循環(huán)腫瘤細(xì)胞在乳腺癌中檢測和應(yīng)用的研究進(jìn)展

鮑慧錚 吳 靖 潘鵬濤 李 慧 紀(jì) 煒 徐 娜 李忠錕 于秀艷

(吉林省腫瘤醫(yī)院內(nèi)五科，吉林 長春 130024)

循環(huán)腫瘤細(xì)胞在乳腺癌中檢測和應(yīng)用的研究進(jìn)展

鮑慧錚 吳 靖1潘鵬濤1李 慧 紀(jì) 煒 徐 娜 李忠錕 于秀艷

(吉林省腫瘤醫(yī)院內(nèi)五科，吉林 長春 130024)

循環(huán)腫瘤細(xì)胞;乳腺癌;轉(zhuǎn)移

在我國，乳腺癌是導(dǎo)致婦女死亡的主要原因之一，其中遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的發(fā)生是導(dǎo)致乳腺癌患者死亡的最主要原因。然而，腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移機(jī)制目前尚不清楚。當(dāng)前，腫瘤檢測手段嚴(yán)重依賴于影像學(xué)和血清標(biāo)志物。基于腫瘤細(xì)胞播散理論，檢測循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTC)有可能早期發(fā)現(xiàn)腫瘤轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)情況。因此，本文就相關(guān)的CTC成像、檢測技術(shù)和近期發(fā)現(xiàn)的CTC特性分子加以概述。

1 CTC概述

1869 年，Ashworth〔1〕發(fā)現(xiàn)癌癥患者血液中存在 CTC，現(xiàn)在腫瘤循環(huán)問題是一個癌癥研究的熱門話題，已廣為認(rèn)同CTCs在腫瘤轉(zhuǎn)移和擴(kuò)散中扮演著重要角色。乳腺癌中CTC檢測和枚舉已建立起一些臨床研究，結(jié)果顯示CTC與降低無進(jìn)展生存率和總生存率在乳腺癌手術(shù)之前和化療后相關(guān)。Cristofanilli等〔2〕研究表明CTC檢測在評估轉(zhuǎn)移性乳腺癌疾病進(jìn)展和生存的重要性。

CTC分析對于晚期癌癥患者是一種很有前景的新診斷領(lǐng)域。然而，由于CTC非常少，且可用的樣本數(shù)量非常有限，這對CTC分析提出了強(qiáng)大的分析和技術(shù)挑戰(zhàn)。最近CTC檢測和表征技術(shù)的進(jìn)步包括RT-qPCR、影像學(xué)、微型濾波器和微芯片設(shè)備。高解析敏感CTC平臺允許監(jiān)測疾病檢測和治療的有效性。

CTCs是新興的腫瘤標(biāo)志物，本質(zhì)上提供一個“流動性”活檢樣本，對有希望的個性化治療進(jìn)行監(jiān)測。此外，CTCs對于理解腫瘤生物學(xué)和腫瘤細(xì)胞傳播是非常好的靶目標(biāo)。CTCs的分子特性提供了一種令人興奮的方法來更好地理解生物學(xué)轉(zhuǎn)移和抗常規(guī)療法，新的治療靶點可由CTCs與腫瘤干細(xì)胞(TSCs)的關(guān)系確定。進(jìn)一步研究CTCs分子特性應(yīng)該有助于更好地理解癌癥患者生物學(xué)的轉(zhuǎn)移性發(fā)展。

2 CTC分離富集和檢測

由于CTC在血液中含量極少，作為小概率事件其遵循泊松分布〔3〕。為了準(zhǔn)確地檢測這些細(xì)胞，高效率和標(biāo)準(zhǔn)化檢測方案是絕對必要的。泊松分布適合于描述單位時間內(nèi)隨機(jī)事件(細(xì)胞)發(fā)生的次數(shù)〔3〕。目前，已經(jīng)開發(fā)出一種采用泊松分布對血液收集和統(tǒng)計分析的模型，此模型運用在CTC分析和檢測的各個步驟中〔3〕。一般來說，CTCs檢測包括兩個主要部分：富集分離和檢測。本文主要介紹當(dāng)前CTC檢測常用方法。

2.1 CTC分離和富集

分離和富集CTCs常用方法是密度梯度離心法和免疫磁珠法，各有利弊。兩種方法的組合檢測技術(shù)已應(yīng)用到CTC檢測，如，CTCs用Ep-CAM抗體磁珠富集后，在外加磁場的作用下從血液中被分離出來。然而，許多研究表明：受腫瘤類型和異質(zhì)性的影響，一些腫瘤細(xì)胞Ep-CAM表達(dá)缺失，采用此種方法進(jìn)行陽性篩選可能會產(chǎn)生誤差〔4～6〕。

2.1.1 免疫磁珠富集分離法 該方法的基本原理是腫瘤細(xì)胞表明的特異性抗原能與連接磁珠的相對應(yīng)抗體相結(jié)合，繼而在外加磁場作用下相應(yīng)的抗原抗體復(fù)合物被磁珠吸附而停留在磁場中，而表面不表達(dá)該抗原的細(xì)胞由于不能與連有磁珠的單抗特異性結(jié)合而沒磁性，不能滯留在磁場中，進(jìn)而使腫瘤細(xì)胞進(jìn)行富集和分離。目前，大多數(shù)CTCs檢測采用陽性分方法，它基于腫瘤細(xì)胞表明特異性表達(dá)的EpCAM抗體而進(jìn)行的〔4〕。然而，一些低表達(dá)或不表達(dá)EpCAM的腫瘤細(xì)胞無法采用此方法進(jìn)行分離。因此，評價CTCs作為乳腺癌預(yù)后標(biāo)志物時，應(yīng)包含EpCAM陽性和陰性兩種亞種類〔5〕。最近研究結(jié)果表明，與其乳腺癌亞型相比，一些形態(tài)類似正常細(xì)胞的乳腺癌細(xì)胞株不表達(dá)EpCAM表達(dá)，因此基于EpCAM抗體的捕獲技術(shù)檢測不到這種細(xì)胞〔6〕。Mostert等〔7〕發(fā)現(xiàn)在乳腺癌患者中聯(lián)合使用 CD146和抗-EpCAM兩種標(biāo)志物，可提高CTC檢測效率。Schindlbeck等〔8〕研究表明，使用抗-CD176標(biāo)志物，可提高腫瘤細(xì)胞檢出率。Deng等〔9〕介紹一種高靈敏度和穩(wěn)定性的富集方法，它基于一個標(biāo)志物抗角質(zhì)蛋白(CK)或聯(lián)合抗CK和抗EpCAM兩個標(biāo)志物。這個方法使用Ariol?system(Genetix USA)在玻璃載玻片上對CTCs自動成像采集、分析。

2.1.2 微流體技術(shù) 該方法的基本原理是在微流體裝置的微柱上固定特異性抗體(如EpCAM抗體)，通過控制流速和剪切力的大小，將血液中的腫瘤細(xì)胞從血液富集到微流體芯片上。分離規(guī)模上皮腫瘤細(xì)胞(ISET)系統(tǒng)是基于過濾以分離人的上皮腫瘤細(xì)胞，因為其尺寸比外周血白細(xì)胞大。熒光原位雜交是使用ISET對腫瘤細(xì)胞的染色體進(jìn)行收集與分析，與基于聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)遺傳分析一樣，可應(yīng)用ISET分離細(xì)胞〔10〕。

Lin等〔11〕發(fā)明了一種便攜式過濾器的微型裝置，既是一個檢測分析平臺，又能多路復(fù)用成像和遺傳分析，并有潛力使常規(guī)CTC分析有效管理臨床的癌癥患者。據(jù)報道，這個裝置是基于人類血細(xì)胞和CTC大小區(qū)別，在10 min能捕獲大約90%的CTC。他們還發(fā)展和驗證了一個新穎的三維微過濾裝置，可富集血液的CTC活細(xì)胞數(shù)。該設(shè)備在用于研究、臨床環(huán)境評估和描述濃縮CTC中提供了一個非常有價值的工具〔12〕。

已開發(fā)了通過使用抗體涂布微柱捕獲表達(dá)EpCAM的外周血細(xì)胞的一個被稱為CTC芯片的微流體裝置〔13〕。最近，同樣的組織已開發(fā)了一種高通量微流體混合裝置提供了一個增強(qiáng)的平臺分離CTC的人字形芯片〔14〕。通過使用一定數(shù)量的腫瘤細(xì)胞，對照血清來確認(rèn)高效的細(xì)胞捕獲，在臨床實用程序已被前列腺癌患者的標(biāo)本所證明。另一個新穎的微流體設(shè)備已被證明可以在很短時間內(nèi)選擇性地和特異地分離極其少量的CTCs〔15〕。最近有發(fā)明利用表面增強(qiáng)拉曼光譜(SERS)，直接測量針對性的CTC出現(xiàn)的白細(xì)胞〔16〕。SERS納米粒子與表皮生長因子肽作為目標(biāo)配位體已經(jīng)成功地確定CTC患者的外周血液中。

2.2 CTC檢測系統(tǒng)

最近的CTC檢測和表征技術(shù)進(jìn)步包括：(a)基于圖像的方法，如經(jīng)典的免疫細(xì)胞化學(xué)(ICC)，美國食品和藥物管理局(FDA)批準(zhǔn)的CellSearch?系統(tǒng)(Veridex)，Ariol系統(tǒng)，鐳射掃描細(xì)胞計數(shù)器;(b)分子學(xué)測定以核酸為基礎(chǔ)分析CTC，如高度敏感的RT-qPCR方法、RT-PCR檢測，或結(jié)合分子和成像方法;(c)蛋白質(zhì)化驗，如EpiSpot測定，檢測CTC釋放的腫瘤特異性蛋白。檢測抗CK抗體是目前最確認(rèn)和標(biāo)準(zhǔn)化的方法，它還允許從形態(tài)上解釋陽性事件。

這些方法的主要區(qū)別是檢測CTCs的方法不同。影像學(xué)方法是通過熒光標(biāo)記的抗體主要是抗上皮細(xì)胞抗原例如CK-19征隔離的CTCs。因此，有限數(shù)量的其他蛋白質(zhì)標(biāo)記也被用于檢測。相反，分子學(xué)測定主要是根據(jù)基因表達(dá)分析CTCs。通過使用這種方法，可通過高度敏感的檢測上皮標(biāo)記(例如CK-19)證明一個小數(shù)量的CTCs存在數(shù)百萬外周血單核細(xì)胞。分子學(xué)測定不能用于準(zhǔn)確估計一個樣本呈現(xiàn)的CTC數(shù)量;然而，大量的分子標(biāo)記(例如，基因表達(dá)，DNA突變)中可檢測到CTC，使利用CTC的分子特性可行。這些方法彼此互補(bǔ)，因為他們體現(xiàn)CTC不同的信息。

2.2.1 基于影像學(xué)的方法 檢測腫瘤細(xì)胞傳播利用經(jīng)典的ICC技術(shù)，通常由訓(xùn)練有素的病理學(xué)家通過視覺觀察彩色CK陽性的上皮CTCs，許多樣品分析可能耗費數(shù)個小時。Pachmann等〔17〕通過使用一個快速、定量自動微觀程序，允許多達(dá)10個篩選1 000倍濃縮的鐳射掃描細(xì)胞計數(shù)器已量化最小數(shù)量的腫瘤細(xì)胞。

美國FDA批準(zhǔn)使用的CellSearch系統(tǒng)(Veridex)〔2〕是基于ICC和免疫熒光的組合，為CTC使用特定的標(biāo)記，如CKs(主要是CK19);白細(xì)胞，如CD45;細(xì)胞活力，如二脒基苯基吲哚(DAPI)核染色陽性。CellSearch?系統(tǒng)檢測CTC已通過嚴(yán)格的臨床測試項目驗證。這種技術(shù)在乳腺癌中已產(chǎn)生了大量的CTC臨床預(yù)后的相關(guān)性數(shù)據(jù)。最近，Sieuwerts等〔18〕研究了由CellSearch確定定義的5個人乳腺癌細(xì)胞亞型的全球基因表達(dá)圖譜〔正常像、基底、人類表皮生長因子受體2(HER2)陽性，細(xì)胞腔的A和B〕。

Balic等〔19〕已開發(fā)出了一種多標(biāo)記的圖像分析技術(shù)運用新奇的DyLight技術(shù)方法。這種成像方法是基于使用多重抗體〔也就是抗 CK、Her2/神經(jīng)膜，乙醛脫氫酶1(ALDH1)、CD44、CD24〕標(biāo)記不同顏色的熒光染料和光譜圖像分析分離不同顏色光譜。這個技術(shù)有助于檢測和描述表征浸潤性腫瘤細(xì)胞，用額外的標(biāo)記可評估不同的亞種群表達(dá)的特定治療靶目標(biāo)。

2.2.2 CTC的分子學(xué)測定檢測 分子學(xué)測定利用分析的極敏感、特異性的PCR來檢測和枚舉CTC。利用PCR檢測的優(yōu)點是產(chǎn)量很高，容易執(zhí)行。首先從CTCs分離的總RNA，隨后的RT-PCR擴(kuò)增腫瘤和上皮的特定靶目標(biāo)。重要的是，RT-qPCR檢測可設(shè)計在電子信息學(xué)中，這樣就很容易自動化，并受到內(nèi)部和外部質(zhì)量控制系統(tǒng)〔20〕。

鑒于大背景的循環(huán)細(xì)胞，它可能需要從超過106個白細(xì)胞中檢測到一個癌細(xì)胞。雖然RT-PCR的潛在敏感和特異性分析足以達(dá)到這一目的，但這將需要使用適當(dāng)?shù)膍RNA標(biāo)記。這種方法的唯一缺點是不能夠準(zhǔn)確估計一個樣本的CTCs數(shù)量。一個主要優(yōu)勢是其分子學(xué)方法的靈活性，特別是這些多路化驗減少了所需的樣本數(shù)量、時間和分析成本。

識別特定亞型的CTCs基于不同基因表達(dá)，這可提供有關(guān)腫瘤轉(zhuǎn)移和改善病人的臨床治療，這些方法用于確定CTC必須檢測所有腫瘤細(xì)胞類型。然而，事實上CTC非常少，可用的樣本數(shù)量非常有限，所以這是一個巨大的分析和技術(shù)挑戰(zhàn)〔21，22〕。Obermayr等〔23〕表明，在乳腺癌中用RT-qPCR檢測CTCs的一組6個基因優(yōu)于EpCAM和乳腺珠蛋白(hMAM)，這些基因在子宮內(nèi)膜、宮頸癌和卵巢癌癥中可能成為潛在的CTC檢測標(biāo)志物。Reinholz等〔24〕表明，循環(huán)上皮細(xì)胞 SCGB2A2(mammaglobin)和B305D-C的分子特性提供了潛在的早期檢測浸潤性乳腺癌的可能。最近，Aktas等〔25〕使用商品試劑盒(AdnaTest Breast Cancer，AdnaGen AG)，檢測到 EpCAM、附膜蛋白(MUC)1 和HER2在CTC中的轉(zhuǎn)錄，在轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者發(fā)現(xiàn)大量CTCs，表明它具有上皮到間充質(zhì)過渡(EMT)和腫瘤干細(xì)胞的特征。有趣的是，當(dāng)用RT-PCR檢測來評估在 CTC中雌激素受體(ER)和孕激素受體(PR)表達(dá)時，CTC傳播的主要發(fā)現(xiàn)是三陰腫瘤細(xì)胞，一般CTC發(fā)現(xiàn)大多是三陰，且與原發(fā)性腫瘤的ER、PR和HER2狀態(tài)無關(guān)〔26〕。幾個mRNA標(biāo)記可用于基于 RTPCR的CTC檢測。幾個單獨標(biāo)記提供足夠的靈敏度，但標(biāo)志物組合產(chǎn)生提高CTC檢出率。在早期乳腺癌中通過使用一個多標(biāo)記的 RT-PCR 檢測 CTC，Ignatiadis等〔27〕已表明 KRT19、SCGB2A2(乳腺珠蛋白)和ERBB2(HER-2)陽性與無病生存期較短相關(guān)。

Markou等〔28〕最近開發(fā)了一種多路復(fù)用PCR耦合的液珠陣列檢測多種基因在CTCs中的表達(dá)。使用這種方法，建立了6個 CTC基因靶目標(biāo)〔ERBB2;SCGB2A2(乳腺珠蛋白);KRT19;黑色素瘤抗原的家族1(MAGEA1);TWIST-1和HMBS(也被稱作PBGD)〕，同時在一個非常有限的樣本中放大和檢測相同反應(yīng)，從而節(jié)約寶貴的CTC樣本并減少成本和時間分析。研究了100個基因在CTC中的表達(dá)并形成一個有效的基礎(chǔ)、多路復(fù)用的方法。

2.2.3 上皮細(xì)胞免疫斑點(EPISPOT)測定 EPISPOT測定被開發(fā)來檢測CTC釋放的腫瘤特異性蛋白。根據(jù)這種分析的結(jié)果，有活性的上皮腫瘤細(xì)胞釋放全長的CK19，釋放CK19的細(xì)胞可能構(gòu)成具有高轉(zhuǎn)移性的乳腺癌細(xì)胞的子問題〔29〕。

3 CTC在乳腺癌中的臨床應(yīng)用

Cristofanilli等〔2〕研究提示在轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者中，治療之前的CTC數(shù)量是一個獨立的預(yù)后指標(biāo)。使用CellSearch系統(tǒng)檢測177例轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者7.5 ml外周血中CTC數(shù)量，發(fā)現(xiàn)CTC數(shù)≥5個或者＜5個時，患者無進(jìn)展生存期和總生存率有統(tǒng)計學(xué)差異，CTC數(shù)＞5個時，病人復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的可能性增大。因此認(rèn)為CTC數(shù)量可作為乳腺癌無進(jìn)展生存率、總體生存率和判斷預(yù)后的獨立預(yù)測指標(biāo)。Budd等〔30〕應(yīng)用CellSearch系統(tǒng)，通過和影像學(xué)對比，評價CTC預(yù)測總體生存期的作用。結(jié)果表明CTC比影像學(xué)方法可更早、重復(fù)地預(yù)示疾病狀態(tài)，CTC水平和總體生存期有更好的相關(guān)性。Ntoulia等〔31〕多因素分析結(jié)果顯示Mammaglobin A-mRNA陽性細(xì)胞是一個獨立的危險因素，應(yīng)用巢式RT-PCR法檢測101例可行手術(shù)的早期乳腺癌和39例轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者外周血中Mammaglobin A-mRNA陽性細(xì)胞的表達(dá)。對照組檢出率為0，早期乳腺癌組13.9%，轉(zhuǎn)移性乳腺癌組17.9%。

CTC分子特性將提供重要的信息進(jìn)行識別和理解治療靶點抗療法，進(jìn)一步研究CTC分子特性將有助于更好地了解癌癥患者腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移性。CTC檢測可能成為一個有價值的方法來改善癌癥患者預(yù)后。

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R737.9

A

1005-9202(2012)23-5347-04;

10.3969/j.issn.1005-9202.2012.23.137

吉林省衛(wèi)生廳科研課題(No.2010Z086);吉林省自然科學(xué)基金項目(201215215)

1 東北師范大學(xué)生命科學(xué)院

鮑慧錚(1969-)，女，博士，主任醫(yī)師，主要從事淋巴血液腫瘤研究。

〔2012-03-11收稿 2012-07-05修回〕

(編輯 張 慧)