苗永旺, 哈 福 , 高華山, 袁 峰, 李大林, 袁躍云

(1. 云南農業(yè)大學 動物科學技術學院分子遺傳學實驗室, 云南 昆明 650201; 2. 云南省家畜改良工作站, 云南 昆明 650225)

水牛、大額牛和牦牛抑制素α亞基編碼基因外顯子1多態(tài)性分析

苗永旺1,#,*, 哈 福1,#, 高華山1, 袁 峰1, 李大林2, 袁躍云2

(1. 云南農業(yè)大學 動物科學技術學院分子遺傳學實驗室, 云南 昆明 650201; 2. 云南省家畜改良工作站, 云南 昆明 650225)

為了揭示牛科物種INHA基因的遺傳特征, 該文采用PCR產物直接測序法對水牛、大額牛和牦牛INHA基因外顯子1及其側翼序列進行多態(tài)性檢測, 并結合已發(fā)表的包括?？莆锓N在內的一些哺乳動物數據進行了比較分析。結果表明, 在水牛INHA基因外顯子1中存在c.73C>A替換, 為同義替換, 河流型和沼澤型水牛編碼產物一致; 在大額牛的INHA基因外顯子1中發(fā)現c.62 C>T、c.187 G>A替換, 分別引起INHA中氨基酸發(fā)生p. P21L、p. V63M改變, 兩者均為相同性質氨基酸的替換; 在牦牛中發(fā)現c.62 C>T、c.129A>G替換, 前者也引起編碼氨基酸發(fā)生p. P21L替換, 后者為同義替換。在INHA基因5'側翼區(qū)所測出的序列中, 水牛、大額牛和牦牛等物種內均未發(fā)現SNP位點, 但在種間發(fā)現存在c. -6T>G的替換, 大額牛、牦牛和普通牛均為c. -6G, 而水牛為c. -6T。在INHA基因內含子中, 水牛的第31～36位核苷酸處發(fā)現有6個堿基的缺失, 即c. 262+31_262+36delTCTGAC; 該位點在河流型水牛中野生型(+/+)占主體, 而在沼澤型水牛中則缺失型(-/-)占主體。在大額牛、牦牛和普通牛等其它?？莆锓N的內含子中均未發(fā)現該缺失, 但與水牛相比, 大額牛、牦牛和普通牛內含子中發(fā)現缺失c. 262+78_262+79delTG。序列比對顯示,INHA基因外顯子1序列中c. 43A和c. 67G為水牛中所特有, 而c. 173A和c. 255G 為大額牛、牦牛和普通牛所共有, c. 24C、c. 47G、c. 174T和c. 206T為山羊所特有。大額牛、牦牛和普通牛間INHA基因外顯子1序列差異較小, 而山羊和水牛與它們間的差異相對較大。

水牛; 大額牛; 牦牛; 抑制素α亞基基因（INHA）外顯子1; 多態(tài)性

抑制素(inhibin, INH)是一種主要由性腺細胞分泌的糖蛋白激素, 由α亞基和β亞基通過二硫鍵接合而成(Thompson et al, 1994; Xue et al, 2004)。α亞基為抑制素的固有亞基, β亞基包含兩種結構相似的β A亞基和β B亞基。α亞基分別與β A亞基和β B亞基結合, 被稱作抑制素 A(inhibin-A)和抑制素B(inhibin-B)(Thompson et al, 1994; Xue et al, 2004)。

抑制素能夠對促卵泡素(follicle-stimulating hormone, FSH)的含量起到抑制作用(Thompson et al,1994; Xue et al, 2004), 從而調控雌性動物的卵泡生成。在雄性動物中, 抑制素α亞基(inhibin α-subunit,INHA)主要存在于精原細胞、精母細胞和早期的精細胞中, 是睪丸間質細胞和支持細胞增殖、分化和類固醇合成潛在的旁分泌和自分泌調節(jié)因子(Sang et al, 2011)。因此, INHA編碼基因為控制家畜繁殖性狀的重要候選基因, 具有很高的研究和利用價值。過去, 對INHA基因的研究主要集中在人、豬、普通牛、山羊和綿羊等動物上(Thompson et al, 1994;Jeong et al, 2004; Xue et al, 2004; Zhou et al, 2007;Fallahian et al, 2009; Wu et al, 2009; Ding et al, 2011;Sang et al, 2011; Tang et al, 2011)。Ensemble 數據庫(http://www.ensembl.org/index.html)中公布的普通牛INHA基因序列共含有2個外顯子和1個內含子, 第一外顯子編碼區(qū)長為262 bp, 第二外顯子編碼區(qū)長為821 bp, 內含子長1 836 bp; 該基因編碼序列長1 083 bp, 共編碼360個氨基酸。

家養(yǎng)水牛分為河流型和沼澤型兩種類型(Zhang,2000), 有關水牛抑制素α亞基完整的編碼區(qū)序列雖已有報道(Xie et al, 2009), 但目前有關兩類水牛INHA基因的遺傳差異及群體遺傳特征還未見報道。在?？莆锓N中, 有關牦牛和大額牛INHA基因的研究也未見報道。本研究采用PCR產物直接測序法, 對水牛、牦牛和大額牛的INHA基因外顯子 1進行了群體變異檢測, 并結合已發(fā)表的包括普通牛和山羊等?？莆锓N在內的一些哺乳動物同源序列進行了比較分析, 以揭示?？莆锓NINHA基因外顯子1的序列差異及其群體遺傳特征。

1 材料與方法

1.1 材料

148頭水牛樣品分別采自3個河流型和11個沼澤型水牛群體, 河流型水牛樣品包括檳榔江水牛35頭、摩拉水牛12頭、尼里?拉菲水牛10頭, 共57頭; 沼澤型水牛樣品包括湖南濱湖水牛4頭、恩施水牛7頭、鹽津水牛8頭、福安水牛9頭、東流水牛7頭、信豐水牛6頭、滇東南水牛8頭、江西濱湖水牛7頭、富鐘水牛10頭、德昌水牛18頭、德宏水牛7頭, 共91頭。8頭大額牛樣品采自云南省怒江州; 牦牛樣品共12頭, 其中8頭采自西藏自治區(qū), 4頭采自云南省迪慶州中甸縣。每頭牛取耳組織或肌肉樣, 低溫帶回實驗室,－80 ℃凍存。

由 NCBI數據庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中下載了不同哺乳動物INHA基因第1外顯子序列,用于比較分析。序列包括: 水牛: EU884446; 普通牛:U16237、M13273、NM_174094、L20601; 山羊:EF602161、HQ699620、JN620334、JN620335; 牦牛: JN572112; 豬: AK235034、AK234503、AK347411、DQ356013、M13980、NM_214189; 人:NM_002191、X04445、AK292340、BC006391、BC039076、BT006954、CU675381、M13144、M13981;猴: NM_001032955和黑猩猩: XM_001148064。由Ensembl數據庫中下載了人和普通牛INHA基因全序列(ENSG00000123999, ENSBTAG00000009972)也用于比較分析。

1.2 基因組DNA的提取

采用酚/氯仿抽提法(Joseph & David, 2002)提取基因組 DNA, 經紫外分光光度法檢測其純度和濃度, TE緩沖液稀釋為50 ng/μL, 保存于4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3 PCR引物設計和PCR擴增

根據普通牛INHA基因全序列(登錄號:ENSBTAG00000009972)并參考 GenBank數據庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中水牛和普通牛該基因 mRNA 序列(登錄號: EU884446、BC109837、M13273、NM_174094), 采用Oligo 6軟件設計擴增INHA基因外顯子1及其旁側序列的引物。PCR引物也作為測序引物。上游引物: 5'-GTAGAAGAG GGCGGTGGT-3', 下游引物: 5'-TCCTGAAATGTA GGCGTTAT-3'。PCR 反應體系為 25 μL, 包含10×buffer 2.5 μL(Mg2+為 1.5 mmol/L), 上、下游引物各 0.4 μmol/L, dNTP 2.5 mmol/L, Taq 酶 1.25 U,DNA模板100 ng。PCR程序為: 95 ℃預變性5 min;然后, 94 ℃ 35 s, 57 ℃ 35 s, 72 ℃ 40 s, 30 個循環(huán);72 ℃后延伸10 min終止反應。

1.4 PCR產物回收及測序

PCR產物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測效果, PCR擴增效果好的樣品, 經回收純化后, 送北京百泰克生物技術有限公司進行正、反鏈雙向測序。

1.5 數據分析

使用DNAStar 6.0軟件包(DNAstar Inc.)對測序數據進行核對編輯后, 用Clustal X軟件(Thompson et al, 1994)對序列進行比對。各物種序列一致性分析采用DNAStar軟件包進行, 再用MEGA 4.0軟件(Tamura et al, 2007)進行突變位點輸出, 并采用Kimura雙參數模型構建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結果與分析

2.1 物種內序列變異分析

本研究獲得水牛INHA基因外顯子1及其兩側序列長度為496 bp, 包括外顯子1序列262 bp, 5'側翼序列40 bp和內含子序列194 bp。經比對, 各?？莆锓NINHA基因外顯子1序列長度相同, 各物種內序列一致性在99.2%～99.6%之間。

表1 ?？莆锓NINHA基因外顯子1序列的SNP位點及其基因型、基因頻率Tab. 1 Bovine species SNPs, corresponding genotypes and gene frequencies in INHA exon 1

在INHA基因外顯子1序列中, 發(fā)現水牛INHA基因編碼區(qū)第73位核苷酸處(本文以水牛序列起始密碼子第一位核苷酸為+1記錄突變位點)存在一個SNP位點, 即為c.73C>A顛換, c.73C和c.73A基因頻率分別為0.8851和0.1149, 但此SNP并沒有引起編碼氨基酸的改變。在沼澤型水牛中, 發(fā)現該位點存在c.73C和c.73A兩個等位基因, 但c.73A等位基因僅以雜合狀態(tài)存在。在河流型水牛中, 摩拉水牛和尼里?拉菲水牛只存在等位基因c.73C, 而檳榔江水牛卻含有c.73C和c.73A兩個等位基因, 基因頻率分別為0.90和0.10, c.73A也僅以雜合狀態(tài)存在。

在大額牛中, 檢測到INHA基因編碼區(qū)第62、187位核苷酸處存在c.62 C>T、c.187 G>A替換, 前者引起了INHA中相應位置氨基酸由脯氨酸(Pro, P)變?yōu)榱涟彼?Leu, L), 即 p. P21L; 后者引起了相應氨基酸由纈氨酸(Val, V)變?yōu)榧琢虬彼?Met, M), 即p. V63M, 兩者均為相同性質氨基酸的替換。INHA基因編碼區(qū) c.62 C>T的非同義替換也發(fā)現存在牦牛中。此外, 在牦牛該基因編碼區(qū)第129位核苷酸處發(fā)現存在c.129A>G替換, 但該替換為同義替換。在大額牛群體中發(fā)現的c.62 C>T、c.187 G>A及在牦牛群體中發(fā)現的c.62 C>T、c.129A>G替換均只存在于雜合個體中。各SNP位點及其群體遺傳組成信息見表1。

在所得到的40 bp的 5'側翼序列中, 水牛、大額牛和牦牛物種內均未發(fā)現 SNP位點; 在種間, 發(fā)現大額牛與牦牛序列完全一致, 但它們與水牛的 5'側翼序列在-6位核苷酸上存在差異, 在水牛中該位置為 c. -6T, 在大額牛與牦牛中為 c. -6G。與已發(fā)表的普通牛序列相比, 發(fā)現普通牛中該位點也為 c.-6G。

在INHA基因內含子所測出的序列中, 水牛的第31～36位核苷酸處發(fā)現有 6個堿基的缺失, 即 c.262+31_262+36delTCTGAC, 將之命名為等位基因“-”;而將水牛中無 6個堿基缺失的類型命名為等位基因“+”。在河流型水牛中, 摩拉水牛和尼里-拉菲水牛該位置均為無缺失類型, 對應的基因型為+/+, 而檳榔江水牛卻含有+/+、+/-和-/-三種基因型個體, 所占比例分別為 71.43%(25/35)、20.00%(7/35)和 8.57%(3/35); 在沼澤型水牛中該位置存在+/+、+/-和-/-三種基因型, 所占比例分別為 2.20%(2/91)、29.67%(27/91)和68.13%(62/91)。在大額牛、牦牛和已發(fā)表的普通牛INHA基因內含子中均未發(fā)現該缺失, 但與水牛序列相比, 發(fā)現它們在內含子的第78～79位核苷酸處有2個堿基的缺失, 即c. 262+78_262+79delTG。

2.2 物種間INHA基因外顯子1序列差異

本文所測序列與NCBI數據庫上已發(fā)表的牛科物種和人、豬等物種的同源序列進行比對, 確定各物種的單倍型。由水牛INHA基因外顯子1序列變異定義兩種單倍型: buffaloC和 buffaloA; 由水牛INHA基因外顯子1及其內含子序列變異共同定義4種單倍型: buffaloC(＋),、buffaloC(－),、buffaloA(＋)和buffaloA(－)。依據INHA基因外顯子1序列變異,在大額牛中定義兩個單倍型: gayalI1和 gayalI2; 在牦牛中定義兩個單倍型: yakI1和yakI2; 在普通牛中,定義3個單倍型: cattleI1、cattleI2和cattleI3; 山羊中也定義3個單倍型: goatI1、goatI2和goatI3。各單倍型及其相應的蛋白質編碼序列差異見圖1和圖2。

?？莆锓NINHA基因外顯子1與豬和靈長類同源序列差異較大。牛科物種與豬的序列一致性在89.7%～90.9%之間, 與靈長類序列一致性在83.3%～85.2%之間。而各?？莆锓N間INHA基因外顯子1序列一致性在95.8%～100%之間, 其中, 大額牛、牦牛和普通牛間序列INHA基因外顯子1序列差異較小, 序列一致性在 98.9%～100%之間, 單倍型cattleI3與yakI1序列一致; 而山羊、水牛與大額牛、牦牛和普通牛間序列差異相對較大, 山羊與它們間序列一致性在 95.8%～97.3%之間; 水牛與它們間序列一致性在 97.0%～98.5%之間; 水牛與山羊之間序列一致性在96.6%～97.3%之間。

通過物種間序列比對, 發(fā)現INHA基因外顯子1序列中c. 43A、c. 67G和c. 73A為水牛所特有, 其中c. 43A、c. 67G導致水牛INHA第15、23位相應氨基酸分別為精氨酸(Arg, R)和纈氨酸(Val, V), 即p. 15R和p. 23V, 而在其他物種中該位置核苷酸均為c. 43G、c. 67C, 相應的編碼氨基酸分別為甘氨酸(Gly, G)和亮氨酸(Leu, L), 即p. 15G和p. 23L。其中, p. G15R為非相同性質氨基酸的替換, p. L23V為相同性質氨基酸的替換。值得注意的是,INHA基因外顯子1序列中c. 173A和c. 255G 為普通牛、大額牛和牦牛所共有, 而在其他?？莆锓N中為 c.173C和c. 255A, 前者差異引起了普通牛、大額牛和牦牛的INHA第58位編碼氨基酸由脯氨酸(Pro, P)變?yōu)榻M氨酸(His, H), 為非相同性質氨基酸的替換;而后者為同義替換。在山羊中,INHA基因外顯子1序列中c. 24C、c. 47G、c. 174T和c. 206T為山羊所特有, 在其他物種中該位置分別為c. 24G、c. 47A、c. 174C和c. 206G, 其中, c. 24G>C、c. 47A>G和c.206G>T替換分別引起了在山羊INHA第8、16和69位編碼氨基酸改變?yōu)閜. L8F(F為苯丙氨酸, Phe)、p. H16R和p. R23M, p. L8F和p. H16R替換為相同性質氨基酸的替換, 而p. R23M為非相同性質氨基酸的替換。

2.3 系統(tǒng)發(fā)育分析

基于各物種INHA基因外顯子1不同單倍型序列構建的系統(tǒng)發(fā)育樹, 見圖3。在系統(tǒng)發(fā)育樹上, 普通牛、大額牛和牦牛間表現出較近的遺傳關系, 它們聚在一個較大的支系上, 而水牛和山羊等物種分別聚在各自獨立的分支上, 且有較高的支持率, 表現出水牛、山羊與大額牛、牦牛和普通牛間遺傳關系較遠。

3 討 論

本文在水牛群體中, 盡管檢測出INHA基因外顯子1存在c.73C>A替換, 但為同義替換, 河流型和沼澤型水牛在編碼產物上相一致。對于該基因內含子序列中的 c. 262+31_262+36delTCTGAC缺失而言, 河流型水牛傾向于+/+基因型, 而沼澤型水牛則傾向于-/-基因型。在檳榔江水牛INHA基因外顯子1中存在c.73C>A替換以及在其內含子中存在c.262+31_262+36delTCTGAC缺失, 提示檳榔江水牛與國外著名的摩拉水牛和尼里-拉菲水牛相比, 選育程度低, 并存在沼澤型水牛基因滲入, 這與以往對該水牛的報道相一致(Miao et al, 2011)。在大額牛群體中發(fā)現的c.62 C>T、c.187 G>A及在牦牛群體中發(fā)現的c.62 C>T、c.129A>G替換, 在遺傳上是連鎖的, 且處于 Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)。由于在水牛、大額牛和牦牛群體中發(fā)現的SNPs為同義替換或相同性質氨基酸的替換, 揭示各?？莆锓NINHA基因外顯子1的不同單倍型在功能上差異不大, 提示?？莆锓N內INHA基因在功能上具有一定的保守性。

圖1 INHA基因外顯子1及其兩側翼序列各單倍型核苷酸差異Fig. 1 Nucleotide differences of haplotypes detected in INHA exon 1 and its bilateral sequences

圖2 INHA基因外顯子1序列各單倍型相應的編碼氨基酸差異Fig. 2 Amino acid differences encoded by haplotype sequences of INHA exon 1 among various species

圖3 基于各物種INHA基因外顯子1單倍型序列構建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 3 Phylogenetic tree based on haplotype sequences of INHA exon 1 in various species

各物種序列比對及系統(tǒng)發(fā)育分析結果表明, 大額牛、牦牛和普通牛間INHA基因外顯子1序列差異較小, 序列一致性較高, 而山羊和水牛與它們的差異相對較大, 這揭示大額牛、牦牛和普通牛間遺傳關系較近, 它們的INHA基因在功能上具有相似性; 而山羊和水牛與它們間遺傳關系較遠,INHA基因在功能上可能與大額牛、牦牛和普通牛存在一定差異性。這種差異是否與水牛的繁殖率普遍偏低,以及山羊較高的繁殖率有關, 需進一步深入研究。該基因5'側翼序列第-6位核苷酸, 在大額牛、牦牛和普通牛中均為c. -6G型, 而在水牛中為c. -6T型,也揭示大額牛、牦牛和普通牛間較近的遺傳關系。以往研究揭示, 該區(qū)域在普通牛中為轉錄因子Ap-2(activator protein 2)的作用位點(Thompson et al,1994), 以上差異是否反映水牛INHA基因在表達上與大額牛、牦牛和普通牛有差異需進一步研究。在水牛內含子序列中發(fā)現的 c. 262+31_262+ 36del TCTGAC缺失, 在其他物種中都不存在, 說明該缺失可能是水牛中獨有的。另外, 在大額牛、牦牛和普通牛發(fā)現的 c. 262+78_262+79delTG缺失可作為區(qū)分水牛的分子標記; 在INHA基因外顯子1序列中為普通牛、大額牛和牦牛所特有的核苷酸c. 173A和c.255G, 在水牛中特有的核苷酸c. 43A、c. 67G, 在山羊中特有的核苷酸c. 24C、c. 47G、c. 174T、c. 206T,可作為分子標記進行水牛、山羊與普通牛、大額牛和牦牛3個物種間的區(qū)分。以上標記可用于畜產品種類等方面的鑒定, 在畜牧生產上加以利用。

已有研究結果揭示, 體內 INHA水平與成年男性的精子數量和睪丸體積呈正相關(Sang et al, 2011),與女性卵巢早衰相關(Jeong et al, 2004; Fallahian et al,2009)。在中國荷斯坦牛中,INHA基因外顯子 1的c.132A>G替換(參考文獻中為c.192A>G)與超數排卵效果相關, 與精子頂體完整率有顯著的相關, 即 GG基因型較 AA基因型個體具有較高的精子頂體完整率和較好的超數排卵效果(Sang et al, 2011; Tang et al,2011)。本研究在水牛、大額牛和牦牛群體中未發(fā)現c.132A>G型個體, 即群體中均為GG基因型個體。在小尾寒羊INHA基因外顯子1中發(fā)現c.231T>C替換與繁殖力性狀具有一定關聯性, CC型個體比 TT個體具有較高的繁殖力(Zhou et al, 2007)。本研究在水牛、大額牛和牦牛群體中未發(fā)現c. 231C型, 即它們群體中均為TT基因型個體。以上結果是否在一定程度上揭示了水牛、大額牛和牦牛的精子頂體完整率高和超數排卵效果好及它們的繁殖力(它們多為單胎)比綿羊低, 尚需進一步驗證。有人在波爾山羊INHA基因外顯子1中發(fā)現SNP c.129G>A, 但并未發(fā)現該SNP與繁殖性狀有直接關系(Wu et al, 2009)。本研究在大額牛、牦牛和普通牛中也發(fā)現存在 c.129A型, 但在水牛中只有c.129G。

本文揭示了?？莆锓NINHA基因外顯子1的遺傳特征, 可為從分子水平開展?？莆锓N繁殖性狀的選育提供參考。

Ding CY, Chen B, Liu XQ, He CQ. 2011. Association analysis of polymorphisms inINHAgene with litter size in pigs [J].Chn J Anim Sci, 47(1): 6-9. [丁朝陽, 陳斌, 柳小春, 賀長青. 2011.INHA基因多態(tài)性與豬產仔數的相關性分析. 中國畜牧雜志, 47(1): 6-9.]

Fallahian M, Pouresmaeili F, Azizi F, Zali MR, Samani EM, Kharaziha P.2009. Existence of inhibin α-subunit gene mutation in a population of Iranian women with premature ovarian failure [J].Int J Endocrinol Metab, 7(2): 67-71.

Jeong HJ, Cho SW, Kim HA, Lee SH, Cho JH, Choi DH, Kwon H, Cha WT,Han JE, Cha KY. 2004. G769A variation of inhibin α-gene in Korean women with premature ovarian failure[J].Yonsei Med J,45(3):479-482.

Joseph S, David WR. 2002. Molecular Cloning: A Laboratory Manual.[M].3rd ed. Cold Spring Harbor: CSHL Press, 483-485.

Miao YW, Li DL, Yuan F, Liang JP, Li WZ, Liu W, Li ZR, Zhang CX. 2011.Analysis of genetic characterization of Binglangjiang buffalo using mtDNA D-loop sequences [J].J Yunnan Agric Univ: Nat Sci,26(5):625-633. [苗永旺, 李大林, 袁峰, 梁建平, 李衛(wèi)真, 劉偉, 李卓然,章純熙. 2011. 利用mtDNA D-loop序列為遺傳標記分析檳榔江水牛的群體遺傳特征. 云南農業(yè)大學學報: 自然科學版, 26(5): 625-633.]

Sang L, Du QZ, Yang WC, Tang KQ, Yu JN, Hua GH, Zhang XX, Yang LG.2011. Polymorphisms in follicle stimulation hormone receptor, inhibin alpha, inhibin bata A, and prolactin genes, and their association with sperm quality in Chinese Holstein bulls [J].Anim Reprod Sci,126(3-4):151-156.

Tamura K, Dudley J, Nei M, Kumar S. 2007. MEGA4: Molecular evolutionary genetics analysis (MEGA) software version 4.0 [J].Mol Biol Evol24(8): 1596-1599.

Tang KQ, Li SJ, Yang WC, Yu JN, Han L, Li X, Yang LG. 2011. An MspI polymorphism in the inhibin α gene and its associations with superovulation traits in Chinese Holstein cows [J].Mol Biol Rep, 38(1):17-21.

Thompson DA, Cronin CN, Martin F. 1994a. Genomic cloning and sequence analyses of the bovine α-, βA- and βB-Inhibin/activin genes [J].Eur J Biochem,226(3): 751-764.

Thompson JD, Higgins DG, Gibson TJ. 1994b. CLUSTAL W: improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, position-specific gap penalties and weight matrix choice.Nucl Acids Res,22(22): 4673-4680.

Wu WS, Hua GH, Yang LG, Wen QY, Zhang CY, Zoheir KM, Chen SL.2009. Association analysis of theINHAgene with litter size in Boer goats [J].Small Rumin Res,82(2-3): 139-143.

Xie TS, Nong W, Zhang XM, Huang YQ, Cui KQ, Shi DS. 2009. Cloning and prokaryotic expression of swamp buffalo Inhibin alpha subunit gene [J].Heilongjiang Anim Sci Vet Med,(8): 14-17. [謝體三, 農微,張新民, 黃雅瓊, 崔奎青, 石德順. 2009. 水牛抑制素α亞基基因的克隆與原核表達. 黑龍江畜牧獸醫(yī), (8): 14-17.]

Xue Y, Chu MX, Zhou ZX. 2004. Advances on inhibin genes[J].Hereditas,26(5): 749-755. [薛昱, 儲明星, 周忠孝. 2004. 抑制素基因的研究進展. 遺傳, 26(5): 749-755.]

Zhang CX. 2000. Chinese Buffalo Science [M]. Nanning: Guangxi Science and Technology Press. [章純熙. 2000. 中國水?？茖W[M]. 南寧: 廣西科學技術出版社.]

Zhou WR, Chu MX, Sun SH, Fang L, Ye SC. 2007. A candidate geneINHAfor prolificacy of small Tail Han sheep [J].J Agric Biotechnol, 15(1):32-36. [周文然, 儲明星, 孫少華, 方麗, 葉素成. 2007. 小尾寒羊高繁殖力候選基因INHA的研究[J]. 農業(yè)生物技術學報, 15(1): 32-36.]

Polymorphisms of inhibin α gene exon 1 in buffalo (Bubalus bubalis),gayal (Bos frontalis) and yak (Bos grunniens)

MIAO Yong-Wang1,#,*, HA Fu1,#, GAO Hua-Shan1,YUAN Feng, LI Da-Lin2, YUAN Yue-Yun2

(1.Faculty of Animal Science and Technology,Yunnan Agricultural University,Kunming650201,China;
2.Domestic Animal Breeding and Crossbreed-improvement Station of Yunnan Province,Kunming650225,China)

To elucidate the genetic characteristics of the bovine Inhibin α subunit (INHA) gene, the polymorphisms in exon 1 ofINHAand its bilateral sequences were assayed using PCR with direct sequencing in buffalo, gayal and yak. A comparative analysis was conducted by pooled the results in this study with the published data ofINHAon some mammals including some bovine species together. A synonymous substitution c.73C>A was identified in exon 1 ofINHAfor buffalo, which results in identical encoding product in river and swamp buffalo. In gayal, two non-synonymous but same property substitutions in exon 1 ofINHA, viz. c.62 C>T and c.187 G>A, were detected, which lead to p. P21L, p.V63M changes in INHA, respectively. In yak, nucleotide substitution c.62C>T, c.129A>G were found in exon 1 ofINHA,the former still causes p. P21L substitution and the latter is synonymous. For the sequence of the 5'-flanking region ofINHAexamined, no SNPs were found within the species, but a substitution, c. -6T>G, was found. The nucleotide in this site in gayal, yak and cattle was c. -6G, whereas in buffalo it was c. -6T. Meanwhile, a 6-bp deletion, namely c.262+31_262+36delTCTGAC, was found in the intron of buffaloINHAgene. For this deletion, wild types (+/+) account for main part in river buffalo while mutant types (-/-) are predominant in swamp buffalo. This deletion was not found in gayal, yak and cattle, though these all have another deletion in the intron ofINHA, c. 262+78_262+79delTG. The results of sequence alignment showed that the substitutions c. 43A and c. 67G in exon 1 ofINHAare specific to buffalo, whereas the substitutions c. 173A and c. 255G are exclusive to gayal, yak and cattle, and c. 24C, c. 47G, c. 174T and c. 206T are specific to goat. Furthermore, there are few differences among gayal, yak and cattle, but there relatively great differences between buffalo, goat and other bovine species regarding the sequences ofINHAexon 1.

Buffalo; Gayal; Yak; Inhibin α gene(INHA）exon 1; Polymorphism

S823.8；Q75

A

0254-5853-(2012)04-0402-07

10.3724/SP.J.1141.2012.04402

2012-02-16; 接受日期: 2012-04-13

云南省應用基礎研究重點項目(2007C0003Z); 國家自然科學基金項目(30660024); 云南省應用基礎研究計劃面上項目(2006C0034M);國家高技術研究發(fā)展計劃(“863”計劃)項目(2008AA101001); 云南省財政廳基金項目(檳榔江水牛種質特性研究)

?通信作者(Corresponding author), E-mail: yongwangmiao999@yahoo.com.cn

#共同第一作者(Authors contributed equally to the work)

苗永旺(1964—), 男, 博士，教授，從事動物遺傳學教學和研究工作; 哈福(1974— ), 男, 博士, 副教授, 主要從事動物繁殖學教學和科研工作