吳小麗 閉蘭 趙亞杰 羅丹 齊建新 王炯 李忠明

近年來，結(jié)核病疫情嚴(yán)重，卡介苗雖然是全球使用最廣泛的預(yù)防結(jié)核病的疫苗，可預(yù)防和減輕兒童的重癥結(jié)核病，但對成人肺結(jié)核的保護效果不穩(wěn)定［1］，因而，新型結(jié)核疫苗的研究對于預(yù)防和控制結(jié)核病具有重要意義。Mtb分泌蛋白Ag85復(fù)合物是Mtb的主要分泌性蛋白，也是Mtb主要保護性靶抗原的一部分，Ag85復(fù)合物在Mtb H37Rv株中占分泌蛋白總量的30%［2］，是一組主要的 Mtb分泌蛋白，具有分枝菌酸轉(zhuǎn)移酶活性，在Mtb細(xì)胞壁合成的最后階段發(fā)揮重要作用。將Ag85蛋白或DNA疫苗免疫動物后可誘導(dǎo)特異的免疫反應(yīng)［3］，是新疫苗研制的熱點。為了研究本所中試生產(chǎn)的結(jié)核DNA疫苗的免疫效能，本實驗將編碼Ag85A蛋白的質(zhì)粒免疫小鼠，對該疫苗的免疫效能進(jìn)行研究，茲報告如下。

材料和方法

一、材料

小鼠IFN－γELISA 檢測試劑盒和小鼠IL－4 ELISA檢測試劑盒，為北京四正柏生物科技有限公司產(chǎn)品；小鼠IFN－γ酶聯(lián)免疫斑點檢測試劑盒（ELISPOT），為Mabtech公司產(chǎn)品。

二、方法

1.動物分組：選取4～6周齡BALB/c小鼠，通過數(shù)字表法隨機分成2組，每組10只，一組為結(jié)核DNA疫苗免疫組，一組為PBS對照組。

2.小鼠免疫：將我所300 L發(fā)酵罐中試規(guī)模生產(chǎn)的凍干結(jié)核DNA疫苗（結(jié)核DNA疫苗，批號090607）用滅菌生理鹽水復(fù)溶，配制成1 mg/ml溶液，以每次每只100μg/100μl的劑量采用兩點注射于小鼠后腿肌內(nèi)進(jìn)行免疫，共免疫3次，每次間隔3周。

3.樣本采集：（1）血清樣本采集：共采集2次血樣標(biāo)本，分別為免疫前眼眶采基礎(chǔ)血及免疫結(jié)束后第3周摘眼球取血。（2）脾細(xì)胞制備：摘眼球取血，隨后斷頸處死小鼠，通過無菌操作取出小鼠脾臟，采用小鼠淋巴細(xì)胞分離液（達(dá)科為生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)）分離淋巴細(xì)胞，通過20%FBS－RPMI1640培養(yǎng)基（含20%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液）調(diào)整細(xì)胞濃度至1×106個/ml。

4.小鼠脾細(xì)胞IFN－γ分泌檢測：采用Mabtech公司Mouse IFN－γELISPOT進(jìn)行檢測。（1）將調(diào)整好濃度（1×106個/ml）的細(xì)胞懸液加入各實驗孔，每只小鼠12個孔，100μl/孔（4個孔一組，分別加入Ag85A、陰性對照、合成肽）；每塊板設(shè)置一組質(zhì)控陽性對照（4個孔，各板之間應(yīng)選取同一只小鼠的淋巴細(xì)胞）、背景負(fù)對照（4個孔，加入20%FBSRPMI 1640培養(yǎng)基）。（2）分別加入刺激物Ag85A、20%FBS－RPMI 1640（不加刺激物）、合成肽（10μl/孔），質(zhì)控陽性對照中加入刀豆蛋白A（Con A）刺激物（10μl/孔），背景負(fù)對照加入20%FBS－RPMI 1640。（3）所有樣品和刺激物加完后，蓋好板蓋。放入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。（4）具體檢測按照試劑盒說明書進(jìn)行。（5）將ELISPOT板寄往達(dá)科為生物技術(shù)有限公司（深圳實驗室）進(jìn)行斑點計數(shù)。

5.脾細(xì)胞CD4＋、CD8＋百分率檢測：采用流式細(xì)胞術(shù)對小鼠脾細(xì)胞CD4＋、CD8＋百分率進(jìn)行檢測。實驗同時設(shè)置免疫組小鼠脾細(xì)胞和對照組小鼠脾細(xì)胞。步驟如下：（1）將小鼠（1×106）個/ml脾細(xì)胞1 ml懸于100μl含1%牛血清白蛋白（BSA）的PBS中，二組同時加入FITC標(biāo)記的兔抗鼠CD4抗體和PE標(biāo)記的兔抗鼠CD8抗體各10μl，室溫避光孵育30 min。（2）PBS洗細(xì)胞2次，加入2%甲醛固定液重懸細(xì)胞，使用流式細(xì)胞儀檢測。

6.血清細(xì)胞因子（IFN－γ、IL－4）檢測：（1）血清IFN－γ檢測：采用北京四正柏生物科技有限公司小鼠IFN－γ酶聯(lián)免疫檢測試劑盒進(jìn)行。①從已平衡至室溫的密封袋中取出所需板條，除空白孔外，分別將血清樣本（19只小鼠，每只重復(fù)2個孔，共38個孔）和不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品 （100μl/孔）加入相應(yīng)孔中，37℃濕盒孵育90 min。②洗板5次，除空白孔外，加入生物素化抗體工作液 （100μl/孔），37℃濕盒孵育60 min。③洗板5次，除空白孔外，加入酶結(jié)合物工作液 （100μl/孔），37℃濕盒孵育30 min。④洗板5次，加入顯色劑100μl/孔，避光37℃濕盒孵育10～15 min。⑤加入終止液100μl/孔，混勻后5 min內(nèi)酶標(biāo)儀讀取450 nm和630 nm吸光度值（A450/630）。（2）血清IL－4檢測：采用北京四正柏生物科技有限公司小鼠IL－4酶聯(lián)免疫檢測試劑盒進(jìn)行（方法和步驟同血清IFN－γ檢測）。

7.血清抗體檢測：采用間接ELISA方法對小鼠血清抗Ag85A抗體進(jìn)行檢測。（1）包被：用碳酸鹽緩沖液將Ag85A稀釋至10μg/ml，加入96孔微孔板（深圳金燦華實業(yè)有限公司生產(chǎn)）每孔100μl，放4℃濕盒過夜。（2）封閉：棄包被液，用含5/104吐溫－20的磷酸鹽緩沖液（PBST）洗板5遍，用紗布拍干。每孔加1%BSA 200μl，置37℃濕盒2 h。封閉好的96孔微孔板烘干后置4℃冰箱內(nèi)，1周內(nèi)使用。（3）加樣：將每只小鼠免疫前后采集的血清按確定的稀釋倍數(shù)1∶10稀釋（稀釋液為1%BSA）；100μl/孔，置于37℃濕盒，溫育60 min。（4）加酶結(jié)合物：PBST洗板5遍，用紗布拍干。用抗體稀釋液將辣根過氧化酶標(biāo)記的羊抗大鼠免疫球蛋白G（HRP－GAM IgG）稀釋至1∶20 000，加入96孔微孔板，每孔100μl，置于37℃濕盒，溫育30 min。（5）顯色：PBST洗板5遍，用紗布拍干。先加入底物A液顯色（成分是：NaAc·3H2O 9.185 g，檸檬酸1.576 g，過氧化脲0.45 g，加雙蒸水溶解后稀釋至750 ml，調(diào)p H值至5.0～5.5），每孔50μl，再加入底物B液顯色，每孔50μl，置37℃反應(yīng)10 min后，每孔加入2 mol/L硫酸50μl終止顯色。（6）讀數(shù)：終止反應(yīng)后30 min內(nèi)，酶標(biāo)閱讀儀測定A450和A630值，A450減去A630，以行校對。

8.數(shù)據(jù)分析：對于脾細(xì)胞CD4＋、CD8＋百分率和血清細(xì)胞因子IFN－γ、IL－4水平測定結(jié)果采用t檢驗比較；脾細(xì)胞特異性IFN－γ分泌水平采用SPSS 11.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，比較兩組之間的差異，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、細(xì)胞免疫相關(guān)因子檢測

1.小鼠脾細(xì)胞IFN－γ分泌檢測：根據(jù)讀板結(jié)果，獨立樣本t檢驗顯示：t＝36.538，P＝0.018，結(jié)核DNA疫苗免疫組分泌IFN－γ細(xì)胞個數(shù)（103.6±112.14）高于PBS對照組（5.78±5.83），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t＝36.538，P＝0.018）（表1）。

2.脾細(xì)胞CD4＋、CD8＋百分率檢測：流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果表明，結(jié)核DNA疫苗免疫組CD4＋細(xì)胞百分率均值為21.57%，高于PBS對照組12.17%，兩者比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t＝3.043，P＝0.038）；結(jié)核DNA疫苗免疫組CD8＋細(xì)胞百分率均值（13.70%）和 PBS對照組（10.57%）差異無統(tǒng)計學(xué)意義（t＝0.847，P＝0.445）。

3.血清細(xì)胞因子（IFN－γ、IL－4）檢測：（1）血清IFN－γ水平檢測：每只小鼠血樣設(shè)復(fù)孔，求其重復(fù)的兩孔均值（表2）。結(jié)核DNA疫苗免疫組IFN－γ水平 ［（129.6±159.0）pg/ml］高 于 PBS 對 照 組［（76.5±21.5）pg/ml］，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（t＝－1.047，P＝0.309）。（2）血清IL－4水平檢測：每只小鼠血樣設(shè)復(fù)孔，求其重復(fù)的兩孔均值（表3）。結(jié)核DNA 疫苗免疫組IL－4水平［（146.2±34.3）pg/ml］低于PBS對照組（177.7±28.1），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t＝2.244，P＝0.038）。（3）血清抗體檢測：將各組免疫前后血清中特異性抗Ag85A抗體通過ELISA檢測吸光度值，并用Excel軟件制圖（圖1），從圖中可以看出A 值均小于0.2，免疫前后、免疫組與對照組抗體水平從免疫學(xué)角度講均無免疫學(xué)意義。

表1 不同編號小鼠在兩組中采用讀板機對ELISPOT讀取的斑點數(shù)（個）

表2 PBS對照組和結(jié)核DNA疫苗免疫組IFN－γ水平的檢測結(jié)果（pg/ml）

表3 PBS對照組和結(jié)核DNA疫苗免疫組IL－4水平檢測結(jié)果（pg/ml）

圖1 小鼠血清特異性抗體檢測結(jié)果

討 論

對于新型疫苗的評價，一般是從兩個方面進(jìn)行的［4－5］，一個是免疫學(xué)指標(biāo)的變化，包括抗體水平的變化，免疫細(xì)胞水平的變化等；另一個是流行病學(xué)指標(biāo)，即現(xiàn)場調(diào)查，包括新型疫苗對發(fā)病率、病死率的影響，發(fā)病后癥狀減輕的程度等。本實驗旨在對武漢生物制品研究所研制的結(jié)核核酸疫苗進(jìn)行初步效果評價，所以只觀察疫苗對正常動物免疫學(xué)指標(biāo)的影響。機體的抗結(jié)核病免疫反應(yīng)是個非常復(fù)雜的過程，到目前為止對其確切機制仍然不甚明了［6］。因此，在疫苗評價時，缺乏公認(rèn)的免疫學(xué)指標(biāo)。但是，一般認(rèn)為，結(jié)核病免疫機制主要是T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫［7］，包括CD4＋T細(xì)胞和CD8＋T細(xì)胞的效應(yīng)，筆者采用流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)核核酸疫苗對外周免疫器官（脾）T細(xì)胞亞群的影響。CD4＋Th1細(xì)胞介導(dǎo)的，以巨噬細(xì)胞為效應(yīng)細(xì)胞的細(xì)胞免疫在抗結(jié)核免疫中處于中心地位［8－9］，CD4＋Th1通過釋放IFN－γ等細(xì)胞因子活化巨噬細(xì)胞進(jìn)而清除細(xì)胞內(nèi)外的Mtb；雖然CD4＋Th2通過產(chǎn)生IL－4等細(xì)胞因子促進(jìn)B細(xì)胞的增殖分化，產(chǎn)生針對Mtb抗原的抗體，但是這些抗體在機體的抗結(jié)核免疫中無保護作用［10］。所以，筆者以動物外周血和外周免疫器官（脾）中IFN－γ水平的變化間接監(jiān)測CD4＋T細(xì)胞是否向Th1分化，以外周血中IL－4水平變化間接監(jiān)測CD4＋T細(xì)胞是否向Th2分化，進(jìn)而明確疫苗免疫后動物體免疫應(yīng)答的方向。從流式細(xì)胞術(shù)檢測的結(jié)果可以看到，結(jié)核DNA疫苗免疫組CD4＋細(xì)胞百分率高于陰性對照組（P＜0.05），而CD8＋細(xì)胞百分率差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），說明結(jié)核DNA疫苗主要引起Th1細(xì)胞的效應(yīng)。誘導(dǎo)CD4＋Th1細(xì)胞反應(yīng)，可以加強巨噬細(xì)胞對Mtb的殺傷作用，但進(jìn)一步驗證需要在有資質(zhì)的生物安全三級實驗室進(jìn)行豚鼠動物模型攻毒實驗。從ELISA檢測結(jié)果可知，在結(jié)核DNA疫苗免疫組免疫前后外周血抗Ag85A抗體水平?jīng)]有明顯變化。Ag85蛋白能夠誘導(dǎo)機體產(chǎn)生較強的T細(xì)胞增殖和刺激機體產(chǎn)生大量的INF－γ［12］，用 Ag85免疫的小鼠能夠抵抗 Mtb的攻擊，在感染過Mtb的人的血清中也可以測到含量較高的Ag85的抗體［13］，但是，本實驗從Ag85抗體的結(jié)果來看，沒有刺激產(chǎn)生抗體，可能是免疫程序和采血時間差異造成的；究竟多少劑量和怎樣的免疫程序能到達(dá)最好的效果，有待于在以后的試驗中進(jìn)一步進(jìn)行摸索。

［1］Kozak M.At least six nucleotide preceding the AUG initiator codon enhance translation in mammalian cells.J Mol Biol，1987，196（4）：947－950.

［2］Suarez DL，Schultz－Cherry S.The effect of eukaryotic expression vectors and adjuvant on DNA vaccines in chickens using an avian influenza model.Avian Dis，2000，44（4）：861－868.

［3］Frelin L，Ahlén G，Alheim M，et al.Codon optimization and m RNA amplification effectively enhances the immunogenicity of the hepatitis C virus nonstructural 3/4A gene.Gene Ther，2004，11（6）：522－533.

［4］劉國霞，姜宇，張斌，等.動物核酸疫苗的研究進(jìn)展.動物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2005，26（9）：34－36.

［5］Iwasaki A，Medzhitov R.Toll like receptor control of the adaptive immune responses.Nat Immunol，2004，5（10）：987－995.

［6］McNeela EA，Jabbal－Gill I，Illum L，et a1.Intranasal immunization with genetically detoxified diphtheria toxin induces T cell responses in humans：enhancement of Th2 responses and toxin－neutralizing antibodies by formulation with chitosan.Vaccine，2004，22（8）：909－914.

［7］孫樹漢.核酸疫苗及其在疾病免疫防治中的應(yīng)用.第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報，2000，21（6）：28－30.

［8］Gallichan WS，Rosenthal KL.Long－term immunity and protection against herpes simplex virus type 2 in the murine female genital tract after mucosal but not systemic immunization.J Infect Dis，1998，177（5）：1155－1161.

［9］McCluskie MJ，Brazolot Millan CL，Gramzinski RA，et a1.Route and method of delivery of DNA vaccine influence immune responses in mice and non－h(huán)uman primates.Mol Med，1999，5（5）：287－300.

［10］Wang R，Doolan DL，Le TP，et al.Induction of antigen－specific cytotoxic T lymphocytes in humans by a malaria DNA vaccine.Science，1998，282（5388）：476－480.

［11］Brosch R，Gordon SV，Marmiesse M，et a1.A new evolutionary scenario for the Mycobacterium tuberculosis complex.Proc Natl Acad Sci U S A，2002，99（6）：3684－3689.