王彩云, 楊世華

(昆明理工大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院, 云南 昆明 650500)

MicroRNAs與多潛能干細(xì)胞的研究進(jìn)展

王彩云, 楊世華*

(昆明理工大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院, 云南 昆明 650500)

microRNAs (miRNAs)是一類內(nèi)源性非編碼小 RNA, 通過調(diào)控基因表達(dá)來參與生命過程中的一系列重要進(jìn)程。越來越多的證據(jù)表明, miRNAs參與了幾乎所有生物代謝過程, 其胚胎干細(xì)胞的自我更新與分化和在多能干細(xì)胞(iPSCs)中的誘導(dǎo)調(diào)節(jié)作用也日益受到關(guān)注。該文介紹了miRNAs的生成、檢測方法以及miRNAs對胚胎干細(xì)胞(ESCs)及誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞的調(diào)控作用, 并對miRNAs的應(yīng)用前景進(jìn)行了展望。

miRNAs; miRNAs檢測; 胚胎干細(xì)胞; 誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞

微小核糖核酸 (microRNAs, miRNAs)是細(xì)胞內(nèi)一類長度在20～25 nt的非編碼單鏈RNA, 廣泛存在于真菌和動(dòng)、植物中, 在物種進(jìn)化過程中高度保守。它的表達(dá)既具有時(shí)空特異性, 也具有組織和細(xì)胞特異性。編碼miRNAs的序列可以位于編碼或是非編碼基因的內(nèi)含子或者外顯子附近, 也可以位于基因之間(Bartel, 2004; Rodriguez et al, 2004)。絕大部分miRNAs是在細(xì)胞核內(nèi)由RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄生成(Kim, 2005), 其成熟先后在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中完成, 其中Dicer 1和DGCR 8是miRNAs成熟過程中兩個(gè)重要基因(Ghildiyal & Zamore, 2009)。miRNAs成熟后與Argonautel (AGO1)蛋白結(jié)合形成RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體(RNA-induced silencing complex, RISC), 通過與靶 mRNAs的 3′非翻譯區(qū)(3′UTR)配對降解mRNA或抑制mRNA的翻譯, 從而在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控蛋白表達(dá), 行使其多樣的生物學(xué)功能(Tolia & Joshua-Tor, 2007)。最新研究表明，miRNAs也能在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控基因表達(dá)。

在生物體內(nèi), 雖然 miRNAs的作用是特異的,但靶點(diǎn)特異性并不強(qiáng), 往往一個(gè) miRNA可以靶向多個(gè)mRNA，而一個(gè)mRNA也可能是多個(gè)miRNAs的靶標(biāo), 這樣就形成了以miRNAs為主的龐大調(diào)控網(wǎng)絡(luò), 從而從整體上調(diào)控生物體的生理進(jìn)程(Tiscornia & Izpisúa Belmonte, 2010; Zhang & Wen,2010; Huang et al, 2008)。

1 miRNAs的檢測方法

miRNAs檢測方法的快速發(fā)展為研究其功能提供了良好的平臺。目前miRNAs檢測一般是基于核酸雜交與擴(kuò)增的原理, 主要有Northern印跡、實(shí)時(shí)定量PCR、微陣列芯片等3種方法。Northern印跡技術(shù)一直被應(yīng)用于miRNAs的鑒定和miRNAs的發(fā)現(xiàn), 是目前 miRNAs檢測中最常用的方法, 通常被用來作為新技術(shù)可靠性的驗(yàn)證手段; 實(shí)時(shí)定量PCR主要用于定量檢測 miRNAs, 具有靈敏度高、線性范圍寬、特異性好、重復(fù)性佳等特點(diǎn), 可以滿足大多數(shù)miRNAs在組織和細(xì)胞中表達(dá)水平的研究; 微陣列芯片(microaaray)是實(shí)現(xiàn) miRNAs表達(dá)圖譜分析和多種miRNAs高通量同時(shí)檢測的主要技術(shù), 一般用于miRNAs的初篩實(shí)驗(yàn)。另外, 利用高通量測序(High Throughput Sequencing)能在無需任何序列信息的前提下研究microRNA的表達(dá)圖譜, 還可發(fā)現(xiàn)和鑒定新的microRNA分子(Schulte et al, 2010)。此外, 還有很多不同的檢測手段也常用于 miRNAs的檢測，如Chapin & Doyle (2011)報(bào)道了利用滾環(huán)擴(kuò)增(RCA)在編碼的凝膠微粒上對亞飛摩爾(sub-femto molar, 即<10-15M)量級的 miRNA 進(jìn)行多重定量檢測, 且能達(dá)到單分子的分辨率。該方法可以對極少量血清中的miRNAs進(jìn)行直接檢測而不需要提取RNA。Harcourt & Kool (2012)利用滾環(huán)擴(kuò)增檢測miRNAs時(shí), 首次通過化學(xué)方式使Q-STAR探針自動(dòng)成環(huán), 而不需要使用單獨(dú)的連接酶進(jìn)行環(huán)化反應(yīng), 這在一定程度上降低了實(shí)驗(yàn)的復(fù)雜性和成本。這些新的檢測技術(shù)不斷被開發(fā), 為miRNAs的檢測提供了新的思路。

2 miRNAs調(diào)控胚胎干細(xì)胞的命運(yùn)

胚胎干細(xì)胞(ESCs)具有無限自我更新以及分化成任何特定類型細(xì)胞的能力, 表達(dá)著一套獨(dú)特的、與細(xì)胞快速增殖和周期進(jìn)展相關(guān)的 miRNAs。這些miRNAs主要包括miR-302/367家族(miR-302a/b/c/d和miR-367)(小鼠)；miR-290-295家族(miR-290/291a/291b/292/293/294和miR-295)和miR-371-373家族(miR-371/372/373)(人類)。研究ESCs的關(guān)鍵問題之一是了解其干性(stemness)維持和分化的機(jī)制, 最近研究表明, miRNA在調(diào)控胚胎干細(xì)胞自我更新和分化方面發(fā)揮著重要作用。

2.1 miRNAs控制ESCs增殖

目前認(rèn)為, miRNAs可以通過作用于細(xì)胞周期抑制因子, 來維持胚胎干細(xì)胞特殊的細(xì)胞周期進(jìn)程。胚胎干細(xì)胞的細(xì)胞周期特殊性在于, 其 G1期非常短, 且缺失G1/S關(guān)卡。這就使得它可以無限制地由G1期向S期轉(zhuǎn)變, 進(jìn)而快速增殖。然而，隨著胚胎干細(xì)胞的分化, G1/S關(guān)卡也就隨之恢復(fù)。參與ESCs細(xì)胞周期調(diào)控的miRNA被稱之為“胚胎干細(xì)胞調(diào)控型 miRNA(embryonic stem cell cycle regulating miRNA, ESCC miRNA)”。

研究發(fā)現(xiàn), 一些miRNAs在胚胎干細(xì)胞中會優(yōu)先表達(dá)，如miR-290家族在未分化小鼠ESCs中高度表達(dá), 其表達(dá)水平隨著 ESCs的分化而迅速下降(Houbaviy et al, 2003), 這些miRNAs可以促進(jìn)細(xì)胞由G1期向S期轉(zhuǎn)變, 從而加速ESCs增殖 (Wang et al, 2008; Lichner et al, 2011), 具有維持ESCs多能性的作用。在小鼠ESCs中, 由于缺少cyclin D-Cdk4/6復(fù)合物, G1期向S期的轉(zhuǎn)變主要由cyclin E-Cdk2信號通道調(diào)控。而miR-291a-3p、miR-291b-3p、miR-294、miR-295和miR-302d可以通過直接靶向cyclin E-Cdk2信號通道的抑制因子p21、p130(Rb12)和Lats2來激活 cyclin E-Cdk2通道(Wang et al,2008)。另外一些研究則表明, 在人類的ESCs中, 如果將miR-17-92家族成員miR-92b下調(diào), 會導(dǎo)致細(xì)胞停留在G1期, 而上調(diào)miR-92b, 則會促進(jìn)細(xì)胞由G1期向S期轉(zhuǎn)變。進(jìn)一步的研究證明,miR-92b是通過靶向G1/S關(guān)卡抑制因子p57, 來調(diào)節(jié)細(xì)胞周期進(jìn)程的(Sengupta et al, 2009)。此外, 相關(guān)的文獻(xiàn)也證實(shí)miR-372可以靶向 G1/S關(guān)卡限制因子Cdkn1a,miR-195能通過靶向G2/M關(guān)卡限制因子WEE1, 來調(diào)控ESCs的細(xì)胞周期進(jìn)程(Qi et al, 2009)。

另外, miRNAs可以通過與相關(guān)基因作用來維持 ESCs的多能性，如 Marson et al (2008)證實(shí)miR-290家族的啟動(dòng)子受到胚胎干細(xì)胞內(nèi)特異的轉(zhuǎn)錄因子Nanog、Oct4、Sox2的調(diào)控, 并且可以穩(wěn)定Oct4的表達(dá), 通過重新進(jìn)行 DNA甲基化而調(diào)節(jié)ESCs的干性維持。同樣, miR-302-367家族的啟動(dòng)子受ESCs內(nèi)特異性的轉(zhuǎn)錄因子Nanog、Otc3/4、Sox2和Rex1的調(diào)控(Barroso-delJesus et al, 2008), 不僅能與靶基因cyclin D1和Cdk4作用, 調(diào)節(jié)ESCs的細(xì)胞周期進(jìn)程 (Card et al, 2008), 而且可以與靶基因NR2F2(Rosa & Brivanlou, 2011)和Lefty(Barroso-DelJesus et al, 2011)作用, 對ESCs的早期分化產(chǎn)生抑制, 從而維持其多能性。

2.2 miRNAs控制ESCs分化

ESCs在定向分化過程中會開啟兩個(gè)重要的程序, 包括關(guān)閉胚胎干細(xì)胞的自我更新程序, 以及激活組織特異性的定向分化程序。最近研究發(fā)現(xiàn), 將let-7導(dǎo)入GDCR8蛋白缺失的未分化的ESCs中, 可以有效抑制ESCs中的自我更新程序。同時(shí)，這種抑制也可以被 ESCC miRNA逆轉(zhuǎn), 表明let-7和ESCC miRNA之間是可以互動(dòng)的。這就提供了一個(gè)能夠支配細(xì)胞命運(yùn)的機(jī)制。在進(jìn)一步的研究中, 發(fā)現(xiàn)let-7能抑制c-Myc、Sall4、Lin28和下游靶基因Sox2、Oct4、Nanog的表達(dá)；而將let-7導(dǎo)入野生型ESCs中, 則未能誘導(dǎo) ESCs的分化, 表明 ESCC miRNA能拮抗Let-7的分化作用(Melton et al, 2010)。

除let-7以外, 還存在其他調(diào)控 ESCs分化的miRNAs，如在小鼠 ESCs中,miR-200c、miR-203以及miR-183共同抑制多能性因子Sox2和Klf4。當(dāng)將這些miRNAs導(dǎo)入ESCs中時(shí), 會降低ESCs的自我更新能力(Wellner et al, 2009)。還有研究表明，miR-145在人類ESCs中會抑制Sox2、Oct4和Klf4的表達(dá), 從而抑制 ESCs的自我更新能力。當(dāng)導(dǎo)入反義寡核苷酸抑制miR-145表達(dá)時(shí), 人類ESCs就會恢復(fù)自我更新能力(Xu et al, 2009)。另外,miR-371-3的表達(dá)與人類ESCs向神經(jīng)細(xì)胞分化潛能則呈負(fù)相關(guān)。當(dāng)將Klf4基因轉(zhuǎn)導(dǎo)至神經(jīng)細(xì)胞中提高miR-371-3的表達(dá)時(shí),Klf4轉(zhuǎn)導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞顯示出多能標(biāo)記物表達(dá)的改變, 相反, 若在Klf4轉(zhuǎn)導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞中抑制miR-371-3的表達(dá)，則可恢復(fù)其神經(jīng)性分化傾向。這些均表明，miR-371-3有可能在人類多能干細(xì)胞神經(jīng)性分化行為過程中發(fā)揮關(guān)鍵性作用(Kim et al, 2011)。最近, Boissart et al (2012)通過抑制人類 ESCs中 TGFβ信號通道證明了miR-125的兩亞型(miR-125a和miR-125b)參與了人類 ESCs分化為神經(jīng)細(xì)胞系的過程。功能分析表明,miR-125通過靶向抑制核心信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子SMAD4的表達(dá),從而促進(jìn)了人類ESCs向神經(jīng)前體細(xì)胞的轉(zhuǎn)變。

有研究發(fā)現(xiàn), miRNAs還存在另一種控制胚胎干細(xì)胞種系分化決定過程的機(jī)制, 即某些組織特異性miRNAs能通過抑制或促進(jìn)胚胎干細(xì)胞分化為特定的細(xì)胞系, 顯示出miRNAs的網(wǎng)絡(luò)調(diào)控能力，如在心肌細(xì)胞發(fā)育過程中特異表達(dá)的miR-1和miR-133受到相同上游基因的調(diào)控； 但是它們在控制中胚層向心肌細(xì)胞分化過程中的作用卻不一致(Ivey et al, 2008)。

3 miRNAs與誘導(dǎo)多能干細(xì)胞

誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(iPSCs)首先是由 Takahashi &Yamanaka在2006年利用轉(zhuǎn)錄因子Oct4、Sox2、Klf4和Myc實(shí)現(xiàn)的, 雖然他們得到的細(xì)胞與真正的ESCs相比還存在著許多差異, 但是這一研究開創(chuàng)了利用少數(shù)幾個(gè)因子來誘導(dǎo) iPSCs產(chǎn)生的先例(Takahashi & Yamanaka, 2006)。隨后, Yu et al (2007)利用Oct4、Sox2、Nanog和Lin28誘導(dǎo)體細(xì)胞產(chǎn)生了iPSCs, 其中Lin28會抑制少數(shù)pri-miRNA的成熟(Viswanathan et al, 2008), 這意味著, 胚胎干細(xì)胞特異性miRNAs可能適用于體細(xì)胞的重新編程。

近年來, 科學(xué)家開始嘗試應(yīng)用miRNAs與轉(zhuǎn)錄因子共同誘導(dǎo)體細(xì)胞重編程，如 Judson et al (2009)利用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體用不同的 miRNAs和Oct4、Sox2、Klf4一起轉(zhuǎn)染小鼠胚胎成纖維細(xì)胞, 發(fā)現(xiàn)重編程效率顯著提高, 其中miR-294對重編程效率影響最大, 使iPSCs產(chǎn)生效率從0.01%～0.05%提高到了0.4%～0.7%。Lin et al (2011)利用誘導(dǎo)性miR-302表達(dá)系統(tǒng)研究miR-302表達(dá)量對重編程的影響時(shí)發(fā)現(xiàn), 當(dāng)miR-302在人類毛囊細(xì)胞(hHFCs)的表達(dá)量超過胚胎干細(xì)胞H1和H9亞型表達(dá)量的1.3倍時(shí)就可以誘導(dǎo)其重編程。miR-302的靶基因包括4個(gè)遺傳調(diào)控因子AOF2、AOF1、MECP1-p66和MECP2,沉默AOF2將導(dǎo)致DNMT1的失活并增強(qiáng)其去甲基化過程, 從而提高h(yuǎn)HFCs重編程效率。近期Liao et al (2011)通過把miR-106a-363家族、miR-302-367家族和3個(gè)外源性因子(Oct4、Sox2、Klf4)一起轉(zhuǎn)染小鼠胚胎成纖維細(xì)胞可以顯著提高iPSCs的產(chǎn)生效率。其中miR-302-367家族通過靶向TGFβ-receptor 2來促進(jìn) E-cadherin的表達(dá), 從而加速間充質(zhì)向上皮轉(zhuǎn)化(mesenchymal-to-epithelial transition, MET)。另外,miR-93及其家族成員也可以通過抑制TGFβ-receptor 2加速 MET過程, 進(jìn)而提高誘導(dǎo)小鼠iPSCs形成的效率(Li et al, 2011)。上述研究結(jié)果均表明，ESCs特異性 miRNAs的表達(dá)能促進(jìn)細(xì)胞重新編程。

有趣的是, 通過抑制組織特異性miRNAs表達(dá)也能促進(jìn)iPSCs的形成。Rybak et al (2008)將let-7反義引物抑制劑和Sox2、Oct4、Klf4瞬時(shí)轉(zhuǎn)染小鼠胚胎成纖維細(xì)胞后, 重編程效率提高了 4.3倍。另外, 近年來發(fā)現(xiàn)，p53信號途徑對細(xì)胞重編程具有阻礙作用, 抑制或敲除p53可以促進(jìn)細(xì)胞重編程效率(Banito et al, 2009; Kawamura et al, 2009)。Choi et al (2011)證實(shí)miR-34家族，尤其是其成員miR-34a以p53依賴性方式參與了對體細(xì)胞重編程的調(diào)控。不同于p53缺陷在提高重編程效率的同時(shí)導(dǎo)致生成的iPSCs喪失了多潛能性,miR-34a基因敲除不僅可以促進(jìn)小鼠體細(xì)胞重編程為iPSCs, 且生成的iPSCs維持了自我更新或分化能力。進(jìn)一步分析表明,miR-34a有可能是通過負(fù)調(diào)控Nanog、Sox2和Mycn基因而發(fā)揮重編程抑制效應(yīng)的。此外, 研究人員還證實(shí)miR-34家族的另外兩個(gè)成員miR-34b和miR-34c也對體細(xì)胞重編程有抑制效應(yīng)。

最近研究證明, miRNAs具有直接誘導(dǎo)體細(xì)胞重編程的能力, 且其效率高于利用轉(zhuǎn)錄因子Sox2、Oct4、Klf4和Myc進(jìn)行的體細(xì)胞重編程, 致瘤性低。Anokye-Danso et al (2011)利用慢病毒載體導(dǎo)入miR-302b/302c/302a/302d/367cluster和丙戊酸, 成功將小鼠胚胎成纖維細(xì)胞以及人成纖維細(xì)胞重編程為 iPSCs, 這是科學(xué)家首次未使用 4個(gè)轉(zhuǎn)錄因子制造出的 iPSCs。與之前誘導(dǎo)重編程方法相比, 這種新方法將重編程效率提高了100倍以上。有趣的是, 重編程鼠類細(xì)胞時(shí)丙戊酸是必須的, 但單獨(dú)用miR-302/367就能有效地重編程人類細(xì)胞。組蛋白脫乙?；?Hdac2)的作用可以部分解釋產(chǎn)生這種差異的原因。有研究指出，Hdac2的功能是細(xì)胞重編程的一個(gè)重要障礙, 而丙戊酸可以破壞 Hdac2。小鼠成纖維細(xì)胞中Hdac2的表達(dá)水平明顯高于人類的成纖維細(xì)胞, 說明丙戊酸通過抑制Hdac2的功能而促進(jìn)小鼠iPSCs的形成。另外, Miyoshi et al (2011)對小鼠脂肪基質(zhì)細(xì)胞(mASCs)中miRNAs表達(dá)圖譜進(jìn)行分析, 發(fā)現(xiàn)相對于mASCs, 小鼠ESCs和iPSCs中mir-200c、mir-302家族及mir-369家族呈高水平表達(dá)。將這3個(gè)家族miRNAs導(dǎo)入到mASCs中后,發(fā)現(xiàn) mASCs可以重編程為 iPSCs。同時(shí)，這些miRNAs介導(dǎo)的iPSCs能夠表達(dá)未分化ESCs的特征性基因。當(dāng)研究人員將相同的miRNAs導(dǎo)入到人類脂肪基質(zhì)細(xì)胞及皮膚纖維細(xì)胞中, 這些 miRNAs同樣能夠誘導(dǎo)人類體細(xì)胞重編程為iPSCs。此外, 直接轉(zhuǎn)染成熟的雙鏈miR-200c、miR-302家族及miR-369家族, 這在一定程度上減少了腫瘤發(fā)生的可能性和增強(qiáng)了安全性, 在臨床治療上會更加可靠。由此看來, 利用miRNA誘導(dǎo)iPSCs可能是一種理想的方法。

4 展 望

miRNAs的發(fā)現(xiàn), 為我們研究生物體生長發(fā)育、分化調(diào)控以及iPSCs提供了強(qiáng)有力的工具和全新的研究思路。雖然對miRNAs的研究取得了較大進(jìn)展(Wang et al, 2012), 但仍然面臨著很多問題。首先,miRNAs的檢測手段存在自身優(yōu)點(diǎn)的同時(shí)也或多或少存在不足。高靈敏度、高通量、高特異性的檢測技術(shù)將更好地推動(dòng)miRNAs的發(fā)展。其次, 被證實(shí)的和明確功能的miRNAs的數(shù)量還很少, 其在各個(gè)生命活動(dòng)中所扮演的角色尚未完全明了。尋找調(diào)控的 miRNAs基因以及 miRNAs的靶基因, 揭示miRNAs具體的作用機(jī)制尤為重要。再次, 考慮到臨床應(yīng)用的安全性和效率, 研究非介入型的miRNA載體和（或）直接的轉(zhuǎn)染技術(shù)將成為研究者接下來要解決的重要任務(wù)之一。

隨著研究的不斷深入, 人們對miRNAs控制網(wǎng)絡(luò)的認(rèn)識必將越來越全面, 對其功能和作用機(jī)制的了解也將會更加透徹。我們可以相信, miRNAs必將為生命科學(xué)的研究和生物醫(yī)學(xué)的發(fā)展等方面帶來更為深遠(yuǎn)的影響。

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Research on MicroRNAs in pluripotent stem cells

WANG Cai-Yun, YANG Shi-Hua*

(Faculty of Life Science and Technology,Kunming University of Science and Technology,Kunming650500,China)

MicroRNAs (miRNAs) are a newly identified class of small regulatory non-coding endogenous RNAs that take part in a series of important processes by regulating gene expression. Recent studies have provided evidence that miRNAs may be involved in nearly all biological and metabolic processes, especially influencing self-renewal and differentiation of embryonic stem cells (ESCs) and induced pluripotent stem cells (iPSCs). In this review, we briefly summarize the biological characteristics of miRNAs, the detection technologies, and the role of miRNAs regulation in ESCs and iPSCs to frame a discussion on the future prospects of miRNA research.

miRNAs; miRNAs detection; ESCs; iPSCs

Q522; Q813

A

0254-5853-(2012)04-0416-05

10.3724/SP.J.1141.2012.04416

2012-03-19；接受日期：2012-06-21

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31071279); 云南省科技創(chuàng)新人才計(jì)劃項(xiàng)目(2011CI009)?

Corresponding author)，E-mail: yangsh@kmust.edu.cn

王彩云, 女, 碩士, E-mail：seeyun2010@163.com