趙愛(ài)華 李鳳祥 寇麗杰 李長(zhǎng)貴 喬來(lái)艷 王鵬 陳保文 徐苗 都偉欣沈小兵 蘇城 盧錦標(biāo) 楊蕾 王國(guó)治
目前,人用疫苗應(yīng)用最廣泛、最安全的佐劑為鋁佐劑,鋁佐劑誘導(dǎo)強(qiáng)烈體液免疫反應(yīng),對(duì)細(xì)胞免疫作用則不明顯[1]。近年來(lái)新型疫苗研究中采用的重組蛋白抗原或亞單位抗原一般由于相對(duì)分子質(zhì)量小、體內(nèi)滯留時(shí)間短等原因,免疫原性弱,必須與佐劑聯(lián)用才有效,但傳統(tǒng)的鋁佐劑由于其本身固有的局限性,尤其針對(duì)細(xì)胞免疫為主的疫苗,因此人們一直致力于新型佐劑的研究,如乳化劑MF59佐劑、免疫刺激劑CpG佐劑、細(xì)胞因子白細(xì)胞介素-12(interleukin-12,IL-12)等。鑒于單一佐劑疫苗作用的局限性,聯(lián)合作用機(jī)制不同的幾種佐劑,發(fā)揮疫苗的免疫保護(hù)作用,即使用復(fù)合佐劑成為疫苗研究的新形式[2-4],如將遞送系統(tǒng)與免疫刺激型佐劑聯(lián)合使用,不同Toll樣受體(Toll-like receptor,TLR)激動(dòng)劑的聯(lián)用等,GSK公司的佐劑系統(tǒng)(adjuvant system,AS)系列即為佐劑聯(lián)合使用,其中AS15中的佐劑種類已達(dá)4種[5-7]。
卡介菌(BCG)Cp G復(fù)合佐劑(combination adjuvants)-02系統(tǒng)(BC-C02)由生物佐劑、無(wú)機(jī)鹽佐劑及磷酸緩沖體系組成,其中的生物佐劑為從卡介菌中提取的含未甲基化CpG基序含量達(dá)到15.75%~24.75%的天然Cp G DNA[8],相對(duì)分子質(zhì)量范圍在(1950~9750)×103之間,相對(duì)分子質(zhì)量主要集中在6500×103。鋁鹽佐劑為氫氧化鋁或其他無(wú)機(jī)鹽。由于生物佐劑富含免疫刺激成分Cp G基序,因此將其與鋁鹽及磷酸緩沖體系組成的復(fù)合佐劑系統(tǒng)命名為BC-C02,系統(tǒng)可控p H 范圍為6.6~7.4,滲透壓摩爾濃度在215~345 m Osmol/kg之間。
因此,本研究通過(guò)相關(guān)體內(nèi)、體外試驗(yàn),檢測(cè)細(xì)胞表面標(biāo)志、細(xì)胞因子水平、抗體水平及疫苗保護(hù)效力及過(guò)敏毒性等,對(duì)復(fù)合佐劑系統(tǒng)BC-C02的有效性及安全性進(jìn)行評(píng)價(jià),為復(fù)合佐劑系統(tǒng)BC-C02作為一種新型疫苗佐劑候選佐劑的應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)室研究基礎(chǔ)。
1.材料:BC-C02佐劑系統(tǒng),重組Ag85B蛋白,甲型H1N1流感滅活抗原、BCG疫苗、Mtb H37Rv由中國(guó)食品藥品檢定研究院提供。合成Cp G DNACp G7909由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。Ag85B240-260(FQDA YNA AGG HNA VFN FPP NG)多肽由上海強(qiáng)耀生物科技有限公司合成。流感病毒A/California/07/2009株由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所提供。
2.主要試劑:γ干擾素(IFN-γ)酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)檢測(cè)(enzyme-linked immunospot assay,ELISPOT)檢測(cè)試 劑 盒、IL-12 ELISPOT 檢 測(cè) 試 劑 盒 (瑞 典Mabtech公司生產(chǎn)),PerCP/Cy5.5-抗鼠CD19+、抗鼠TLR-9-FITC、抗鼠F4/80-APC、Per CP-抗鼠I-A/I-E、PE-抗鼠IL-12(美國(guó) Biolegend公司生產(chǎn)),小鼠淋巴細(xì)胞分離液,人淋巴細(xì)胞分離液(中國(guó)達(dá)科為公司生產(chǎn))。
3.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:無(wú)特定病原體(specific pathogen free,SPF)級(jí) C57BL/6小鼠和 BALB/C 小鼠,雌性,6~8周;SPF級(jí)豚鼠,250~350 g/只,同性,均由中國(guó)食品藥品檢定研究院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。
甲型H1N1疫苗免疫:BALB/C小鼠分為7組,每組20只,分別為磷酸鹽緩沖液(PBS)組、H1N1低劑量組、H1N1低劑量+CpG DNA組、H1N1中劑量組、H1N1中劑量+Cp G DNA組、H1N1高劑量組、H1N1高劑量+CpG DNA 組;200μl/只動(dòng)物,頭背部皮下免疫1次;分別于接種后第5、7、14、28天采靜脈血,分離血清,待測(cè)抗體水平及抗體亞類;H1N1抗原低、中、高劑量分別為0.2μg/只、1.0μg/只、5.0μg/只。
結(jié)核重組Ag85B疫苗免疫:C57BL/6小鼠分為6組,每組4只,分別為PBS組、Ag85B組、Ag85B+Al組、Ag85B+Cp G DNA組、Ag85B+BC-C02組及皮內(nèi)注射用BCG組。分別于0、14、28 d頭背部皮下免疫3次,100μl/只,劑量為Ag85B抗原5μg,BCG劑量為0.01 mg。
1.小鼠脾單個(gè)核細(xì)胞、小鼠腹腔巨噬細(xì)胞、人外周血單個(gè)核細(xì)胞制備:小鼠淋巴細(xì)胞分離液制備脾單個(gè)核細(xì)胞,小鼠腹腔注射1 ml 4%可溶性淀粉肉湯,3 d后收集腹腔滲出巨噬細(xì)胞,人淋巴細(xì)胞分離液制備健康人外周血單個(gè)核細(xì)胞。收集的細(xì)胞以5%胎牛血清(FBS)-1640完全培養(yǎng)基重懸,根據(jù)需要調(diào)整細(xì)胞濃度。
2.流式細(xì)胞檢測(cè):細(xì)胞體外經(jīng)Cp G DNA刺激后,使用胞外抗鼠CD19+-Per CP/Cy5.5,抗鼠F4/80-APC、抗鼠I-A/I-E-PerCP對(duì)B細(xì)胞及巨噬細(xì)胞表面分子進(jìn)行染色。使用抗鼠 CD19+-Per CP/Cy5.5,抗鼠TLR-9-FITC,對(duì)B細(xì)胞內(nèi)TLR-9表達(dá)進(jìn)行檢測(cè),使用 抗鼠F4/80-APC染色,抗鼠TLR-9-FITC,抗鼠IL-12-PE 對(duì)巨噬細(xì)胞內(nèi) TLR-9、IL-12表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)。流式細(xì)胞儀Guava esay cyte 8HT及分析軟件為美國(guó)Millipore公司產(chǎn)品。
3.ELISPOT檢測(cè)分泌IL-12的細(xì)胞數(shù):健康人外周血單個(gè)核細(xì)胞加入到檢測(cè)IL-12的ELISPOT細(xì)胞培養(yǎng)板中,體外經(jīng)Cp G DNA刺激40 h后,按ELISPOT試劑盒說(shuō)明書操作,檢測(cè)分泌IL-12細(xì)胞數(shù),ELISPOT儀為美國(guó)Cellular Technology公司產(chǎn)品。
4.甲型H1N1流感病毒血凝抑制(HI)抗體及抗體亞類檢測(cè)[9]:取50μl滅活血清,從1∶10開(kāi)始進(jìn)行2倍系列稀釋,以血凝抑制法檢測(cè)血清中HI抗體滴度,HI抗體滴度≥40認(rèn)為血清陽(yáng)轉(zhuǎn)。ELISA法檢測(cè)血清中抗原特異性IgG1、IgG2a水平??贵w滴度以A450值高于陰性對(duì)照血清2.1倍的最高血清稀釋倍數(shù)表示。
5.H1N1疫苗保護(hù)力評(píng)價(jià):BALB/C小鼠免疫后18 d,以 流感病毒A/California/07/2009株50μl(106TCID50)攻擊動(dòng)物,觀察14 d,記錄小鼠存活情況,計(jì)算動(dòng)物的存活天數(shù)及存活率。
6.Ag85B特異性IFN-γ分泌細(xì)胞數(shù)檢測(cè):制備免疫后小鼠脾臟制備脾淋巴細(xì)胞懸液,調(diào)整細(xì)胞濃度另加Ag85B240-260多肽和重組Ag85B蛋白,體外刺激40 h后,按ELISPOT試劑盒說(shuō)明書操作,檢測(cè)抗原特異性IFN-γ分泌細(xì)胞數(shù)(SFC)。
7.Ag85B復(fù)合佐劑結(jié)核疫苗保護(hù)力評(píng)價(jià):對(duì)潛伏感染Mtb H37Rv的豚鼠,分別給予Ag85B復(fù)合佐劑疫苗治療,以生理鹽水(NS)作為對(duì)照,治療結(jié)束后觀察動(dòng)物肝、脾、肺病變情況,比較陰轉(zhuǎn)率及臟器病變指數(shù)。
8.過(guò)敏毒性檢測(cè):小鼠、豚鼠腹腔給予佐劑,檢測(cè)小鼠Ig E水平及豚鼠全身超敏反應(yīng)情況,對(duì)豚鼠全身超敏反應(yīng)結(jié)果觀察和判斷。各組在被攻擊后直至被攻擊后1 h內(nèi),密切觀察豚鼠有無(wú)抓鼻、豎毛、呼吸困難、痙攣、休克甚至死亡等超敏癥狀,并根據(jù)反應(yīng)情況分級(jí)(0級(jí):無(wú)明顯反應(yīng);1級(jí):只有輕微抓鼻、顫抖或豎毛;2級(jí):有幾次咳嗽,有抓鼻、顫抖或豎毛;3級(jí):多次或連續(xù)的咳嗽,伴有呼吸困難或痙攣、抽搐等;4級(jí):痙攣、抽搐、大小便失禁、休克、死亡)。
9.數(shù)據(jù)分析:實(shí)驗(yàn)結(jié)果的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析均采用Minitab 15.0統(tǒng)計(jì)軟件處理,兩組間的比較采用成組t檢驗(yàn),P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
1.Cp G DNA刺激B細(xì)胞增殖,提高B細(xì)胞內(nèi)TLR-9表達(dá):Cp G DNA與脾細(xì)胞體外共培養(yǎng),流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD19+B細(xì)胞比例及CD19+TLR-9+B細(xì)胞比例,結(jié)果見(jiàn)圖1a。由圖1a可見(jiàn),Cp G DNA組淋巴細(xì)胞中CD19+細(xì)胞比例高于培養(yǎng)基對(duì)照組(NCS),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-4.40,P<0.05)。同時(shí)CD19+TLR-9+B細(xì)胞比例也顯著高于NCS對(duì)照組(見(jiàn)圖1b),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-5.92,P<0.05)。說(shuō)明天然CpG DNA能直接刺激B細(xì)胞增殖,并提高B細(xì)胞內(nèi)TLR-9的表達(dá),和Cp G 7909的作用類似。
2.Cp G DNA上調(diào)巨噬細(xì)胞主要組織相容性復(fù)合體(MHC)-Ⅱ類分子,提高巨噬細(xì)胞內(nèi)IL-12、TLR-9表達(dá):Cp G DNA與巨噬細(xì)胞體外共培養(yǎng),流式細(xì)胞儀檢測(cè)巨噬細(xì)胞表面MHC-Ⅱ類分子及細(xì)胞內(nèi)IL-12與TLR-9的表達(dá)情況見(jiàn)圖1c。由圖1c可見(jiàn),Cp G DNA組F4/80+I(xiàn)-A/I-E+雙陽(yáng)性細(xì)胞比例高于NCS對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-4.32,P<0.05),說(shuō)明Cp G DNA能上調(diào)巨噬細(xì)胞表面MHC-Ⅱ分子表達(dá)。CpG DNA 組F4/80+TLR-9+雙陽(yáng)性細(xì)胞比例高于NCS對(duì)照組(圖1d),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-6.59,P<0.05),說(shuō)明Cp G DNA能提高巨噬細(xì)胞內(nèi)TLR-9表達(dá)。F4/80+I(xiàn)L-12+雙陽(yáng)性細(xì)胞比例高于NCS對(duì)照組(圖1e),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=5.88,P<0.05),說(shuō)明Cp G DNA能促進(jìn)巨 噬 細(xì) 胞 分 泌 IL-12。CpG DNA 組 F4/80+TLR-9+I(xiàn)L-12+三陽(yáng)性細(xì)胞比例高于 NCS對(duì)照組(圖1f),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=4.80,P<0.05)。Cp G DNA對(duì)巨噬細(xì)胞作用與Cp G 7909的作用類似。
3.Cp G DNA促進(jìn)IL-12的分泌:Cp G DNA 促進(jìn)人外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)IL-12的分泌(圖1g)。由圖1g可見(jiàn),PBMC經(jīng)Cp G DNA刺激后,IL-12斑點(diǎn)形成細(xì)胞數(shù)量隨CpG DNA濃度升高而增加。低、中、高3個(gè)劑量CpG DNA組分泌IL-12的細(xì)胞數(shù)與NCS比較,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,P值均<0.05(tl=3.697,tm=3.124,th=4.829,tLPS=5.147)。
4.Cp G DNA對(duì)H1N1抗體的影響:Cp G DNA對(duì)H1N1 HI抗體影響結(jié)果見(jiàn)圖2a、b。由圖2a、b可見(jiàn),免疫后5 d,復(fù)合Cp G DNA低、中、高(l、m、h)3個(gè)劑量組均檢測(cè)出HI抗體,其中高劑量抗原復(fù)合Cp G DNA組動(dòng)物血清全部陽(yáng)轉(zhuǎn),HI抗體滴度均達(dá)到40。免疫后7 d,佐劑組的動(dòng)物血清全部陽(yáng)轉(zhuǎn),對(duì)應(yīng)的單純抗原組動(dòng)物未全部陽(yáng)轉(zhuǎn)。免疫后14 d,復(fù)合佐劑組血清HI抗體滴度均為單純抗原組2~3倍,低劑量抗原復(fù)合佐劑組抗體滴度為單純中劑量抗原組(1.0μg)的2倍,接近單純高劑量抗原組(5.0μg)水平。免疫后28 d,Cp G DNA的佐劑效果在中、高劑量組表現(xiàn)較為明顯,主要表現(xiàn)為HI抗體滴度提高。Cp G DNA對(duì)H1N1抗體亞類影響結(jié)果見(jiàn)圖2c,由圖2c可見(jiàn),免疫后28 d,低、中、高3個(gè)抗原劑量組復(fù)合CpG DNA后,抗原特異性IgG1水平與單純抗原組差異不大,差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t低=0.00,t中=0.87,t高=1.00,P 值均>0.05),而抗原特異性IgG2a水平均高于單純抗原組,其中低、高劑量組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t低=-2.82,t高=-4.59,P值均<0.05)。
5.Cp G DNA提高H1N1疫苗保護(hù)效力:Cp G DNA對(duì)H1N1疫苗保護(hù)效力的影響結(jié)果見(jiàn)圖2d。由圖2d可見(jiàn),與PBS對(duì)照組比較,低劑量抗原組經(jīng)病毒攻擊后,動(dòng)物存活率提高了20%,存活時(shí)間延長(zhǎng)了1.9 d。低劑量抗原復(fù)合CpG DNA組較PBS組存活率提高了60%,存活時(shí)間延長(zhǎng)了5.0 d,比單純抗原組存活率提高了40%,存活時(shí)間延長(zhǎng)了3.1 d。而高劑量組及高劑量復(fù)合Cp G DNA組動(dòng)物存活率為100%。低量抗原組動(dòng)物存活率及存活時(shí)間較高量抗原組分別低50%及縮短3.9 d,而復(fù)合Cp G DNA的低量抗原組存活率較高量抗原組的僅低10%,存活時(shí)間僅短0.8 d。說(shuō)明Cp G DNA提高了H1N1疫苗的保護(hù)效力。
圖1 CpG DNA對(duì)淋巴細(xì)胞的免疫刺激作用
圖2 CpG DNA對(duì)H1NI疫苗的免疫佐劑作用
6.BC-C02提高分泌抗原特異性IFN-γ 細(xì)胞數(shù):通過(guò)檢測(cè)分泌抗原特異性IFN-γ細(xì)胞數(shù)來(lái)評(píng)價(jià)疫苗誘導(dǎo)細(xì)胞免疫的能力,結(jié)果見(jiàn)圖3a。結(jié)果分別為致敏細(xì)胞體外經(jīng)合成多肽Ag85B240-260,重組蛋白Ag85B刺激結(jié)果,由圖3a可見(jiàn),無(wú)論是合成多肽Ag85B240-260,或是蛋白 Ag85B刺激,只有以 BC-C02為佐劑的疫苗組與BCG有相似的免疫結(jié)果,顯著提高了分泌抗原特異性IFN-γ細(xì)胞數(shù)量(多肽刺激Ag+BC-C02組與 Ag組比較,t=-6.37,P<0.05;蛋白刺激Ag+BC-C02組與Ag組比較,t=-3.49,P<0.05),而且BC-C02為佐劑的疫苗組細(xì)胞數(shù)量高于BCG組,但兩者之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(多肽刺激組 Ag+ BC-C02與 BCG組比較,t=-1.36,P>0.05,抗原刺激組 Ag+ BC-C02與BCG組比較,t=0.7,P>0.05)。
圖3 復(fù)合佐劑BC-C02免疫佐劑作用
7.Ag85B-BC-C02結(jié)核疫苗保護(hù)力評(píng)價(jià)結(jié)果:Mtb潛伏感染動(dòng)物經(jīng)疫苗治療后,臟器結(jié)核病變完全轉(zhuǎn)陰的動(dòng)物達(dá)到30%(對(duì)照組動(dòng)物100%病變),而且病變指數(shù)<30的動(dòng)物達(dá)到60%~70%,平均病變指數(shù)與NS組比較均降低(圖3b),中劑量疫苗組和NS對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=2.20,P<0.05),低、高劑量疫苗組與對(duì)照組比較,平均病變指數(shù)降低,但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,P值分別為0.077及0.061(t低=1.88,t高=2.01)。
8.免疫毒理結(jié)果:Cp G DNA對(duì)小鼠的免疫毒理結(jié)果見(jiàn)圖4。由圖4可見(jiàn),Cp G 200μg腹腔給予小鼠,隔日1次,共3次,免疫后18 d,檢測(cè)血清中IgE水平,Cp G DNA組與陰性對(duì)照NS組比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-1.46,P>0.05),陽(yáng)性對(duì)照組(OVA鋁復(fù)合物)血清中IgE水平均顯著高于陰性對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-8.19,P<0.001)。同時(shí)陽(yáng)性對(duì)照組動(dòng)物給予Cp G DNA治療后,其血清中IgE水平較陽(yáng)性對(duì)照組顯著性降低(t=-6.58,P<0.001),說(shuō)明Cp G DNA 的治療不會(huì)引起過(guò)敏毒性,并且可以逆轉(zhuǎn)超敏反應(yīng)程度。
圖4 CpG DNA致敏動(dòng)物后,不會(huì)引起動(dòng)物血清IgE水平提高
結(jié)核復(fù)合佐劑疫苗的免疫毒理結(jié)果見(jiàn)表1。由表1可見(jiàn),牛血清白蛋白(BSA)陽(yáng)性對(duì)照組豚鼠在被攻擊后6只動(dòng)物均出現(xiàn)典型超敏癥狀并死亡;復(fù)合疫苗組和陰性對(duì)照組豚鼠被攻擊后,均未出現(xiàn)任何異常反應(yīng),說(shuō)明Ag-BC-C02復(fù)合疫苗不會(huì)引起全身超敏反應(yīng)。
表1 豚鼠全身過(guò)敏反應(yīng)結(jié)果(各組均為6只)
眾所周知,原核生物DNA由于富含未甲基化Cp G基序而具有免疫刺激功能,為了模擬原核生物DNA免疫刺激功能,人們合成了含未甲基化Cp G基序寡核苷酸小片段(20~30個(gè)堿基),即Cp G ODN。Cp G ODN是目前研究較多的新佐劑,既能刺激細(xì)胞免疫,也能刺激體液免疫。但由于其片段較小,只模擬了原核生物DNA的部分免疫刺激功能;又由于片段小,在機(jī)體內(nèi)容易降解,為了增加穩(wěn)定性,一般進(jìn)行硫代修飾,而非天然堿基的加入,增加了其對(duì)機(jī)體作用的復(fù)雜性。與此同時(shí),對(duì)天然Cp G DNA的免疫佐劑作用研究則相對(duì)較少。
本研究中的生物佐劑,即為從卡介菌中提取的天然Cp G,前期研究將其作為佐劑用于各種疫苗中,結(jié)果顯示生物佐劑安全、有效并且和鋁佐劑有明顯的協(xié)同作用[10-15],而廣為應(yīng)用的鋁鹽佐劑的安全性及有效性則不言而喻。將這2種安全有效的佐劑,輔以磷酸緩沖液體系,制成一種復(fù)合佐劑系統(tǒng)——BC-C02,旨在發(fā)揮2種佐劑的協(xié)同作用,從而促進(jìn)疫苗誘導(dǎo)有效的免疫保護(hù)反應(yīng)。
結(jié)果顯示:BC-C02中生物佐劑CpG DNA能直接刺激B細(xì)胞增殖,提高B細(xì)胞內(nèi)TLR-9表達(dá),上調(diào)巨噬細(xì)胞表面 MHC-Ⅱ類分子表達(dá),促進(jìn)TLR-9和IL-12的分泌,其免疫刺激作用與Cp G 7909作用相似。說(shuō)明生物佐劑Cp G DNA是一種TLR-9激動(dòng)劑,而B(niǎo)細(xì)胞與巨噬細(xì)胞又是體內(nèi)重要的抗原呈遞細(xì)胞;Cp G DNA提高B細(xì)胞與巨噬細(xì)胞內(nèi)TLR-9表達(dá),說(shuō)明Cp G DNA靶向抗原呈遞細(xì)胞,通過(guò)與APC細(xì)胞的TLR-9受體識(shí)別,而影響APC細(xì)胞功能。同時(shí)Cp G DNA上調(diào)巨噬細(xì)胞表面MHC-Ⅱ類分子表達(dá),MHC-Ⅱ類分子主要功能為識(shí)別與呈遞外源性抗原肽,說(shuō)明Cp G DNA可能提高APC細(xì)胞的呈遞功能而影響后續(xù)的免疫反應(yīng)。Cp G DNA能夠促進(jìn)IL-12分泌,而IL-12有促進(jìn)初始的CD4+T細(xì)胞分化成Th1細(xì)胞的功能,同時(shí)IL-12也是重要的抗病毒細(xì)胞因子之一,并且能增強(qiáng)激活的NK細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞裂解靶細(xì)胞的功能。Cp G DNA不僅能刺激小鼠細(xì)胞分泌IL-12,同時(shí)也能顯著性刺激人外周血細(xì)胞分泌IL-12,說(shuō)明Cp G DNA對(duì)動(dòng)物和人的免疫刺激作用相似,不存在種屬差異。以上結(jié)果表明,BC-C02中生物佐劑為一種TLR-9激動(dòng)劑,能刺激機(jī)體的固有免疫,具有免疫刺激功能。
將BC-C02中生物佐劑Cp G DNA與流感滅活抗原H1N1復(fù)合,結(jié)果顯示生物佐劑能促進(jìn)抗體的提前產(chǎn)生,提高抗體尤其是IgG2a的水平,并能提高動(dòng)物對(duì)抗病毒感染能力。該結(jié)果表明生物佐劑Cp G DNA本身具有免疫佐劑功能。
鋁鹽通過(guò)緩釋抗原起到佐劑作用,Cp G DNA本身固有的免疫刺激及免疫佐劑功能,為其與鋁佐劑的協(xié)同作用提供了理論基礎(chǔ)。
將BC-C02應(yīng)用于重組蛋白Ag85B結(jié)核疫苗中的結(jié)果顯示,只有復(fù)合佐劑疫苗組與BCG組致敏細(xì)胞。體外經(jīng)抗原刺激后,分泌的抗原特異性IFN-γ的細(xì)胞數(shù)量較多,并且顯著高于抗原及單獨(dú)佐劑疫苗組,且BC-C02疫苗組略高于BCG組。BCG是目前預(yù)防結(jié)核病的惟一疫苗,其通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞免疫而預(yù)防Mtb感染;BC-C02疫苗組與BCG組有相似的免疫效果,說(shuō)明BC-C02作為疫苗佐劑,能促進(jìn)疫苗誘導(dǎo)有效的細(xì)胞免疫反應(yīng),而鋁鹽佐劑對(duì)細(xì)胞免疫功能不明顯。因此,復(fù)合佐劑是由鋁鹽與Cp G DNA協(xié)同作用而發(fā)揮作用的。對(duì)Mtb潛伏感染的動(dòng)物進(jìn)行治療,結(jié)果顯示,BC-C02疫苗組動(dòng)物臟器結(jié)核病變的陰轉(zhuǎn)率提高,臟器病變程度減輕,平均病變指數(shù)均低于生理鹽水對(duì)照組,說(shuō)明BC-C02佐劑能提高疫苗的保護(hù)效力,而鋁鹽佐劑疫苗對(duì)臟器病變程度影響不大[14]。因此,復(fù)合佐劑是由鋁鹽與Cp G DNA協(xié)同作用而發(fā)揮作用的。
由于生物佐劑Cp G DNA本身具有免疫刺激作用,分別對(duì)其及BC-C02進(jìn)行免疫毒理評(píng)價(jià),結(jié)果顯示生物佐劑Cp G DNA本身及復(fù)合佐劑BC-C02均不會(huì)導(dǎo)致全身超敏反應(yīng),而且CpG DNA有降低超敏反應(yīng)程度的作用。
總之,本研究介紹的“BC-C02”系統(tǒng),其2種主要成分均為有效的免疫佐劑,其中生物佐劑Cp G DNA既能刺激細(xì)胞免疫,也能刺激體液免疫,對(duì)細(xì)菌、病毒及寄生蟲類抗原均有免疫佐劑作用[10-15];試驗(yàn)研究表明其對(duì)動(dòng)物無(wú)毒副作用[16-18];同時(shí)作為卡介菌多糖核酸注射液的成分之一,其安全性也得到了有效的驗(yàn)證??ń榫嗵呛怂嶙⑸湟菏俏覈?guó)自主研發(fā)的免疫調(diào)節(jié)劑[19],在我國(guó)應(yīng)用已達(dá)約5億人次,未發(fā)現(xiàn)嚴(yán)重不良反應(yīng)。而鋁鹽作為目前人用疫苗應(yīng)用最廣的佐劑,其安全性及有效性則不言而喻。因此,本研究為BC-C02應(yīng)用于新疫苗研究提供了安全、有效的基礎(chǔ)依據(jù)。
[1]Gupta RK.Aluminum compounds as vaccine adjuvants.Adv Drug Deliv Rev,1998,32(3):155-172.
[2]Holten-Andersen L,Doherty TM,Korsholm KS,et al.Combination of the cationic surfactant dimethyl dioctadecyl ammonium bromide and synthetic mycobacterial cord factor as an efficient adjuvant for tuberculosis subunit vaccines.Infect Immun,2004,72(3):1608-1617.
[3]Agger EM,Rosenkrands I,Olsen AW,et al.Protective immunity to tuberculosis with Ag85B-ESAT-6 in a synthetic cationic adjuvant system IC31. Vaccine,2006,24 (26):5452-5460.
[4]Eastcott JW,Holmberg CJ,Dewhirst FE,et al.Oligonucleotide containing CpG motifs enhances immune response to mucosally or systemically administered tetanus toxoid.Vaccine,2001,19(13/14):1636-1642.
[5]Didierlaurent AM,Morel S,Lockman L,et al.AS04,an aluminum salt-and TLR4 agonist-based adjuvant system,induces a transient localized innate immune response leading to enhanced adaptive immunity.J Immunol,2009,183(10):6186-6197.
[6]Garcon N,Chomez P,Van Mechelen M.GlaxoSmith Kline adjuvant systems in vaccines:concepts,achievements and perspectives.Expert Rev Vaccines,2007,6(5):723-739.
[7]Cluff CW.Monophosphoryl lipid A(MPL)as an adjuvant for anti-cancer vaccines:clinical results.Adv Exp Med Biol,2010,667:111-123.
[8]王國(guó)治,趙愛(ài)華,賈淑珍,等.一種免疫佐劑和含有該佐劑的疫苗.中國(guó)專利:CN1623603.2005-06-08.
[9]Babai I,Samira S,Barenholz Y,et al.A novel infuenza subunit vaccine composed of liposome-encapsulated haemagglutinin/neuraminidase and IL-2 or GM-CSF.Ⅱ.Induction of Th1 and Th2 responses in mice.Vaccine,1999,17 (9/10):1239-1250.
[10]趙愛(ài)華,喬來(lái)艷,賈淑珍,等.BCG-Cp G-DNA對(duì)重組 HBs Ag的免疫佐劑作用.中國(guó)生物制品學(xué)雜志,2007,20(5):356-358.
[11]李鳳祥,趙愛(ài)華,張潔,等.BCG-CpG-DNA對(duì)重組 HBs Ag免疫原性的影響.微生物免疫學(xué)進(jìn)展,2008,36(3):10-14.
[12]趙愛(ài)華,李鳳祥,賈淑珍,等.BCG-CpG-DNA對(duì)A群腦膜炎球菌多糖疫苗的佐劑作用.中國(guó)醫(yī)藥生物技術(shù),2010,5(2):94-97.
[13]陳磊,徐苗,都偉欣,等.結(jié)核分枝桿菌 H37Rv兩種抗原Ag85B、Hsp X的制備及其與佐劑的聯(lián)合應(yīng)用.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院學(xué)報(bào),2009,31,(4):403-409.
[14]Chen L,Xu M,Wang ZY,et al.The development and preliminary evaluation of a new Mycobacterium tuberculosis vaccine comprising Ag85B,Hsp X and CFP-10:ESAT-6 fusion protein with CpG DNA and aluminum hydroxide adjuvants.FEMS Immunol Med Microbiol,2010,59(1):42-52.
[15]張影,楊英超,張瑾,等.STAg與BCG-DNA和氫氧化鋁佐劑聯(lián)合免疫小鼠的免疫效果.中國(guó)生物制品學(xué)雜志,2011,24(10):1177-1179.
[16]趙愛(ài)華,喬來(lái)艷,賈淑珍,等.BCG-CpG-DNA一般毒性的初步評(píng)價(jià).中國(guó)生物制品學(xué)雜志,2010,23(8):797-802.
[17]鄭亮,趙愛(ài)華,王雯,等.BCG-CpG-DNA重復(fù)給藥對(duì)小鼠免疫毒性的初步評(píng)價(jià).中國(guó)生物制品學(xué)雜志,2010,23(9):922-925.
[18]蔡皇界,趙愛(ài)華,王雯,等.BCG-CpG-DNA重復(fù)給藥對(duì)家兔的安全性評(píng)價(jià).中國(guó)藥事,2011,25(5):430-433.
[19]中國(guó)生物制品標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì).卡介菌多糖核酸注射液制造與檢定//中國(guó)生物制品規(guī)程.北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2000:235-239.