李媛媛 于永強(qiáng) (河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，河北 張家口 075000)

鹽酸法舒地爾對(duì)大鼠腦缺血再灌注神經(jīng)元形態(tài)和Bax mRNA表達(dá)的影響

李媛媛 于永強(qiáng) (河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，河北 張家口 075000)

目的 觀察鹽酸法舒地爾對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用。方法 健康雄性Wistar大鼠30只，體重220～260 g，隨機(jī)分為模型對(duì)照組、鹽酸法舒地爾治療組，每組15只。大鼠10%水合氯醛麻醉后，頸動(dòng)脈栓線法造模。鹽酸法舒地爾治療組分別于栓塞前、再灌注前5 min灌胃給藥80 mg/kg;模型對(duì)照組灌胃等量麻油。各組均4 h后斷頭取腦，HE染色光鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，原位雜交檢測(cè)不同組別Bax mRNA，電鏡觀察鹽酸法舒地爾對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷神經(jīng)元形態(tài)、亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)形態(tài)的影響。結(jié)果 模型對(duì)照組腦組織內(nèi)血管擴(kuò)張充血，結(jié)構(gòu)紊亂，部分神經(jīng)細(xì)胞胞體腫脹，可見中央型尼氏小體溶解，部分神經(jīng)細(xì)胞核固縮，核仁縮小、甚至消失，神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞增生，膠質(zhì)細(xì)胞結(jié)節(jié)形成;而且神經(jīng)細(xì)胞核雙層膜結(jié)構(gòu)不清，細(xì)胞核固縮溶解，核仁消失，線粒體水腫擴(kuò)張;鹽酸法舒地爾治療組血管擴(kuò)張減輕、細(xì)胞核雙層結(jié)構(gòu)清晰，線粒體腫脹減輕;而且治療組Bax陽性細(xì)胞平均數(shù)密度減小(P＜0.05)。結(jié)論 鹽酸法舒地爾對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷有一定保護(hù)作用。

腦缺血再灌注;鹽酸法舒地爾;細(xì)胞凋亡;Bax

腦血管疾病主要的病理過程是缺血缺氧，以及由此引起的缺血再灌注損傷。鹽酸法舒地爾可以抑制平滑肌收縮而擴(kuò)張血管，改善和預(yù)防由多種原因引起的腦血管痙攣，改善腦缺血癥狀及伴隨的神經(jīng)元損傷〔1〕。本實(shí)驗(yàn)研究鹽酸法舒地爾的腦細(xì)胞保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物及分組

健康雄性Wistar大鼠30只，體重220～260 g，隨機(jī)分為模型對(duì)照組、鹽酸法舒地爾治療組，每組15只。大鼠10%水合氯醛麻醉，暴露并分離左側(cè)頸總動(dòng)脈、頸外和頸內(nèi)動(dòng)脈，電凝頸外動(dòng)脈的分支甲狀腺上動(dòng)脈、咽升動(dòng)脈，結(jié)扎翼腭動(dòng)脈。將前端涂有硅膠脂的尼龍線經(jīng)頸外動(dòng)脈插入頸總動(dòng)脈，插入深度約(18±0.5)mm。選擇蘇醒后左上肢屈曲，行走時(shí)向左側(cè)旋轉(zhuǎn)或左側(cè)肢體癱瘓的大鼠為栓堵成功者進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，否則視為栓堵失敗，棄之。缺血90 min將栓線拉出至頸外動(dòng)脈，再灌注120 min。鹽酸法舒地爾治療組分別于栓塞前、再灌注前5 min灌胃給藥鹽酸法舒地爾(商品名：川威，天津紅日醫(yī)藥有限公司)80 mg/kg;模型對(duì)照組灌胃等量麻油。

1.2 方法

各組均4 h后斷頭取腦，在腦的視交叉后和下丘腦后橫斷(冠狀面)，將腦分成前、中、后三部分，分別在前、中切面上常規(guī)中性甲醛固定，HE染色光鏡下觀察細(xì)胞形態(tài);原位雜交檢測(cè)不同組別Bax mRNA水平，試劑盒購(gòu)于武漢博士德公司，嚴(yán)格按試劑盒說明書操作。同時(shí)取部分皮質(zhì)制作超薄切片，電鏡觀察神經(jīng)元形態(tài)、亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)形態(tài)。選取Bax mRNA陽性表達(dá)典型區(qū)域，細(xì)胞核染成棕黃色為陽性細(xì)胞，計(jì)數(shù)10個(gè)400倍鏡下陽性細(xì)胞數(shù)，取均值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS10.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 光鏡觀察

模型對(duì)照組皮質(zhì)部分神經(jīng)細(xì)胞核固縮、著色加深，有些細(xì)胞核、質(zhì)界限不清;血管周圍和神經(jīng)元周圍水腫帶明顯增寬(由于腦組織水腫所致)，水腫帶寬度分別為(10.55±2.37)mm、(5.76±2.80)mm。鹽酸法舒地爾治療組皮質(zhì)神經(jīng)元大部分結(jié)構(gòu)清晰、受損神經(jīng)元明顯減少，血管周圍及神經(jīng)元周圍水腫帶寬度分別為(4.60±1.06)mm、(3.15±1.47)mm;兩組水腫帶寬度具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。

2.2 電鏡觀察

模型對(duì)照組：雙層膜結(jié)構(gòu)不清，細(xì)胞核固縮溶解、核仁消失，線粒體水腫擴(kuò)張，神經(jīng)元核內(nèi)異染色質(zhì)增多，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、核糖體、線粒體等減少，血管及膠質(zhì)膜水腫。鹽酸法舒地爾治療組：雙層膜結(jié)構(gòu)相對(duì)清晰，細(xì)胞核固縮少見，核仁可見，神經(jīng)元異染色質(zhì)少，細(xì)胞器較規(guī)整，基膜相對(duì)清晰。

2.3 不同組別神經(jīng)元Bax mRNA表達(dá)的變化

模型對(duì)照組皮質(zhì)神經(jīng)元呈棕黃色，著色深，而且陽性細(xì)胞密集，以血管周圍為主，陽性細(xì)胞數(shù)為(76±12)個(gè)/GHF。鹽酸法舒地爾治療組皮質(zhì)神經(jīng)元呈淺棕黃色，陽性細(xì)胞密度較模型組減低(P＜0.05)，以血管周圍為主，陽性細(xì)胞數(shù)為(45±10)個(gè)/GHF。

3 討論

多種能造成腦組織缺血缺氧的原因，均可引起缺血缺氧腦病，早期可引起腦組織神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞增生，神經(jīng)細(xì)胞急性壞死。而缺血區(qū)域側(cè)支循環(huán)建立以后或損傷腦組織血供恢復(fù)以后，由于氧自由基生成、細(xì)胞內(nèi)鈣超載、一氧化氮合成、興奮性氨基酸增加、脂質(zhì)過氧化、氧化應(yīng)激等毒性作用觸發(fā)細(xì)胞凋亡，造成神經(jīng)細(xì)胞從基因開始死亡，其中血管再通后引起的神經(jīng)細(xì)胞遲發(fā)性壞死是神經(jīng)系統(tǒng)缺血缺氧腦病最主要的危害原因〔1～3〕。并不是所有的缺血均可引起腦細(xì)胞缺血再灌注損害。常見的原因有：(1)再灌注損傷與缺血時(shí)間密切相關(guān)，再灌注損害不會(huì)發(fā)生于過長(zhǎng)或過短的缺血時(shí)間。(2)側(cè)支循環(huán)建立時(shí)間短、建立完善者，再灌注損害不易發(fā)生。(3)缺氧可損傷線粒體、細(xì)胞色素氧化酶系統(tǒng)功能，而氧自由基增多、線粒體鈣超載可使超氧化物歧化酶減少，減少自由基的清除，進(jìn)一步造成細(xì)胞及細(xì)胞器的損害。

腦缺血再灌注損傷可導(dǎo)致細(xì)胞膜、核膜及細(xì)胞器膜通透性改變，酸鈣離子進(jìn)入細(xì)胞器內(nèi)，造成下列危害：(1)突觸前興奮性氨基酸谷氨酸及 N-甲基-D-天門冬氨酸釋放，引起受體依賴的Ca2+內(nèi)流。(2)缺血時(shí)激活磷脂酶A2，造成膜磷脂降解，游離的花生四烯酸增多。再灌注后，花生四烯酸進(jìn)一步代謝成前列腺素類、白三烯類和血小板激活因子，并啟動(dòng)膜脂質(zhì)過氧化，形成脂性自由基，從而促進(jìn)鈣受體通道興奮性氨基酸的釋放。(3)激活蛋白酶、核酸內(nèi)切酶，導(dǎo)致微管解聚，細(xì)胞骨架破壞，從而造成神經(jīng)元死亡。(4)膜蛋白質(zhì)過度磷酸化、神經(jīng)細(xì)胞線粒體滯留鈣作用降低、有神經(jīng)細(xì)胞毒性的興奮性谷氨酸釋放增多，造成神經(jīng)元遲發(fā)性死亡〔4，5〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明鹽酸法舒地爾對(duì)平滑肌的舒張作用可以減輕再灌注導(dǎo)致的損傷，可能通過干預(yù)促凋亡基因表達(dá)而發(fā)揮治療作用。

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R743

A

1005-9202(2012)23-5220-02;

10.3969/j.issn.1005-9202.2012.23.054

李媛媛(1972-)，女，主管護(hù)師，主要從事臨床神經(jīng)疾病研究。

〔2012-03-22收稿 2012-07-10修回〕

(編輯 曲 莉)