12.252，P＜0.05）、M.s免疫組［（45.7±1.6）%］（t＝20.166，P＜0.05）和其他各對照免疫組 小 鼠 ［Ag85B－ESAT－6：（45.6±1.7）% （t＝19.468，P ＜0.05），saline：（27.1±1.0）% （t＝56.939，P＜0.05）］。

圖1 免疫小鼠外周血淋巴細胞中CD4＋和CD8＋T細胞所占百分比分析

2.ELISPOT檢測免疫小鼠脾淋巴細胞細胞因子產(chǎn)生水平：各組小鼠免疫6周后分離小鼠脾淋巴細胞，ELISPOT法檢測脾淋巴細胞特異性分泌IFN－γ、IL－2和IL－4等細胞因子的水平［斑點形成細胞（spot forming cells，SFC）］，結果如圖2所示。與生理鹽水組相比，各免疫組均可特異性刺激IFN－γ、IL－2和IL－4等細胞因子的分泌，且分泌IFN－γ的細胞頻數(shù)明顯高于分泌IL－2 ［（85.4±20.7）SFC/106］或IL－4［（87.8±13.7）SFC/106］的細胞頻數(shù)（t＝6.174，6.449，P＜0.05）。其中 Ag85B－ESAT－6－r M.s免疫小鼠后刺激產(chǎn)生的特異性分泌IFN－γ的細 胞 頻 數(shù) 最 高 ［（167.5±36.6）SFC/106］，與saline組［（25.3±18.1）SFC/106］、Ag85B－ESAT－6蛋白 免 疫 組 ［（48.7±17.3）SFC/106］、M.s 組［（94.6±27.1）SFC/106］和BCG組［（98.5±26.9）SFC/106］相比，差異具有統(tǒng)計學統(tǒng)計學意義［Ag85B－ESAT－6－r M.s組與對照組t檢驗，t值分別為：11.013（saline），9.280（Ag85B－ESAT－6），5.062（M.s）和4.804（BCG），P 值均＜0.05］。

圖2 免疫小鼠脾淋巴細胞產(chǎn)生IFN－γ、IL－2和IL－4等細胞因子的水平

3.免疫小鼠脾淋巴細胞增殖指數(shù)：小鼠免疫后6周，MTS法檢測免疫小鼠的脾淋巴細胞增殖指數(shù)。結果如圖3所示，Ag85B－ESAT－6－r M.s免疫小鼠后可以明顯刺激小鼠脾淋巴細胞增殖，SI為3.23±0.31，明顯高于saline組（1.16±0.26）（t＝16.179，P＜0.05）和 Ag85B－ESAT－6蛋白免疫組（2.11±0.38）（t＝7.222，P＜0.05），但與BCG免疫組（2.95±0.36）相比，其免疫小鼠的脾淋巴細胞SI差異無統(tǒng)計學意義（t＝1.864，P＞0.05）。

圖3 免疫小鼠脾淋巴細胞增殖指數(shù)

討 論

目前TB又死恢復燃，成為威脅人類健康的第一殺手。我國是全球TB高負擔國家之一，TB患者數(shù)量位居世界第二，而Mtb感染人數(shù)則位居世界第一。因此，如何能有效地預防和控制TB在我國尤其顯得迫切。

TB新型疫苗的研制是預防和控制TB感染與傳播的一個有效途徑。當前TB新型疫苗研究的種類有亞單位疫苗、基因疫苗、重組BCG、減毒或增強的全菌體活疫苗及營養(yǎng)缺陷型活疫苗等。不同種類的疫苗有著各自不同的優(yōu)缺點，其中活疫苗接種后，在體內(nèi)有一定程度的生長繁殖能力，可以模擬自然感染的過程，刺激機體產(chǎn)生全面的體液免疫、細胞免疫和局部黏膜免疫，免疫效果較高且持久。本研究評價的表達 Mtb Ag85B－ESAT－6融合蛋白的重組恥垢分枝桿菌（Ag85B－ESAT－6－r M.s）經(jīng)皮下免疫小鼠后可以有效刺激小鼠CD4＋和CD8＋T淋巴細胞的產(chǎn)生，且從免疫初始開始刺激產(chǎn)生的CD4＋和CD8＋T細胞所占百分比就明顯高于原始M.s刺激產(chǎn)生的和BCG免疫產(chǎn)生的，表明Ag85B－ESAT－6融合蛋白的加入能夠明顯增強M.s的免疫原性，且Ag85B－ESAT－6－r M.s較 BCG 能夠更快和有效地刺激產(chǎn)生CD4＋和CD8＋T細胞反應應答，這對于機體控制胞內(nèi)菌Mtb感染具有重要的意義。同時，Ag85B－ESAT－6－r M.s能夠明顯刺激小鼠脾淋巴細胞增殖，其誘生脾淋巴細胞分泌IFN－γ的水平明顯高于BCG免疫組，且分泌IFN－γ的細胞頻數(shù)也顯著高于分泌IL－2和IL－4的細胞頻數(shù)，表明Ag85BESAT－6－r M.s能夠刺激機體產(chǎn)生有利于抗 Mtb感染的免疫反應，作為TB新型候選疫苗具有一定的研究前景。

活疫苗的另一個優(yōu)點就是其接種途徑多。可通過注射、滴鼻、點眼、飲水、口服、氣霧等途徑刺激機體產(chǎn)生全面的免疫反應。因此，下一步筆者將通過不同的接種途徑、不同的免疫劑量來評價Ag85BESAT－6－r M.s重組活疫苗在小鼠模型中抗 Mtb的保護效果，進一步評價其用于TB新型候選疫苗的應用前景。

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