孔令聰，戰(zhàn) 利，趙 晴，高云航，馬紅霞，2

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，長(zhǎng)春 130118;2.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物生產(chǎn)及產(chǎn)品質(zhì)量安全教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，長(zhǎng)春 130118)

多殺性巴氏桿菌(Pasteurella multocida，Pm)是引起多種畜禽巴氏桿菌病的病原體，該病以高熱、肺炎為主要特征[1]，Pm可以在同種或不同種動(dòng)物間相互傳染，也可感染人。在我國(guó)，引起禽和豬巴氏桿菌病的主要病原是莢膜血清A型Pm，引起牛巴氏桿菌病的主要病原是莢膜血清B型Pm。隨著病原菌在不同種屬動(dòng)物間的相互感染，血清型也可能隨之發(fā)生改變。我國(guó)的馬文戈等[2]首次從病牛組織中分離得到莢膜A型Pm。

動(dòng)物源Pm不同血清型間的抗原性、宿主嗜性存在著明顯的差異，菌間交互免疫效果較差[3]，使其引發(fā)的疾病更依賴于抗生素的治療。隨著大量抗菌藥物廣泛不合理的應(yīng)用，特別是將抗菌藥物作為抗菌生長(zhǎng)促進(jìn)劑以次治療劑量添加到飼料中，使動(dòng)物源Pm表現(xiàn)為耐藥率高、耐藥范圍廣、呈多重耐藥等特點(diǎn)，其直接后果不僅給控制和治療該病帶來(lái)困難，而且加劇了抗生素在動(dòng)物體內(nèi)的殘留，嚴(yán)重危害了動(dòng)物食品安全[4]。

1 動(dòng)物源Pm的耐藥性研究現(xiàn)狀

動(dòng)物源Pm的耐藥，尤其是多重耐藥問(wèn)題已經(jīng)引起了人們的廣泛關(guān)注。因而許多國(guó)內(nèi)外的臨床工作者積極開(kāi)展了動(dòng)物源Pm的耐藥性檢測(cè)研究。

1.1 國(guó)外部分地區(qū)動(dòng)物源Pm的耐藥性研究Dwight C Hirsh等在美國(guó)加州的戴維斯市從臨床上分離得到5株雞源Pm，其中有3株對(duì)鏈霉素耐藥，4株對(duì)磺胺嘧啶耐藥，其耐藥株的最小抑菌濃度(minimum inhibitory concentration，MIC)均大于128 μg/mL[5]。Cardenas M 等在西班牙分離到 1 株對(duì)喹諾酮敏感的羊源Pm，用逐漸增加抗生素濃度的方法誘導(dǎo)培養(yǎng)，其誘導(dǎo)后的菌株MIC增加了10倍以上[6]。Kehrenberg C等在德國(guó)臨床分離到牛源Pm，并進(jìn)行耐藥監(jiān)測(cè)，結(jié)果顯示所分離菌株均對(duì)氯霉素和氟苯尼考耐藥，其MIC分別為32 μg/mL和16 μg/mL[7]。San Millan A 等從西班牙的首都馬德里分離到禽源Pm，發(fā)現(xiàn)其對(duì)β-內(nèi)酰胺耐藥的菌株都伴隨著對(duì)四環(huán)素、鏈霉素、磺胺類耐藥，且所分離菌株對(duì)阿莫西林和磺胺類的MIC已經(jīng)高達(dá)256 μg/mL[8]。

1.2 國(guó)內(nèi)部分地區(qū)動(dòng)物源Pm的耐藥性研究 金天明在我國(guó)吉林地區(qū)分離到禽源Pm，并應(yīng)用26種抗生素對(duì)病原菌進(jìn)行了藥物敏感性試驗(yàn)，結(jié)果表明，該菌株對(duì)慶大霉素、復(fù)方新諾明、頭孢氨芐、頭孢唑啉、四環(huán)素、依諾沙星等21種抗生素產(chǎn)生耐藥性[9]。Tang X等在中國(guó)部分地區(qū)分離得到233株豬源Pm，并對(duì)20種臨床常用藥物做了藥敏試驗(yàn)，結(jié)果顯示，70%的菌株對(duì)阿莫西林、林可霉素、磺胺二嘧啶、新諾明呈高度耐藥;20%的菌株對(duì)大觀霉素、卡那霉素、新霉素、慶大霉素、替米考星耐藥，其對(duì)阿莫西林、大觀霉素、替米考星、氯四環(huán)素、鹽酸環(huán)丙沙星的MIC已達(dá)128 μg/mL[10]。吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院實(shí)驗(yàn)室自2010年以來(lái)從我國(guó)吉林、內(nèi)蒙古、湖北、河北等省份分離得到牛源多殺性巴氏桿菌12株，分離菌株的耐藥性檢測(cè)結(jié)果顯示，所有菌株都對(duì)新諾明和鏈霉素高度耐藥，其MIC均大于256 μg/mL，從吉林和湖北分離得到的菌株對(duì)臨床治療常用的喹諾酮類和大環(huán)內(nèi)酯類抗生素亦產(chǎn)生了耐藥性，其MIC均為64 μg/mL。

從以上文獻(xiàn)可知，不同國(guó)家和地區(qū)分離的動(dòng)物源Pm，對(duì)常用的各種抗生素均顯示出不同程度的耐藥性，且獸醫(yī)臨床使用頻率較高的抗生素產(chǎn)生的耐藥性較高。動(dòng)物源Pm的耐藥性存在著一定的地域差異性，這可能跟不同國(guó)家和地區(qū)在動(dòng)物治療中所使用或在飼料中添加的抗生素的種類以及使用方法、對(duì)藥物的用量標(biāo)準(zhǔn)不同有關(guān)，從而造成了不同國(guó)家和地區(qū)動(dòng)物源Pm的耐藥性有所差異。

2 動(dòng)物源Pm的耐藥機(jī)制

目前，國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)動(dòng)物源多殺性巴氏桿菌的耐藥可能與耐藥質(zhì)粒、耐藥基因的突變、外排泵的過(guò)量表達(dá)、整合子介導(dǎo)等因素有關(guān)。

2.1 質(zhì)粒介導(dǎo)的動(dòng)物源Pm的耐藥 根據(jù)目前的研究結(jié)果，動(dòng)物源Pm的耐藥主要由質(zhì)粒介導(dǎo)，其質(zhì)粒攜帶的耐藥基因在細(xì)菌間穿梭，使其不斷產(chǎn)生耐藥性。Corinna等[11]報(bào)道，從臨床分離的牛源 Pm耐藥株存在10.8 kb的耐藥質(zhì)粒(Pcck381)，通過(guò)限制性內(nèi)切酶酶切、克隆和序列分析發(fā)現(xiàn)該質(zhì)粒只介導(dǎo)氟苯尼考和氯霉素耐藥，其與3.2 kb的大腸桿菌耐藥質(zhì)粒(Pmbsf1)有很高的同源性，該質(zhì)粒的耐藥性是由floR基因所介導(dǎo)的，且該基因與先前報(bào)道的floR基因同源性高達(dá)99.7%。

Corinna等[12]通過(guò)PCR和轉(zhuǎn)化對(duì)從德國(guó)分離的耐氟苯尼考的2株豬源Pm和1株牛源Pm進(jìn)行耐藥機(jī)制分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其中2株含有耐藥質(zhì)粒(Pcck381)，1株含有攜帶 floR基因的質(zhì)粒(Pcck1900)，floR基因存在于鏈霉素耐藥基因strA和strB的下游，其所介導(dǎo)的氟苯尼考的耐藥性與2005年報(bào)道的英國(guó)耐藥株耐藥性相同，通過(guò)脈沖電泳分析，其所介導(dǎo)的氟苯尼考的耐藥表型取決于質(zhì)粒的水平轉(zhuǎn)移，而不是病原菌的傳播。

2.2 基因突變介導(dǎo)的動(dòng)物源Pm的耐藥 抗菌藥物作用位點(diǎn)的改變或新作用位點(diǎn)的產(chǎn)生可能是細(xì)菌對(duì)某一類具有相同或相似結(jié)構(gòu)抗菌藥物耐藥的最主要因素。Cardenas M等在西班牙分離到1株對(duì)喹諾酮敏感的羊源Pm，用逐漸增加抗生素濃度的方法誘導(dǎo)培養(yǎng)，其誘導(dǎo)后的菌株MIC增加了10倍以上，通過(guò)PCR擴(kuò)增誘導(dǎo)前后菌株的gyrA基因，發(fā)現(xiàn)其喹諾酮耐藥決定區(qū)(QRDR)第83位氨基酸由絲氨酸突變成了異亮氨酸[6]，其符合QRDR區(qū)單點(diǎn)突變規(guī)律[13]，但其他源多殺性巴氏桿菌對(duì)喹諾酮類耐藥是否也與QRDR區(qū)的位點(diǎn)突變有關(guān)，有待于進(jìn)一步研究。

金天明等[9]通過(guò)PCR分別擴(kuò)增禽源Pm敏感株和耐藥株的鏈霉素耐藥基因StrA和磺胺耐藥基因SulⅡ，經(jīng)過(guò)克隆和核苷酸序列測(cè)定，結(jié)果表明，耐藥株P(guān)m對(duì)鏈霉素和磺胺耐藥性的差異與StrA和SulⅡ基因突變有關(guān)(耐藥性較高的菌株，其突變頻率較高)，且試驗(yàn)中所有耐藥株均為StrA基因編碼的第204位氨基酸處發(fā)生突變，在SulⅡ基因編碼的第159、246、384、584、590、591、597、582 位氨基酸處存在突變，這些基因的突變可能是導(dǎo)致Pm對(duì)鏈霉素和磺胺類產(chǎn)生耐藥的主要因素。

2.3 外排泵介導(dǎo)的動(dòng)物源Pm的耐藥 藥物外排泵(主動(dòng)外排系統(tǒng))是能將有害底物排出菌體外的一組轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，其過(guò)量表達(dá)可引起細(xì)菌對(duì)抗生素耐藥。隨著人們對(duì)細(xì)菌細(xì)胞膜上的外排泵介導(dǎo)耐藥研究的深入，多殺性巴氏桿菌的耐藥尤其是多重耐藥的研究進(jìn)入了更深的層次，然而藥物主動(dòng)外排機(jī)制在動(dòng)物源Pm中的作用還未得以充分闡明。

目前，少數(shù)文獻(xiàn)報(bào)道動(dòng)物源Pm對(duì)四環(huán)素的耐藥主要是Tet蛋白的表達(dá)導(dǎo)致細(xì)菌藥物外排系統(tǒng)的產(chǎn)生，進(jìn)而使Pm對(duì)四環(huán)素以及類似藥物產(chǎn)生耐藥性，其機(jī)制與枯草芽孢桿菌的bmr基因編碼的外排蛋白Bmr極為相似[14]。Corinna等對(duì)耐四環(huán)素的豬源Pm進(jìn)行PCR擴(kuò)增耐藥基因和雜交實(shí)驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在24株P(guān)m中，有2株在染色體DNA上檢測(cè)到tet(H)基因，但是只有1株攜帶兩個(gè)拷貝的tet(B)基因，它是進(jìn)入細(xì)菌的決定基因，其耐藥性由此基因決定[15]。Kehrenberg C等首次在牛源 Pm中發(fā)現(xiàn)了編碼膜外排蛋白點(diǎn)的tet(L)基因，該基因存在于質(zhì)粒Pcck3259中，其與攜帶tet(B)基因的質(zhì)粒 Pcck647 極為相似[16]。

Tamas Hatfaludi等在禽源 Pm中發(fā)現(xiàn)了pm0527和pm1980兩種蛋白，其與細(xì)菌的Acra-Tolc主動(dòng)外排系統(tǒng)的Tolc很相似，通過(guò)系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析，其都屬于TolC成員，并確定其與主動(dòng)外排系統(tǒng)有關(guān)。但是否與AcrAB-tolC一樣，其高水平的表達(dá)能表現(xiàn)出對(duì)化合物耐受，以及其外排底物包括四環(huán)素類、氯霉素、紅霉素和氟喹諾酮類，還需要進(jìn)一步的研究[17]。

2.4 整合子(基因盒系統(tǒng))介導(dǎo)的動(dòng)物源Pm的耐藥 整合子介導(dǎo)的細(xì)菌耐藥機(jī)制，因其能解析耐藥基因的高效快速傳播而受到高度關(guān)注[18-19]。目前在革蘭陰性菌中已經(jīng)研究的整合子有四類，每一類都含有不同的int基因，Ⅰ類整合子較為普遍，它可以攜帶多個(gè)耐藥基因，可編碼產(chǎn)生對(duì)氨基糖苷類、氯霉素類、大環(huán)內(nèi)酯類、磺胺類耐藥。

Corinna Kehrenberg 等[15]從臨床分離的耐大觀霉素和鏈霉素的牛源多殺性巴氏桿菌中發(fā)現(xiàn)了一類整合子的aadA14基因，該基因存在于質(zhì)粒PCCK647中，將該質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化到JM109感受態(tài)細(xì)胞中，結(jié)果使其對(duì)大觀霉素和鏈霉素都產(chǎn)生了耐藥性，其MIC值分別為512 μg/mL和25 μg/mL。通過(guò)系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)比對(duì)，該基因與其他細(xì)菌的aadA14的同源性相距甚遠(yuǎn)，其最近的同源簇也只能達(dá)到57%，但在德國(guó)分離的4株耐大觀霉素的牛源Pm耐藥株中卻沒(méi)有發(fā)現(xiàn)aadA14基因。該基因是否是通過(guò)攜帶基因盒的整合子插入到該質(zhì)粒上，以及插入基因盒的類型和順序并沒(méi)有得到進(jìn)一步的闡明[11]。

Kristina Kadlec等[20]對(duì)臨床分離的多重耐藥的牛源Pm進(jìn)行完整基因組測(cè)序，并首次發(fā)現(xiàn)了其菌體基因組上存在對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類產(chǎn)生抗性的基因，分別是rRNA甲基化酶基因erm(42)、大環(huán)內(nèi)酯轉(zhuǎn)運(yùn)基因msr(E)、大環(huán)內(nèi)酯磷酸轉(zhuǎn)移酶mph(E)。大多革蘭陰性菌可以產(chǎn)生染色體介導(dǎo)酶和質(zhì)粒介導(dǎo)酶，例如頭孢菌素酶、廣譜酶，但在多殺性巴氏桿菌中還沒(méi)有類似的報(bào)道。

總之，動(dòng)物源Pm的耐藥機(jī)制日益被人們所重視，探討動(dòng)物源Pm多重耐藥性的產(chǎn)生及其傳播機(jī)制，從而為有效地控制耐藥基因的傳遞和表達(dá)，建立快速診斷細(xì)菌耐藥性方法，以及為指導(dǎo)新藥的研發(fā)奠定理論和實(shí)踐基礎(chǔ)。耐藥尤其是多種治療藥物共同作用下，由基因突變、質(zhì)粒介導(dǎo)、整合子介導(dǎo)和主動(dòng)外排所表現(xiàn)出的多重耐藥性及其耐藥機(jī)制將是今后的研究熱點(diǎn)。

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