苑桂娟

子宮肌瘤患者外周血單核細(xì)胞中DcR3基因表達(dá)的意義

苑桂娟

目的探討外周血單核細(xì)胞(PBMC)中DcR3基因表達(dá)水平與子宮肌瘤的關(guān)系。方法65名子宮肌瘤患者和62名健康對(duì)照者各取5ml靜脈血，肝素抗凝，密度梯度離心法分離PBMC，TRIZOL法提取PBMC總RNA，用半定量RT-PCR法檢測PBMC中DcR3基因的相對(duì)表達(dá)水平，并用t檢驗(yàn)進(jìn)行比較。結(jié)果子宮肌瘤患者組PBMC中DcR3基因的相對(duì)表達(dá)水平為(0.845±0.029)，與正常對(duì)照組(0.140±0.003)相比有明顯差異(P＜0.01)。結(jié)論子宮肌瘤患者PBMC中DcR3基因的表達(dá)水平增高。

DcR3；基因表達(dá)；子宮肌瘤；外周血單核細(xì)胞

子宮肌瘤的發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，但近年來發(fā)現(xiàn)肌瘤與凋亡等信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的紊亂有關(guān)，在子宮肌瘤患者的病理組織上發(fā)現(xiàn)多種抗凋亡基因的過度表達(dá)[1]。新近發(fā)現(xiàn)一個(gè)可溶性受體蛋白—誘惑受體3(decoy receptor3)能競爭性地與FasL結(jié)合，從而阻斷FasL誘導(dǎo)的凋亡，在多種腫瘤、增生性疾病中發(fā)揮著重要的作用[2]。凋亡途徑的中斷導(dǎo)致細(xì)胞不能正常凋亡，而不斷增生，最終發(fā)生子宮肌瘤。本實(shí)驗(yàn)采用RT-PCR法檢測DcR3基因在子宮肌瘤患者及健康人外周血單核細(xì)胞(PBMC)中的表達(dá)，以探討其表達(dá)與子宮肌瘤的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器

Oligod(T)、AMV逆轉(zhuǎn)錄酶、RNA酶抑制劑、TaqDNA聚合酶、細(xì)胞分離液等購自Promega公司。引物由上海生工生物工程公司合成并純化。凝膠電泳成像分析系統(tǒng)TannonGIS1000(Tannon有限公司，上海)，PCR儀FeroTec(杭州PCR儀有限公司)。

1.2 研究對(duì)象

子宮肌瘤患者65例，年齡35～65歲。全部病人均經(jīng)婦科彩超檢查術(shù)后病理確診，且未經(jīng)治療。健康對(duì)照組62例，年齡30～64歲。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 PBMC分離

研究對(duì)象各取靜脈血5ml，肝素抗凝，加入含5ml淋巴細(xì)胞分離液的離心管中，離心2000r/min，20min，可見血漿與分離液的界面上有一白膜層，此即所需的PBMC。吸出細(xì)胞至另一試管用生理鹽水洗3遍，離心2000r/min，5min，棄上清。

1.3.2 RNA的提取及RT-PCR

在上述PBMC標(biāo)本中加入變性裂解液Trizol1ml吹打使細(xì)胞充分溶解,置室溫5min后加入氯仿200μ l，劇烈震蕩15s，室溫5min，4℃12000r/min離心15min，取上清加入等體積的異丙醇，混勻后-20℃1h，4℃12000r/min離心10 min，棄上清，加入75%乙醇1ml，4℃7500r/min離心5min,吸去乙醇自然干燥10～20min,溶于10μlDEPC水中。此即人外周血總RNA。在上步得到的10μl模板RNA中，加入1μlDEPC水，1μl引物Oligod(T)，稍離心，100℃沸水1min；加入2μldNTP，4μl5×buffer，2μlAMV逆轉(zhuǎn)錄酶，稍離心，42℃水浴90min；沸水3min，滅活A(yù)MV，得到總cDNA。

聚合酶鏈反應(yīng)PCR擴(kuò)增DcR3基因(214bp)和β -actin基因(570bp)。引物序列：DcR3基因引物正義鏈為5′-TCAATGGCCAGGCTCTTC-3′,反義鏈為5′-GCCTCTTGATGGAGATGTCC-3′；β-actin基因引物正義鏈為5′-TGACGGGGTCACCCACACT GTGCCCATCTA-3′。反義鏈為5′-CTAGAAGC ATTTGCGGTGGACGATTGGAGGG-3′。

1.3.3 PCR產(chǎn)物的相對(duì)定量分析

5μlPCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%的普通瓊脂糖凝膠電泳后,溴化乙啶染色,通過TannonGIS影像分析儀進(jìn)行DNA條帶和強(qiáng)度分析，把DcR3/β2actin的比值作為DcR3基因的相對(duì)表達(dá)水平進(jìn)行比較。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

結(jié)果顯示，健康對(duì)照組和子宮肌瘤患者PBMC中均檢測到DcR3基因的表達(dá)，PCR產(chǎn)物電泳后在214bp大小位置均見有一清亮條帶，與預(yù)計(jì)的DcR3基因片段大小一致，同時(shí)在570bp大小位置也顯示有清亮條帶，此為內(nèi)參照基因β-actin片段產(chǎn)物。DNA條帶和強(qiáng)度分析示，正常人PBMC中DcR3基因有低水平的表達(dá)，其相對(duì)表達(dá)水平為（0.140± 0.003）；但子宮肌瘤患者PBMC中DcR3基因呈過度表達(dá)，其相對(duì)表達(dá)水平（0.845±0.029）。兩者相比有明顯差異(P=0.012)。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)對(duì)65例經(jīng)婦科彩超和病理診斷的子宮肌瘤患者和62例健康人進(jìn)行了PBMC中DcR3基因檢測，發(fā)現(xiàn)子宮肌瘤患者血中DcR3基因表達(dá)明顯高于正常人群，說明DcR3基因異常表達(dá)與子宮肌瘤有一定的關(guān)系。

子宮肌瘤的發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，但近年來發(fā)現(xiàn)肌瘤與凋亡等信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的紊亂有關(guān)，在子宮肌瘤患者的病理組織上發(fā)現(xiàn)多種抗凋亡基因的過度表達(dá)[1]。細(xì)胞凋亡是細(xì)胞接受某種信號(hào)刺激后一種主動(dòng)性細(xì)胞程序性死亡。細(xì)胞凋亡的阻斷與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。近年來研究發(fā)現(xiàn)bcl-2、bax、p53等基因與生長因子和激素共同作用影響子宮肌細(xì)胞的生長、分化、增生和凋亡。而誘惑受體3能阻斷細(xì)胞凋亡途徑，在多種腫瘤、增生性疾病中發(fā)揮著重要的作用[2]，故可能在子宮肌瘤的發(fā)生與發(fā)展中起一定的作用。

DcR3是一個(gè)含300個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，分子量為35KD。1998 年P(guān)itti等[2]搜查EST數(shù)據(jù)庫時(shí)發(fā)現(xiàn)一組與TNFR基因超家族成員有同源性的ESTs，通過重疊序列，從人胚肺中分離出一條新的全長cDNA，并把此cDNA編碼的蛋白稱DcR3；進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)DcR3基因在肺癌、結(jié)腸癌細(xì)胞中高度表達(dá)，在外周血單核細(xì)胞(PBMC)中也可檢測到DcR3基因的表達(dá)；Wu等[3]為了探討血清DcR3對(duì)腫瘤的診斷意義，運(yùn)用ELISA方法檢測了數(shù)十例腫瘤、急性感染、肝硬化患者及健康對(duì)照者血清DcR3水平，結(jié)果顯示，56.2%腫瘤患者血清DcR3呈陽性。DcR3可通過抗細(xì)胞凋亡、降低宿主免疫系統(tǒng)功能以及促使腫瘤血管形成等促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展，運(yùn)用單克隆抗體與RNA干涉(RNAi)技術(shù)有可能從蛋白水平和基因水平阻斷DcR3的表達(dá)，解除DcR3對(duì)腫瘤細(xì)胞的凋亡抑制作用、恢復(fù)機(jī)體正常免疫功能[4]。

有資料表明[5]，DcR3基因在矽肺、肺纖維化、關(guān)節(jié)炎等患者PBMC中高度表達(dá)，提示DcR3過度表達(dá)可能在這些疾病的發(fā)病過程中發(fā)揮重要的影響。本研究表明，子宮肌瘤患者PBMC中DcR3基因的過度表達(dá)，與正常人相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示高度表達(dá)的DcR3可能阻斷細(xì)胞凋亡，可能與子宮肌瘤的發(fā)病有關(guān)。李衛(wèi)平等應(yīng)用RT-PCR法測定21例肌瘤患者,發(fā)現(xiàn)肌瘤組織內(nèi)bcl-2/bax比值顯著高于正常子宮平滑肌[6]。郭昕等用免疫組化ABC法在50例患者中發(fā)現(xiàn)了同樣的結(jié)果[7]。bcl-2基因過度表達(dá)抑制了肌瘤細(xì)胞的凋亡，使細(xì)胞生存時(shí)間延長，導(dǎo)致細(xì)胞堆積或細(xì)胞突變率增加。這些抗凋亡基因的過度表達(dá)可能與DcR3阻斷凋亡途徑有關(guān)，所以說DcR3對(duì)子宮肌瘤患者的發(fā)病機(jī)制有一定的貢獻(xiàn)。因此可稱為子宮肌瘤診斷的標(biāo)志物或者為治療子宮肌瘤提供新的靶位。

[1]李小花,歸綏琪.子宮肌瘤的分子遺傳學(xué)研究進(jìn)展[J].生殖與避孕,2006,26（12）:740-744.

[2]Pitti RM，Marsters SA，Lawrence DA，etal.Genomic amplification of a decoy receptor for Fas ligand in lung and colon cancer [J].Nature，1998，396 (6712)：699-703.

[3]Wu Y,Han B,Sheng H,etal.Clinical significance of detecting elevated serum DcR3/TR6/M68 in malignant tumor patients[J].Int J Cancer, 2003,105(5):724-732.

[4]Li H,Zhang L,Lou H,etal.Overexpression of decoy receptor 3 in precancerous lesions and adenocarcinoma of the esophagus[J].Am J Clin Pathol,2005,124(2):282-287.

[5]王秀麗,尹金植,黃志衛(wèi),等.特發(fā)性肺間質(zhì)纖維化病人外周血單核細(xì)胞中DcR3基因表達(dá)的意義[J].中國老年學(xué)雜志,2004,24(12):1129-31.

[6]李衛(wèi)平,嚴(yán)雋鴻,林其德,等.凋亡調(diào)控基因Bcl-2/Bax mRNA在子宮平滑肌瘤中的表達(dá)[J].上海第二醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2000,20(6):514-7.

[7]郭昕,佟麗波,杜佳秋.細(xì)胞凋亡相關(guān)基因bcl-2和bax在子宮肌瘤中表達(dá)的意義[J].黑龍江醫(yī)藥科學(xué),2004,27(4):55-6.

吉林省榆樹市第二人民醫(yī)院，吉林長春 130400