黃文革，李 婕，陳鳳英，黃河清

（中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，廣州 510080）

肺癌是目前死亡率最高的癌癥之一。建立理想的動物腫瘤模型是研究惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移及療效評價(jià)的重要手段。其中，可移植腫瘤模型因操作簡便、易于觀察，得到了學(xué)者們的廣泛認(rèn)可。Walker-256是目前廣泛認(rèn)可的大鼠可移植性腫瘤細(xì)胞株，植入體內(nèi)能較好地模擬人類惡性腫瘤的膨脹性和浸潤生長方式［1］。目前，學(xué)者們主要應(yīng)用Walker-256細(xì)胞植入大鼠支氣管［2］，構(gòu)建原位性肺癌模型。但此造模方法對實(shí)驗(yàn)技術(shù)要求較高，術(shù)后動物死亡率高，在實(shí)際應(yīng)用中成模率低；而采用尾靜脈注射建立肺癌移植性模型鮮見報(bào)道。本研究采用靜脈注射方法建立大鼠Walker-256移植性肺癌模型，觀察大鼠的成瘤及生存情況，為進(jìn)一步的腫瘤實(shí)驗(yàn)研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

大鼠Walker-256瘤株，由中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心細(xì)胞庫提供；KM小鼠，4只，體重18～22 g，雄性，SPF級，實(shí)驗(yàn)動物質(zhì)量合格證明號：No.0084621。SD大鼠40只，體重60～70 g，雄性，SPF級，實(shí)驗(yàn)動物質(zhì)量合格證明號：No.0084696，均購于中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，生產(chǎn)許可證號：SCXK（粵）2009—0011。動物飼養(yǎng)于標(biāo)準(zhǔn)的屏障環(huán)境動物實(shí)驗(yàn)室。實(shí)驗(yàn)動物設(shè)施許可證號：SYXK（粵）2007—0081.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞的復(fù)蘇和腹水的制備：Walker-256癌細(xì)胞常規(guī)復(fù)蘇，置于新生小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液中，低速離心，棄上清液，再用培養(yǎng)液配成細(xì)胞懸液（1×107/m L），將細(xì)胞懸液接種到KM小鼠腹腔中，0.2 m L/只，5～7 d后出現(xiàn)腹水。

1.2.2 移植性肺癌模型的建立：將KM小鼠的Walker-256細(xì)胞腹水，無菌操作，用5 m L一次性注射器（6號針頭）抽出腹水，用生理鹽水稀釋，用細(xì)胞計(jì)數(shù)儀進(jìn)行計(jì)數(shù)，再用生理鹽水稀釋成高、中、低三個濃度（分別為1.5×106/m L，0.5×105/m L，2.5× 104/m L）備用。取40只SD大鼠隨機(jī)分為高、中、低三個模型組和正常對照組，共4組，每組10只，采用尾靜脈注射接種法，模型組大鼠尾靜脈注射不同濃度的腹水細(xì)胞懸液，0.2 mL/只，正常對照組大鼠尾靜脈注射等量的生理鹽水，所有動物飼養(yǎng)在屏障環(huán)境動物實(shí)驗(yàn)室中。實(shí)驗(yàn)期間，動物自由飲食；連續(xù)觀察21 d。

1.3 觀察指標(biāo)

1.3.1 大體觀察：觀察注射腹水細(xì)胞懸液后大鼠的毛色、體重、飲食、活動情況；當(dāng)模型組有動物出現(xiàn)死亡時(shí)結(jié)束實(shí)驗(yàn)觀察，采用頸椎脫臼法處死全部大鼠，對大鼠進(jìn)行常規(guī)解剖，肉眼觀察肺臟及其他器官的大小、色澤、質(zhì)地及有無腫瘤結(jié)節(jié)形成，。

1.3.2 取材：稱取各組大鼠的肺部、肝臟、脾臟的重量，計(jì)算臟器系數(shù)（臟器系數(shù)=器官重量/體重×100％）。

1.4 組織病理學(xué)分析

所取的大鼠的肺和可疑臟器，用10％福爾馬林固定，常規(guī)石蠟包埋，切片厚4～5μm，HE染色，觀察病理形態(tài)學(xué)變化。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

用SPSS 17.0軟件包處理，數(shù)據(jù)以xˉ±s表示，組間差異采用方差分析，P＜0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 動物的一般情況及體重變化

模型組大鼠注射腫瘤腹水細(xì)胞懸液后7 d動物飲食、體征正常，14 d后大鼠出現(xiàn)食量明顯減少，活動少，倦怠狀，對外界刺激反應(yīng)遲鈍，皮毛松、無光澤，體質(zhì)消瘦等癌癥惡病質(zhì)體征。注射后7、12、14和21 d，高、中、低三個模型組體重均明顯低于正常對照組（P＜0.05）。注射后21 d高濃度模型組大鼠開始出現(xiàn)死亡。各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)的體重情況見表1。

2.2 移植性肺癌模型的成瘤率

注射腫瘤腹水細(xì)胞懸液后21 d，高濃度組動物出現(xiàn)死亡，處死所有實(shí)驗(yàn)組大鼠，解剖后肉眼觀察發(fā)現(xiàn)高濃度模型組全部動物肺部均出現(xiàn)多個肉眼可見的癌結(jié)節(jié)（10/10），中濃度組則有8只（8/10），低濃度組中有3只（3/10）出現(xiàn)上述表現(xiàn)，各組移植性肺癌成瘤率見表2。

2.3 各組大鼠臟器系數(shù)

高、中、低濃度組大鼠肺臟系數(shù)、肝臟系數(shù)高于正常對照組，其中高劑量組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；各濃度組大鼠脾臟系數(shù)與正常對照組相比無顯著性差異，見表3。

表1 各組動物不同時(shí)間點(diǎn)的體重情況（±s） Tab.1 The body weight of the rats at different time

表1 各組動物不同時(shí)間點(diǎn)的體重情況（±s） Tab.1 The body weight of the rats at different time

注：與正常對照組相比，＊＊P＜0.01.Note：Compared with the normal group，＊＊P＜0.01

組別Groups 不同時(shí)間點(diǎn)體重/克The body weight of the rats at different time/g實(shí)驗(yàn)前Before experiment 7 d 12 d 14 d 21 d正常組Normal group 67.9±5.3 111.4±11.8 150.4±9.9 159.7±11.2 182.0±27.6高濃度High dosage（3×105）67.3±6.0 87.0±8.5＊＊ 101.5±12.8＊＊ 105.3±14.4＊＊ 122±23.5＊＊中濃度Mid dosage（1×105）65.6±6.5 88.2±9.4＊＊ 105.9±10.9＊＊ 112.0±13.3＊＊ 137.8±15.4＊＊低濃度Low dosage（0.5×105）68.2±4.7 84.6±7.5＊＊ 100.5±11.2＊＊ 101±12.1＊＊ 126±27.2＊＊

3 討論

表2 各組動物肺癌成模情況Tab.2 The establishment status of lungcancermodels in the rats

2.4 肺部大體解剖情況

正常組大鼠，常規(guī)解剖后肉眼觀察，各器官未見異常變化，肺部表面光滑；10只高濃度模型組大鼠，肺部均見有中央型、彌漫性病灶，呈結(jié)節(jié)狀，不規(guī)則，結(jié)節(jié)表面光滑，與周圍正常組織邊界清楚，質(zhì)硬，灰白。中、低濃度模型組部分大鼠肺部也可見少數(shù)腫塊結(jié)節(jié)。各模型組大鼠肝臟、脾臟等器官均未發(fā)現(xiàn)異常（圖1）。

2.5 肺部病理學(xué)檢查

經(jīng)過HE染色，鏡下可見高濃度模型組10只大鼠（10/10）、中濃度模型組有8只大鼠（8/10）、低濃度模型組有3只大鼠（3/10）的肺部組織可見不規(guī)則的癌巢，腫瘤細(xì)胞排列緊密，癌細(xì)胞核大，漿少、核分裂相多見、核內(nèi)染色質(zhì)粗糙，部分呈空泡狀，周圍炎癥細(xì)胞浸潤，癌巢形態(tài)大小不一（圖2，圖1、2見彩插7）。所有模型組大鼠的肝臟和脾臟未見癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移（圖3、圖4，見彩插8）。

肺癌療效得不到提高的主要障礙在于肺癌臨床表現(xiàn)復(fù)雜，難以早期發(fā)現(xiàn)，復(fù)制出與人類肺癌發(fā)病機(jī)制、發(fā)展過程相似的動物模型是腫瘤學(xué)研究必不可少的手段之一。目前肺癌動物模型的制備方法多采用誘發(fā)性、移植性或轉(zhuǎn)基因動物模型。移植性動物模型又可分為原位移植和異位移植，其中異位移植因其方法簡便、成模率高而被廣泛應(yīng)用，但該類模型適用于抗癌藥物療效檢測，不適合用于腫瘤發(fā)生和形成機(jī)制的研究。原位移植動物模型被認(rèn)為是目前比較理想的模型，主要通過將癌細(xì)胞直接注射到肺部支氣管復(fù)制肺癌原位模型［3、4］，該模型能較真實(shí)地模擬肺癌患者的臨床特征，但手術(shù)操作難度較大，動物死亡率高，成瘤率低。

Walker256腫瘤是大鼠自發(fā)性乳腺癌，多移植于SD大鼠或W istar大鼠這兩種遠(yuǎn)交系動物中，用于腫瘤學(xué)基礎(chǔ)研究或細(xì)胞傳代［5］。Walker256也被用于移植性肺癌模型的制作［6］。

本研究選取KM小鼠腹腔注射Walker256癌細(xì)胞，成功制備了腹水瘤細(xì)胞懸液，采用尾靜脈注射Walker256癌細(xì)胞懸液的方法建立大鼠移植性肺癌模型，比較三個不同細(xì)胞濃度的肺癌成瘤情況。結(jié)果顯示，造模14 d后，模型組動物出現(xiàn)攝食減少，活動減少，皮毛欠光澤等惡病質(zhì)體征；造模21 d時(shí)，注射高濃度Walker256癌細(xì)胞（3×105個細(xì)胞/只）的動物肺部均出現(xiàn)肉眼可見癌結(jié)節(jié)，成瘤率為100％，肺臟系數(shù)和肝臟系數(shù)遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于正常對照組。HE結(jié)果顯示，不同濃度組動物肺部均發(fā)現(xiàn)多發(fā)性癌灶，但并未出現(xiàn)其他臟器轉(zhuǎn)移，與肺原位接種方法建立的肺癌模型病理結(jié)果類似［7］。在生存狀態(tài)上，此模型大鼠的癥狀與臨床上癌癥病人消瘦、乏力、食欲不振等臨床病癥類似，為藥物的初步篩選提供參考依據(jù)。相比于傳統(tǒng)的移植性肺癌造模方法，此造模方法簡單可行，成模時(shí)間短，成模率高，與肺癌的發(fā)展進(jìn)程較一致，但腫瘤轉(zhuǎn)移率不高，不能反映晚期癌癥病人的臨床生物學(xué)體征，仍有待進(jìn)一步的研究。

本研究采用尾靜脈注射Walker-256細(xì)胞成功建立大鼠移植性肺癌模型，可作為腫瘤學(xué)可靠的研究手段之一，為腫瘤發(fā)病機(jī)制及治療研究奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

［1］王紅衛(wèi)，卓忠雄，趙樹文.大鼠Walker-256皮下移植瘤模型的建立及其超聲評價(jià)［J］.臨床超聲醫(yī)學(xué)雜志，2007，9 （2）：68-71.

［2］Gomes Neto A，Simao AF，Miranda Sde，P，et al.Experimental rat lung tumor model with intrabronchial tumor cell implantation［J］.Acta Cir Bras，2008，23（1）：84-92.

［3］Kondo K，F(xiàn)ujino H，Miyoshi T，et al.Orthotopically implanted SCID mousemodel of human lung cancer suitable for investigating metastatic potential and anticancer drug effects［J］.Oncol Rep，2004，12（5）：991-999.

［4］Wang HY，Ross HM，Ng B，et al.Establishment of an experimental intrapulmonary tumor nodule model［J］.Ann Thorac Surg，1997，64（1）：216-219.

［5］姚明，楊建平，王麗娜，等.腹水傳代和體外培養(yǎng)Walker256癌細(xì)胞系建立大使骨癌痛模型的可行性［J］.中華醫(yī)學(xué)雜志，2008，88（13）：880-889.

［6］彭永海，李琦，劉慶，等.大鼠肝包膜下接種Walker-256瘤株肺轉(zhuǎn)移的觀察［J］.第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2002，10（23）：1084-1122.

［7］劉馨，伍治平，左曙光，等.小鼠Lewis肺癌原位模型的構(gòu)建［J］.中國肺癌雜志，2010，1（1）：42-47.