杜金粉，楊文濤，楊桂連，王春鳳

(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長(zhǎng)春 130118)

雞球蟲(chóng)病是由艾美耳屬球蟲(chóng)引起的一種細(xì)胞內(nèi)寄生蟲(chóng)病，嚴(yán)重影響?zhàn)B雞業(yè)的健康發(fā)展。全球每年因雞球蟲(chóng)病造成的經(jīng)濟(jì)損失難以估計(jì)，抗球蟲(chóng)藥物研發(fā)和使用的費(fèi)用數(shù)額巨大。目前，化學(xué)藥物預(yù)防仍是養(yǎng)雞業(yè)控制球蟲(chóng)病的一個(gè)主要方法，但化學(xué)藥物的長(zhǎng)期使用導(dǎo)致球蟲(chóng)產(chǎn)生耐藥性、藥物殘留等一系列問(wèn)題。應(yīng)用傳統(tǒng)疫苗如弱毒蟲(chóng)苗免疫預(yù)防球蟲(chóng)病雖然有一定效果，但存在毒力返強(qiáng)和散播病原的可能。因此通過(guò)基因工程方法制備基因工程新型疫苗預(yù)防雞球蟲(chóng)病成為大勢(shì)所趨，重組活載體疫苗是用基因工程技術(shù)將病毒或細(xì)菌構(gòu)建成一個(gè)載體，把外源基因插入其中使之表達(dá)的活疫苗，其中以細(xì)菌或病毒為載體的基因重組活載體疫苗的研究倍受關(guān)注。本文對(duì)雞球蟲(chóng)重組活載體疫苗的研究進(jìn)行綜述，旨在為雞球蟲(chóng)免疫預(yù)防提供參考。

1 重組細(xì)菌活載體球蟲(chóng)疫苗

細(xì)菌載體具有培養(yǎng)方便，外源基因容納量大，刺激細(xì)胞免疫力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。同時(shí)起佐劑作用，刺激產(chǎn)生強(qiáng)的B細(xì)胞和T細(xì)胞免疫應(yīng)答［1］。目前應(yīng)用到球蟲(chóng)上的細(xì)菌活載體主要有沙門(mén)氏菌、卡介苗、乳酸菌、枯草桿菌等。

1.1 減毒沙門(mén)氏菌活載體疫苗 沙門(mén)氏菌屬于革蘭氏陰性桿菌、腸桿菌科。沙門(mén)氏菌的減毒是利用物理、化學(xué)或基因工程的方法，使某個(gè)或某些基因發(fā)生不可逆的突變，從而降低其毒力。減毒沙門(mén)氏菌作為一種活疫苗載體，既能保持持久的免疫刺激而不需要反復(fù)加強(qiáng)免疫，又能有效激發(fā)體液和細(xì)胞免疫［2］。目前減毒沙門(mén)氏菌被廣泛應(yīng)用于新型疫苗的研制且顯示出廣闊應(yīng)用前景。Konjufca等將柔嫩艾美耳球蟲(chóng)(E.tenella)抗原SO7基因在減毒鼠傷寒沙門(mén)氏菌進(jìn)行了表達(dá)［3］。覃宗華等［4］構(gòu)建了毒害艾美耳球蟲(chóng)(E.necatrix)MIC2基因、堆型艾美耳球蟲(chóng)(E.acervulina)cSZ1基因雙基因共表達(dá)的重組減毒沙門(mén)氏菌，將重組減毒沙門(mén)氏菌經(jīng)口免疫雛雞后能誘導(dǎo)產(chǎn)生抗雞球蟲(chóng)重組抗原的特異性IgG和IgA。免疫后3周試驗(yàn)雞以同源 E.necatrix和E.acervulina攻擊，可同時(shí)獲得部分保護(hù)。杜愛(ài)芳等［5］將 E.tenella 5401 基因的真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3－5401，高壓電轉(zhuǎn)化到dam和phoP基因雙突變的減毒鼠傷寒沙門(mén)菌中。將其口服接種于3日齡雛雞，2周后用相同劑量加強(qiáng)免疫1次，二免后2周用E.tenella孢子化卵囊攻擊。結(jié)果表明重組菌既能誘導(dǎo)產(chǎn)生抗E.tenella抗體，也能顯著增強(qiáng)淋巴細(xì)胞增殖水平，其抗球蟲(chóng)指數(shù)(ACI)為164.98。

1.2 重組卡介苗活載體疫苗 卡介苗(BCG)是一種強(qiáng)免疫佐劑和非特異性免疫增強(qiáng)劑，并且熱穩(wěn)定性強(qiáng)、副作用小、易于生產(chǎn)，因此是表達(dá)重組外源基因的理想活菌疫苗載體。重組卡介苗(rBCG)是利用基因工程技術(shù)在BCG中導(dǎo)入外源基因，在rBCG中可表達(dá)病毒、細(xì)菌、寄生蟲(chóng)的抗原以及細(xì)胞因子等許多活性蛋白。Wang Q等［6］構(gòu)建了含有E.tenella rhomboid基因的 rBCG pMV261－Rho和pMV361－Rho，分別將其免疫雛雞后能誘導(dǎo)雛雞產(chǎn)生較高水平的CD4+和CD8+，pMV261－Rho免疫組能誘導(dǎo)雞產(chǎn)生抗E.tenella特異性抗體，56.04%的雞能抵抗E.tenella孢子化卵囊的攻擊，其抗體滴度與免疫后獲得的保護(hù)率均高于pMV361－Rho免疫組。李運(yùn)娜等［7］構(gòu)建的雞柔嫩艾美耳球蟲(chóng)ADF基因重組卡介苗pMV261－ADF和pMV361－ADF對(duì)柔嫩艾美耳球蟲(chóng)卵囊的攻擊具有一定的免疫保護(hù)作用。苑淑賢等［8］構(gòu)建堆型艾美耳球蟲(chóng)長(zhǎng)春地方株pMV361－cszl重組質(zhì)粒并在BCG誘導(dǎo)表達(dá)rBCG及檢測(cè)免疫保護(hù)效果。

1.3 乳酸菌載體疫苗 乳酸菌是動(dòng)物腸道內(nèi)的常在菌，在動(dòng)物體內(nèi)長(zhǎng)期存在，可以調(diào)節(jié)機(jī)體內(nèi)環(huán)境的免疫狀態(tài)，增強(qiáng)細(xì)胞免疫和體液免疫功能，從而發(fā)揮其抗感染的作用。乳酸菌具有諸多的益生功能，可控制腸道感染、抗腫瘤、促進(jìn)小腸局部細(xì)胞免疫和體液免疫，產(chǎn)生黏膜分泌型IgA等。何高明等［9］研究了乳酸桿菌對(duì)雛雞巨型艾美耳球蟲(chóng)(E.maxima)感染的影響，發(fā)現(xiàn)乳酸桿菌可減輕E.maxima對(duì)雛雞腸道產(chǎn)生的損傷，說(shuō)明乳酸菌本身對(duì)雞球蟲(chóng)有很好的保護(hù)性效果。乳酸桿菌作為活疫苗抗原遞呈載體具有很好的安全性，用其作為載體制備雞球蟲(chóng)重組活載體疫苗可將乳酸菌的益生功能和保護(hù)性抗原的保護(hù)效果集于一身，具有廣闊的應(yīng)用前景。Yang等［10］將E.tenella SO7基因重組入大腸桿菌－乳酸菌穿梭表達(dá)載體，進(jìn)而將重組菌免疫雛雞后攻蟲(chóng)。結(jié)果顯示與照組相比，免疫組雛雞體重明顯增加、發(fā)病率下降，盲腸病變計(jì)分顯著降低。外周血中CD4+、CD8+T細(xì)胞的數(shù)量顯著增加，表明該重組菌顯著增強(qiáng)了雞體細(xì)胞免疫水平。該重組菌對(duì)E.tenella具有很好的保護(hù)效果，為球蟲(chóng)乳酸菌重組活載體疫苗研究奠定了基礎(chǔ)。徐鑌蕊等［11］將E.tenella保護(hù)性抗原基因SO7導(dǎo)入乳酸桿菌表達(dá)載體并將重組菌免疫肉仔雞。結(jié)果表明飼喂轉(zhuǎn)基因乳酸菌組雛雞受球蟲(chóng)攻擊的組織病理學(xué)變化較輕，從而證明該重組乳酸菌對(duì)球蟲(chóng)感染具有一定的保護(hù)作用。王春鳳等［12］將含有 E.tenella SO7基因的重組乳酸菌免疫雛雞，發(fā)現(xiàn)該重組乳酸菌對(duì)攻蟲(chóng)后的雛雞具有較好的增重效果，且可顯著降低盲腸病變計(jì)分，顯示了對(duì)雞球蟲(chóng)很好的保護(hù)效果。張莉［13］將表達(dá)E.tenella TA4基因的重組乳球菌口服雛雞十天，人工感染E.tenella一周后宰殺，通過(guò)增重、糞便中卵囊數(shù)、盲腸病變計(jì)分、盲腸卵囊數(shù)和抗球蟲(chóng)指數(shù)等指標(biāo)進(jìn)行評(píng)價(jià)。結(jié)果ACI為160.12，能較好保護(hù)球蟲(chóng)感染。

1.4 枯草芽孢桿菌載體疫苗 枯草桿菌廣泛應(yīng)用于工業(yè)發(fā)酵和微生物分子遺傳學(xué)領(lǐng)域。該菌不產(chǎn)生毒素，是一種無(wú)致病性的安全微生物，具有完善的分泌系統(tǒng)，能將外源重組蛋白直接分泌至培養(yǎng)液中，大大減少了表達(dá)產(chǎn)物的分離純化步驟，提高了回收率，現(xiàn)已應(yīng)用于許多蛋白的表達(dá)［14］。黃現(xiàn)青等［15］研究了枯草芽孢桿菌fmbJ株產(chǎn)生的脂肽的抗球蟲(chóng)作用，研究表明感染不用藥組、抗球蟲(chóng)藥飲水組、灌胃和肌肉注射脂肽組對(duì)E.tenella的ACI分別為18.71、185.45、161.40 和 109.83。結(jié)果顯示枯草芽孢桿菌fmbJ株產(chǎn)生的脂肽具有一定的抗球蟲(chóng)效果。Lee等［16］將芽孢桿菌飼喂雛雞，攻蟲(chóng)后發(fā)現(xiàn)該類(lèi)細(xì)菌可有效保護(hù)雞體抗球蟲(chóng)感染，這為雞球蟲(chóng)枯草芽孢桿菌活載體疫苗研究奠定了基礎(chǔ)。

2 重組病毒活載體球蟲(chóng)疫苗

病毒活載體疫苗是疫苗研發(fā)的重要方向之一，因?yàn)樗忻庖咝ЯΩ?、成本低及安全性好等?yōu)點(diǎn)。目前，主要的病毒活載體有牛痘病毒、禽痘病毒、金絲雀痘病毒、人2型和5型腺病毒、火雞皰疹病毒、偽狂犬病病毒、水痘－帶狀皰疹病毒、微RNA病毒、黃病毒和脊髓灰質(zhì)炎病毒等。Yang等［17］構(gòu)建了含有E.tenella rhomboid基因的重組雞痘病毒rFPV－rhomboid，將其免疫3日齡雛雞，結(jié)果免疫組無(wú)論從卵囊記數(shù)、盲腸病變記分，還是相對(duì)增重、抗體產(chǎn)生以及細(xì)胞免疫水平均優(yōu)于空白對(duì)照組。當(dāng)分別用102、104和106PFU不同的劑量免疫雛雞，E.tenella孢子化卵囊攻蟲(chóng)，其保護(hù)率分別為39.6%、41.1%和41.7%。有關(guān)重組病毒活載體疫苗的研究相對(duì)較少，還有待進(jìn)一步研究。

3 結(jié)語(yǔ)

總之，近年來(lái)雞球蟲(chóng)基因工程疫苗發(fā)展迅速，其中是以細(xì)菌和病毒為載體的重組活載體疫苗研究非?；钴S，此種疫苗的研究為雞球蟲(chóng)病免疫預(yù)防提供了新途徑。但這些疫苗尚處在試驗(yàn)研究階段，還有一些瓶頸技術(shù)有待解決，例如載體的優(yōu)化，球蟲(chóng)保護(hù)性抗原基因的篩選等。但隨著分子生物學(xué)和基因工程技術(shù)的發(fā)展和球蟲(chóng)免疫學(xué)研究的不斷深入，以上問(wèn)題都會(huì)逐步得到解決。

［1］張 波，陳冠軍.細(xì)菌載體疫苗的研究進(jìn)展［J］.微生物學(xué)免疫學(xué)進(jìn)展，2002，30(2):86 －90.

［2］徐引弟，郭愛(ài)珍，陳煥春.減毒沙門(mén)氏菌載體的研究進(jìn)展［J］.畜牧獸醫(yī)科技信息，2007，12:4 －5.

［3］Konjufca V，Jenkins M，Wang S，et al.Immunogenicity of recombinant attenuated Salmonella enterica serovar typhimurium vaccine strains carrying a gene that encodes Eimeria tenella antigen SO7［J］.Infect Immun，2008，76(12):5745 －5753.

［4］覃宗華，謝明權(quán)，蔡建平，等.堆型艾美耳球蟲(chóng)cSZ1基因在減毒沙門(mén)氏菌的表達(dá)及免疫保護(hù)效果研究［J］.寄生蟲(chóng)與醫(yī)學(xué)昆蟲(chóng)學(xué)報(bào)，2005，12(1):6 －13.

［5］杜愛(ài)芳，工素華，胡松華，等.減毒沙門(mén)氏菌為載體傳遞雞球蟲(chóng)疫苗的安安全性、穩(wěn)定性與免疫原性［J］.中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2006，26(2):147 －150.

［6］Wang Q，Li J，Zhang X，et al.Protective immunity of recomhinant Mycobacterium bovis BCG expressing rhomboid gene against Eimeria tenella challenge［J］.Vet parasitol，2009，160(3/4):198－203.

［7］李運(yùn)娜，黃金貴，李建華，等.柔嫩艾美耳球蟲(chóng)ADF基因重組卡介苗的構(gòu)建及其免疫保護(hù)性研究［J］.中國(guó)病原生物學(xué)雜志，2012，7(2):85 －88.

［8］苑淑賢，姚新華，任科研，等.堆型艾美耳球蟲(chóng)cSZ1基因在卡介苗中的表達(dá)及免疫保護(hù)效果研究［C］.中國(guó)會(huì)議－農(nóng)業(yè)畜牧與動(dòng)物醫(yī)學(xué)，2011:217.

［9］何高明，孫 梅.乳酸桿菌對(duì)雛雞巨型艾美耳球蟲(chóng)感染的防治試驗(yàn)［J］.黑龍江畜牧獸醫(yī)，2005，8:50 －52.

［10］Guilian Yang，Chunfeng Wang，F(xiàn)engqi Hao，et al.Studies on construction of a recombinant Eimeria tenella SO7 gene expressing Escherichia coli and its protective efficacy against homologous infection［J］.Parasitol Int，2010，6:1 － 7.

［11］徐鑌蕊，王春鳳，孫 哲，等.轉(zhuǎn)球蟲(chóng)SO7基因功能乳酸桿菌對(duì)肉仔雞感染球蟲(chóng)后盲腸病理學(xué)變化的影響［J］.畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2005，36(1):74 －76.

［12］王春鳳，秦澤榮，徐鑌蕊，等.飼喂轉(zhuǎn)球蟲(chóng)基因功能乳酸桿菌后對(duì)雛雞體重的影響［J］.畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2002，33(6):591－593.

［13］張 莉.疫苗級(jí)乳球菌表達(dá)載體的構(gòu)建及柔嫩艾美耳球蟲(chóng)TA4基因的表達(dá)［D］.北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)，2002.

［14］鄒立扣，王紅寧，潘 欣.枯草芽孢桿菌整合載體研究進(jìn)展［J］.生物技術(shù)通訊，2003，14(6):525 －527.

［15］黃現(xiàn)青，陸兆新，別小妹，等.枯草芽孢桿菌fmbJ株產(chǎn)生的脂肽抗球蟲(chóng)作用研究［J］.中國(guó)病原生物學(xué)雜志，2006，1(4):269－272.

［16］Lee K W，Lillehoj H S，Jang S I，et al.Effect of bacillus－ based direct－fed microbials on Eimeria maxima infection in broiler chickens［J］.Comp Immunol Microbiol Infect Dis，2010，33(6):105－108.

［17］Yang Guilian，Li Jianhua，Zhang Xichen，et al.Eimeria tenella:Construction of a recombinant fowlpox virus expressing rhomboid gene and its protective efficacy against homologous infection［J］.Exp parasitol，2008，119(1):30 － 36.