李瀟然

(北京理工大學(xué)微電子技術(shù)實(shí)驗(yàn)室，北京 100081)

生物芯片技術(shù)最初源于Edwin Southern提出的核酸雜交理論，即利用核酸分子中堿基配對(duì)的原則，標(biāo)記的核酸分子能夠與被固化的、與之互補(bǔ)配對(duì)的核酸分子雜交［1］。生物芯片一詞早在20世紀(jì)80年代初提出，隨著生命科學(xué)及其相關(guān)技術(shù)的迅速發(fā)展，目前已成為生命科學(xué)領(lǐng)域中有著廣泛應(yīng)用前景的高新技術(shù)，特別是人類基因組計(jì)劃 (Human Genome Project，HGP)的實(shí)施和分子生物學(xué)等相關(guān)學(xué)科的突飛猛進(jìn)，為生物芯片技術(shù)的應(yīng)用提供了廣闊空間和有利條件［2］。除了基因檢測(cè)、疾病診斷、預(yù)防醫(yī)學(xué)、新藥開(kāi)發(fā)等生命科學(xué)相關(guān)領(lǐng)域，生物芯片在司法鑒定、食品安全檢測(cè)及營(yíng)養(yǎng)成分分析、環(huán)境科學(xué)、農(nóng)林科學(xué)、軍事科學(xué)中都起著非常重要的作用［3，4］。本文重點(diǎn)對(duì)其在腫瘤研究和診斷治療中的應(yīng)用做一簡(jiǎn)要綜述。

1 生物芯片的概述

生物芯片技術(shù)是指通過(guò)微加工和微電子技術(shù)，在芯片表面構(gòu)建微型生物化學(xué)分析系統(tǒng)，對(duì)組織細(xì)胞中的蛋白質(zhì)、DNA或者其他生物組分進(jìn)行高通量檢測(cè)［5］。比如基因芯片和蛋白質(zhì)芯片分別是將大量已知序列的核酸片段或多肽片段按照預(yù)先設(shè)置的排列方式，有序地固定在厘米見(jiàn)方的片基(基質(zhì)或載體)表面，使之與帶有標(biāo)記物的核酸或蛋白質(zhì)分子發(fā)生反應(yīng)，以便檢測(cè)分析出待檢標(biāo)本中的相應(yīng)成分［6］。生物芯片的最大特點(diǎn)是高通量并行分析，借助微加工和微電子技術(shù)，將分子生物學(xué)、免疫學(xué)、化學(xué)、物理、計(jì)算機(jī)等多學(xué)科技術(shù)有機(jī)地融合，使多個(gè)單獨(dú)分散的研究過(guò)程集中在芯片上，最終快速、準(zhǔn)確、敏感、高效地完成分析［3，4］。生物芯片技術(shù)的基本原理是分子雜交，也就是利用生物分子之間特異性親和反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)對(duì)基因、配體、抗原等生物活性物質(zhì)的檢測(cè)分析［7］。

2 生物芯片的分類

生物芯片的種類繁多，目前尚無(wú)統(tǒng)一的分類方式。常用的分類方法有以下幾種：

2.1 根據(jù)用途分類

2.1.1 生物電子芯片：用于生物計(jì)算機(jī)等生物電子產(chǎn)品的制造。

2.1.2 生物分析芯片：用于核酸、蛋白質(zhì)等各種生物大分子以及細(xì)胞、組織的生物化學(xué)和分子生物學(xué)檢測(cè)。

2.2 根據(jù)作用方式分類

2.2.1 主動(dòng)式芯片：又稱為功能生物芯片，是生物芯片技術(shù)的高級(jí)階段，主要包括微流體芯片(microfluidic chip)和芯片實(shí)驗(yàn)室(lab on chip)，其主要特點(diǎn)是把生物樣本的處理、標(biāo)記、反應(yīng)及檢測(cè)等多個(gè)步驟均集中在芯片體系中，通過(guò)一步反應(yīng)就可快速、簡(jiǎn)單地完成實(shí)驗(yàn)。

2.2.2 被動(dòng)式芯片：即各種微陣列芯片，目前使用的大部分芯片均屬于此類，包括基因芯片、蛋白芯片、細(xì)胞芯片和組織芯片。其主要特點(diǎn)是通過(guò)高通量的檢測(cè)分析，獲得大量生物信息，采用生物信息學(xué)處理后，進(jìn)行數(shù)據(jù)挖掘分析，因此這類芯片又稱為信息生物芯片。

2.3 根據(jù)固定在載體上的物質(zhì)成分分類

2.3.1 基因芯片(gene chip)：又稱DNA芯片(DNA chip)或DNA微陣列(DNA microarray)，是將 cDNA或寡核苷酸按微陣列方式固定在微型載體上制成。2.3.2 蛋白質(zhì)芯片 (protein chip或 protein m icro array)：是將蛋白質(zhì)、多肽等按微陣列方式固定在微型載體上制成。

2.3.3 細(xì)胞芯片(cell chip)：是將細(xì)胞按照特定的方式固定在載體上，用來(lái)檢測(cè)細(xì)胞間相互影響或相互作用。

2.3.4 組織芯片(tissue chip，tissue microarray)：是將組織切片按照特定的方式固定在載體上，用來(lái)進(jìn)行組織內(nèi)成分差異研究。

2.3.5 其他：如芯片實(shí)驗(yàn)室(Lab on chip)，將樣品的制備、標(biāo)記、反應(yīng)和檢測(cè)分析的全過(guò)程集約化形成微型分析系統(tǒng)，是生物芯片技術(shù)發(fā)展的最終目標(biāo)。

2.4 根據(jù)支持介質(zhì)分類

用于芯片制作的載體材料有無(wú)機(jī)材料、天然有機(jī)聚合物、人工合成的有機(jī)高分子聚合物和各種高分子聚合物制成的膜，但只有玻璃片、金屬片、各種有機(jī)高分子制作的薄膜等少數(shù)幾種適于制作生物芯片，所以按照載體材料可將生物芯片分為：硅晶片芯片、玻璃芯片、塑料芯片和磁珠芯片等。

3 生物芯片在腫瘤研究方面的應(yīng)用

隨著人類老齡化進(jìn)程的不斷加劇，腫瘤的發(fā)病率日益增高，已成為危害人類健康和生命安全的殺手。據(jù)流行病學(xué)調(diào)查顯示，在我國(guó)惡性腫瘤是僅次于心腦血管疾病的死亡原因。以肺癌為例，2005年我國(guó)肺癌新發(fā)病例數(shù)為536407人，死亡病例數(shù)475768人，通過(guò)對(duì)10個(gè)登記處18年發(fā)病死亡數(shù)據(jù)分析，登記點(diǎn)肺癌發(fā)病率呈現(xiàn)逐年上升趨勢(shì)，年平均增長(zhǎng)率為1.63%［9］。據(jù)美國(guó)腫瘤研究學(xué)會(huì)的最新報(bào)道，美國(guó)的二分之一男性、三分之一女性終生都存在著罹患腫瘤的危險(xiǎn)，癌癥是85歲以下的人群中的第二位死亡因素［10］。根據(jù)世界衛(wèi)生組織2003年公布的數(shù)據(jù)，2000年全球共有惡性腫瘤患者1000萬(wàn)，其中男530萬(wàn)，女470萬(wàn)，而惡性腫瘤死亡者高達(dá)620萬(wàn)，占總死亡人數(shù)的12%，在多數(shù)發(fā)達(dá)國(guó)家可達(dá)25%［11］。腫瘤患者死亡率高的主要原因是不能早期診斷，而且惡性腫瘤所需的醫(yī)療支出十分可觀，美國(guó)2010年用于癌癥的經(jīng)費(fèi)是2638億美元，其中1028億直接用于醫(yī)療費(fèi)用［10］。由此可見(jiàn)，腫瘤的早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷和早期治療對(duì)于降低發(fā)病率、維護(hù)人類健康、促進(jìn)社會(huì)發(fā)展有著至關(guān)重要的意義。

生物芯片在腫瘤的研究、診斷和治療中具有及其廣闊的前景。因?yàn)槟[瘤的發(fā)生發(fā)展是非常復(fù)雜的過(guò)程，涉及多種基因的表達(dá)失常、突變或缺失等，而生物芯片技術(shù)正是具有敏感性高、檢測(cè)迅速、信息量大的特點(diǎn)，可以滿足早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷的要求［12］。以下從基因芯片、蛋白質(zhì)芯片和組織芯片三方面介紹生物芯片在腫瘤研究中的應(yīng)用。

3.1 基因芯片

采用基因芯片分析患者和腫瘤高發(fā)人群的基因表達(dá)譜，并與正常對(duì)照組進(jìn)行比對(duì)，為發(fā)現(xiàn)腫瘤

致病基因提供線索；通過(guò)檢測(cè)突變基因，對(duì)具有發(fā)生腫瘤風(fēng)險(xiǎn)的個(gè)體提前預(yù)警［13，14］。因?yàn)榛虮磉_(dá)水平的差異，反映了不同細(xì)胞類型、不同生長(zhǎng)環(huán)境、不同生長(zhǎng)階段細(xì)胞的功能信息，所以分析所有基因的表達(dá)譜對(duì)于研究基因的功能十分重要，利用基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)可隨時(shí)獲取腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)各階段和腫瘤生長(zhǎng)相關(guān)基因的表達(dá)模式，為確定腫瘤各階段的治療方案提供可靠的依據(jù)［15］。黃達(dá)薔等［16］，用包含4096個(gè)cDNA基因表達(dá)譜芯片研究一組肺癌組織樣本的基因表達(dá)譜，結(jié)果共篩選出差異表達(dá)的基因370條，包含已知基 因l46條，未知基因224條，其中l(wèi)07條表達(dá)增加，263條表達(dá)降低，認(rèn)為基于cDNA微矩 陣技術(shù)的腫瘤基因表達(dá)譜分析能夠高通量篩選與肺癌發(fā)生密切相關(guān)的基因。

3.2 蛋白質(zhì)芯片

腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)和篩查對(duì)早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷惡性腫瘤非常重要，并可以指導(dǎo)腫瘤的治療，尤其是多種腫瘤標(biāo)志物聯(lián)合檢測(cè)更為有利。因?yàn)樵诩膊≡缙?，甚至在出現(xiàn)病理變化之前，細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)成分和表達(dá)水平首先發(fā)生改變，通過(guò)動(dòng)態(tài)追蹤觀察蛋白質(zhì)的變化，可以早期發(fā)現(xiàn)和預(yù)警，所以檢測(cè)腫瘤的分子標(biāo)志物就是早期診斷的重要手段［17］。而蛋白質(zhì)芯片技術(shù)為腫瘤標(biāo)志物的聯(lián)合檢測(cè)提供了理想工具，根據(jù)芯片的載體性質(zhì)，又分為固相蛋白質(zhì)芯片和液相蛋白質(zhì)芯片，目前臨床上用于腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)的多為固相芯片［18，19］。肖雪媛等采用SELDI(surface-enhanced laser desorption/ionization)蛋白芯片技術(shù)檢測(cè)了30例肺癌病人血清和12例正常人血清中的蛋白質(zhì)譜，結(jié)果顯示，肺癌病人與正常人的血清中有15個(gè)差異蛋白(標(biāo)志分子)表達(dá)，其中6個(gè)蛋白質(zhì)在肺癌病人血清中高表達(dá)，9個(gè)蛋白質(zhì)在肺癌病人血清中低表達(dá)，證明與肺癌相關(guān)的特異性標(biāo)志分子可從病人血清中檢測(cè)出來(lái)，而且蛋白質(zhì)芯片技術(shù)對(duì)于發(fā)現(xiàn)和篩選血清中的肺癌標(biāo)志蛋白是一種有效、快速的工具［20］。趙靜采用多腫瘤標(biāo)志物蛋白芯片檢測(cè)試劑盒對(duì)45例卵巢癌患者(卵巢癌組)、82例卵巢良性腫瘤患者(良性瘤組)和36名健康體檢者(對(duì)照組)血清中12種腫瘤標(biāo)志物水平進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果卵巢癌組糖鏈抗原 125(CAl25)、癌胚抗原(CEA)、糖鏈抗原242(CA242)和糖鏈抗原199(CAl99)檢測(cè)陽(yáng)性率高于良性瘤組及對(duì)照組(P＜0.05)，且四種標(biāo)志物聯(lián)合檢測(cè)兼顧了診斷靈敏度和特異性，診斷準(zhǔn)確度高達(dá)84%，表明應(yīng)用多腫瘤標(biāo)志物蛋白芯片檢測(cè)技術(shù)，綜合分析多腫瘤標(biāo)志物水平及動(dòng)態(tài)變化，可提高腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)在卵巢癌的診斷及治療中的應(yīng)用價(jià)值［21］。

3.3 組織芯片

將數(shù)十至數(shù)百個(gè)不同個(gè)體的組織標(biāo)本集成在一張固相載體上制成組織芯片，從而提供了一種高通量、大樣本以及快速的疾病形態(tài)學(xué)分析工具。組織芯片技術(shù)與傳統(tǒng)的病理學(xué)、免疫組織化學(xué)等技術(shù)相結(jié)合，可做HE染色、特殊染色、免疫組織化學(xué)染色、DNA和RNA原位雜交、熒光原位雜交等。因?yàn)橐淮螌?shí)驗(yàn)可獲得大量的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，組織芯片技術(shù)是建立疾病、特別是腫瘤生物分子文庫(kù)的高效分析平臺(tái)［22］。林茂松等采集了54例直腸癌組織和40例癌旁直腸粘膜組織制成組織芯片，采用免疫組織化學(xué)染色方法檢測(cè)了多種蛋白因子的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，p53、CyclinD1、Bcl-2的異常表達(dá)與直腸癌的發(fā)生有關(guān)，這種表達(dá)升高可能有助于直腸癌的早期診斷［23］。

生物芯片作為20世紀(jì)后期逐漸發(fā)展起來(lái)的高新技術(shù)，已經(jīng)在眾多的領(lǐng)域中顯示出它的重要作用。相信伴隨著芯片制備所必須的微加工和微電子技術(shù)的不斷進(jìn)步，伴隨著生命科學(xué)及其相關(guān)學(xué)科的不斷發(fā)展，生物芯片技術(shù)將具有更加廣泛應(yīng)用前景。

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