付起鳳，王德娟，孟凡佳

(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040)

槐米(Flos Sophorae)為豆科植物槐(Sophora japonica L)的干燥花及花蕾，該藥性微寒、味苦，具有涼血止血，清肝瀉火的功效，用于便血、痔血、血痢、崩漏、吐血、衄血、肝熱目赤、頭痛眩暈［1］。藥理研究表明，槐米中所含主要成分為蘆丁(Rutin，維生素P)，又稱蕓香苷，蘆丁難溶于冷水(1∶8 000)，略溶于沸水(1∶200)。本實驗是根據(jù)蘆丁在冷水和熱水中的溶解度差異較大的特性，以槐米為原料，采用超聲法進(jìn)行提取，用空氣冷凝回流法進(jìn)行精制。用高效液相色譜法測定蘆丁的含量。通過正交設(shè)計法對超聲提取時間、提取溫度、提取頻率進(jìn)行三因素三水平試驗，以此來確定超聲法提取槐米中蘆丁的優(yōu)良工藝。

1 儀器與試藥

LC－2010AHT高效液相色譜分析儀(日本島津);KQ－500DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);SHB－IIIB循環(huán)水式多用真空泵(鄭州長城科工貿(mào)有限公司);DHG－9140A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海一恒科技有限公司);AB204－N型萬分之一電子天平(Metter Toledo CORPORATION);槐米藥材(購于哈爾濱寶豐藥店);蘆丁對照品(購于中國藥品生物制品有限公司);甲醇為色譜純;冰醋酸為分析純;實驗用水為二次蒸餾水。

2 方法與結(jié)果

2．1 槐米中蘆丁的提取方法

向500ml的燒杯中加400ml蒸餾水，在電爐子上加熱至沸騰，緩緩加入20．0g槐米粗粉并不斷攪拌，繼續(xù)煮沸2min，然后將燒杯轉(zhuǎn)移到超聲清洗器中進(jìn)行超聲提取后，靜置，取上層絮狀物抽濾，并干燥后得粗品蘆丁，將該產(chǎn)物于100ml圓底燒瓶中并加入15～20ml甲醇進(jìn)行回流冷凝40min，趁熱過濾得濾液，將其放冷至結(jié)晶完全后過濾得精品蘆丁，將其于105℃干燥至恒重得干燥的精品蘆丁。

2．2 色譜條件

固定相:Hypersil ODS2 C18色譜柱(4．6mm×150mm，5μm);保護(hù)柱(大連物化所 依特利公司);流動相:甲醇－1%冰醋酸(40∶60V/V)溶液，應(yīng)用前經(jīng)0.45μm微孔濾膜過濾，并超聲脫氣;流速:1．0ml/min;檢測波長為257nm;進(jìn)樣量為10ml;柱溫為30℃。該色譜條件的對照品及樣品的色譜圖見圖1，圖2。

2．3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

取在105℃干燥至恒重的蘆丁對照品50．0mg于50ml容量瓶中，用色譜甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，配制成1mg/ml的溶液，作為儲備液。分別取適量儲備液加入色譜甲醇配制成 5，10，25，100，150，300μg/ml的蘆丁色譜甲醇溶液。按前述色譜條件取10μl進(jìn)樣，測定峰面積。以濃度X為橫坐標(biāo)，以峰面積Y為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，見表1。結(jié)果如圖3所示。

表1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制(±s)

表1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制(±s)

濃度(μg/m l)5 10 25 100 150 300峰面積(A)79 336 158 752 426 871 1 726 4662 565 101 5 387 017

并以Y對X進(jìn)行線性回歸，得回歸方程Y=17 921．171 6X －38 324．711 3 r=0．999 7。

圖1 對照品色譜圖

圖2 樣品色譜圖

表2 精密度實驗結(jié)果

表3 重復(fù)性考察結(jié)果

圖3 標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

通過回歸方程和標(biāo)準(zhǔn)曲線可以看出，蘆丁對照品在5～300μg/ml濃度范圍內(nèi)，其峰面積與濃度成良好的線性關(guān)系。

2．4 樣品的測定

對照品溶液的配制:取上述貯備液5ml，加入色譜甲醇至50ml并搖勻，使配制成濃度為100μg/ml的蘆丁溶液。

供試品溶液的配制:取樣品5．0mg，精密稱定，加入色譜甲醇溶解并稀釋至50ml，制成每1ml含100μg蘆丁的溶液，用微孔濾膜過濾，直接進(jìn)樣，用外標(biāo)法測定。

2．4．1 儀器精密度實驗

取蘆丁對照品溶液(濃度為100μg/ml)，選用同一色譜條件及同一進(jìn)樣量(10μl)，重復(fù)進(jìn)樣5次，測定供試品的峰面積(S)，計算其精密度的RSD%。其峰面積(S)和保留時間的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為0.28%(＜1．5%)、0．77%(＜1．5%)。儀器精密度良好。

2．4．2 重復(fù)性實驗

分別取3份槐米藥材粗粉約20．0g，精密稱定，按樣品4的條件提取，再依供試品溶液的制備方法操作，得3份供試品溶液，隨行蘆丁對照品(濃度為100μg/ml)溶液作對照，在波長257nm處測峰面積值，計算RSD為2．53%。重復(fù)性較好。

2．5 正交試驗考察提取工藝

2．5．1 正交試驗設(shè)計

根據(jù)單因素試驗及超聲清洗器的功能范圍，本實驗選擇固定料液比(1∶20)、超聲頻率(40kHz)及提取次數(shù)(2次)，考察影響槐米中蘆丁的超聲提取工藝的主要影響因素范圍，即提取溫度為80℃、70℃、60℃，提取時間為10min、20min、30min，提取功率為200W、300W、400W，據(jù)此選用 L9(34)正交試驗設(shè)計［2］，見表4。

2．5．2 正交試驗與結(jié)果分析

2．5．2．1 正交試驗

取槐米藥材粗粉20．0g，精密稱定，按照上述槐米中蘆丁的提取方法進(jìn)行提取，再依供試品溶液的制備方法操作，按L9(34)正交表設(shè)計方案進(jìn)行試驗，用高效液相色譜法對槐米提取物中蘆丁進(jìn)行含量測定［3］。見表5。

表4 L9(34)正交試驗因素水平表

表5 L9(34)正交試驗表

表6 正交試驗方差分析

2．5．2．2 結(jié)果分析

根據(jù)方差分析結(jié)果可知，以槐米中提出蘆丁的百分含量為指標(biāo)，槐米在以水為溶劑用超聲法進(jìn)行提取時，各個因素對槐米提取效果的影響程度不同。直觀分析顯示，溫度是影響蘆丁提取量的主要因素，其次為提取功率;方差分析結(jié)果表明，提取溫度具有顯著性差異，且各因素的影響程度依次為A＞C＞B，所以對提取效果影響有統(tǒng)計學(xué)意義的因素是提取溫度A。因此超聲法提取槐米中蘆丁較理想的提取工藝方案是A2B2C3，即在固定料液比(1∶20)、超聲頻率(40kHz)及提取次數(shù)(2次)的條件下，提取溫度為70℃，提取時間為20min，提取功率為400W時，提取效果最佳。

3 討論

本實驗以槐米為研究對象，考察了以水為溶劑，采用超聲提取法來提取槐米中蘆丁成分，并以槐米中提取出蘆丁百分含量為評價指標(biāo)，以蘆丁為對照品，采用高效液相色譜法測定提取蘆丁的含量;并利用正交試驗的方法來優(yōu)選出提取槐米中蘆丁的最佳工藝。經(jīng)查閱文獻(xiàn)，確定出槐米中蘆丁提取工藝的主要影響因素可以包括為提取溫度、提取時間、提取功率及提取頻率等多個因素，根據(jù)實際情況選用了前三個因素，并采用L9(34)正交試驗表，進(jìn)行了多次試驗，最后綜合結(jié)果分析，得到超聲法提取槐米中蘆丁的最佳工藝，即在固定料液比(1∶20)、超聲頻率(40kHz)及提取次數(shù)(2次)的條件下，提取溫度為70℃，提取時間為20min，提取功率為400W時，提取效果最佳。為優(yōu)化槐米中蘆丁的超聲法水提取工藝提供了參考依據(jù)。

用超聲法提取槐米中的蘆丁時，適宜的超聲提取條件可提高蘆丁的產(chǎn)率。優(yōu)選出的提取工藝條件簡單易行、提取速度快，節(jié)省了提取時間，提高了實驗效率。

由于該實驗所用的超聲清洗器功能有限，所選擇的條件范圍受到了限制，槐米中蘆丁的提取率不是很理想，但在實驗室現(xiàn)有的條件下該實驗確實對槐米中蘆丁的超聲提取工藝起到了優(yōu)化作用;如果將超聲清洗器改為超生提取器，我們就可以考察更多的試驗因素，并且每個因素也可以通過單因素考察法確定出更好的實驗水平范圍，再通過正交設(shè)計試驗優(yōu)選出提取率更佳的實驗方案。

［1］馬雙成．中國藥典［S］．北京:人民衛(wèi)生出版社，2010:333．

［2］經(jīng)明，王宏，曾祖平，等．正交試驗篩選心衰顆粒提取工藝的研究［J］．中國實驗方劑學(xué)雜志，2008，14(8):29 －31．

［3］鄧富良，陳本美，陳國華，等．高效液相色譜法測定槐米中的蘆丁含量［J］．湖南醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2005，25(6):598－600．