周春炎 周昌龍 關(guān)偉偉

（江蘇省如皋市畜牧獸醫(yī)站，如皋 226500）

豬瘟、高致病性豬藍(lán)耳病和口蹄疫疫苗免疫試驗(yàn)報(bào)告

周春炎 周昌龍 關(guān)偉偉

（江蘇省如皋市畜牧獸醫(yī)站，如皋 226500）

豬瘟俗稱(chēng)“爛腸瘟”，是由黃病毒科豬瘟病毒屬的豬瘟病毒引起的一種急性、發(fā)熱、接觸性傳染的傳染病。具有高度傳染性和致死性。高致病性豬藍(lán)耳病是由豬繁殖與呼吸綜合征（俗稱(chēng)藍(lán)耳?。┎《咀儺愐鸬囊环N急性高致死性疫病。仔豬發(fā)病率可達(dá)100%、死亡率可達(dá)50%以上，母豬流產(chǎn)率可達(dá)30%以上，育肥豬可發(fā)病死亡。這2個(gè)傳染病的臨床癥狀、病理變化有相似之處，不易區(qū)分。為尋求最佳免疫方案，本實(shí)驗(yàn)研究采用2病疫苗的不同劑量、不同疫苗品種、不同疫苗組合等進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，同時(shí)，進(jìn)行免疫抗體檢測(cè)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 疫苗

1.1.1.1 豬口蹄疫O型滅活疫苗（O/MYA98/BY/2010株）（WA）批號(hào)：H110206J 規(guī)格：100ml/瓶 廠家：××生物科技股份有限公司；口蹄疫O型滅活疫苗（OZK/93株+OR/80株）（WB）批號(hào)：0132059 規(guī)格：50 ml/瓶 廠家：××生物藥品有限公司。

1.1.1.2 豬瘟活疫苗（細(xì)胞源）（CSFV）批號(hào)：101005 規(guī)格：20頭份/瓶 廠家：××生物股份有限公司。

1.1.1.3 豬藍(lán)耳活疫苗批號(hào)：1011099-2規(guī)格：20頭份/瓶 廠家：××股份有限公司。

1.1.2 主要實(shí)驗(yàn)儀器和試劑 采血器，注射器，酶標(biāo)儀，生化培養(yǎng)箱，微量加樣器等，O型口蹄疫抗體液相阻斷ELISA檢測(cè)試劑盒，豬瘟病毒抗體檢測(cè)試劑盒，ELISA豬繁殖和呼吸綜合征抗體檢測(cè)試劑盒。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)豬 如皋某生豬養(yǎng)殖場(chǎng)。

1.2 方法

1.2.1 免疫程序 各實(shí)驗(yàn)組于19日齡免疫豬藍(lán)耳活疫苗2頭份，具體免疫情況詳見(jiàn)表1。

1.2.2 血樣采集 5組實(shí)驗(yàn)豬，分別在27、57、87、118、149日齡采集血樣，每次4 ml。27、57日齡免疫前采血樣。

1.2.3 抗體免疫效果檢測(cè) 采用ELISA的方法進(jìn)行免疫效果監(jiān)測(cè)。豬瘟病毒抗體檢測(cè)試劑盒廠家：北京愛(ài)德士元亨生物科技有限公司，批號(hào)：43220-V731。LSI豬繁殖和呼吸綜合征抗體檢測(cè)試劑盒廠家：北京天之泰生物科技有限公司 批號(hào)：5-VETPRA-012。

具體操作如下：

1.2.3.1 豬瘟抗體檢測(cè)

1.2.3.1.1 加樣 每個(gè)檢測(cè)孔分別加入50 μl樣品稀釋液，分別將50 μl陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照加入到相應(yīng)的對(duì)照孔中，注意不同對(duì)照的吸頭需要更換，分別將50 μl被檢樣品加入到剩余的檢測(cè)孔中，注意更換吸頭；

1.2.3.1.2 孵育 將微量反應(yīng)板用振蕩器振蕩，混勻反應(yīng)板中的溶液，與室溫下（18℃～25℃）孵育2 h，注意封板或置于濕盒中，避免液體揮發(fā)。

1.2.3.1.3 用300 μl洗滌液連續(xù)洗ELISA板3次，在吸水紙上甩干。

1.2.3.1.4 加入100 μl辣根過(guò)氧化物酶結(jié)合物，封板，室溫溫育30 min。

1.2.3.1.5 同上。洗板3次，甩干。每孔加100 μl底物溶液，避光、室溫下溫育10 min。

1.2.3.1.6 每孔加入終止液100 μl，混勻；立即置波長(zhǎng)450 nm的酶標(biāo)儀，讀取OD值。

1.2.3.2 豬藍(lán)耳病抗體檢測(cè)

1.2.3.2.1 用樣品稀釋液將樣品進(jìn)行200倍稀釋?zhuān)任? μl的樣品加入95 μl樣品稀釋液中，混勻，再吸取5 μl稀釋了20倍的液體加入ELISA反應(yīng)板孔，再加入45 μl的樣品稀釋液；

表1 各實(shí)驗(yàn)組免疫情況一覽表

1.2.3.2.2 分別將50 μl陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照、及200倍稀釋的樣品在反應(yīng)板孔。

1.2.3.2.3 蓋上膜，在37℃作用60 min。

1.2.3.2.4 去膜，用300 μl洗滌液連續(xù)洗ELISA板3次，在吸水紙上甩干。

1.2.3.2.5 加入50 μl酶標(biāo)抗體，封板，37℃溫育60 min。

1.2.3.2.7 同上洗板3次，甩干。每孔加50 μl底物溶液，避光、20℃～25℃下溫育10 min。

1.2.3.2.8 每孔加入終止液50 μl，混勻；立即置波長(zhǎng)450 nm的酶標(biāo)儀，讀取OD值。

2 結(jié)果

2.1 臨床觀察

開(kāi)展豬藍(lán)耳病、豬瘟、口蹄疫等疫苗免疫注射后，1周內(nèi)臨床觀察全部實(shí)驗(yàn)豬均無(wú)疫苗反應(yīng)出現(xiàn)。后期出現(xiàn)5頭生豬死亡，通過(guò)養(yǎng)殖場(chǎng)技術(shù)人員發(fā)病前的觀察及死亡后解剖診斷為腸炎和胸膜肺炎，與疫苗無(wú)關(guān)。

2.2 抗體檢測(cè)

2.2.1 豬瘟抗體

豬瘟陰陽(yáng)性的判斷：豬瘟陰陽(yáng)性于OD值成反比。大于臨界OD值判為陰性，且隨著OD值得升高，陰性抗體滴度越低；小于臨界OD值判為陽(yáng)性，且隨著OD值得降低，陽(yáng)性抗體滴度越高。

從表3可見(jiàn)，實(shí)驗(yàn)組內(nèi)的豬群在經(jīng)豬瘟免疫后抗體陽(yáng)性率均有不同程度上升，對(duì)比5個(gè)組的抗體陽(yáng)性率可見(jiàn)，C組的陽(yáng)性率呈直線上升，到第4次所采樣中陽(yáng)性率達(dá)100%。A、B、D、E4個(gè)組的與其比較，在前3次采樣中除B組陽(yáng)性率高于C組外，其他均低于C組，到第4、第5次采樣后陽(yáng)性率全都低于C組。其中，D組第1次采樣所測(cè)抗體為母源抗體陽(yáng)性率達(dá)90.91%，在進(jìn)行1次豬瘟免疫后在第2次免疫前采樣所測(cè)抗體陽(yáng)性率降為0%，再見(jiàn)過(guò)2次免疫后抗體陽(yáng)性率才有所上升?？傊?，C組豬瘟免疫方案從免疫效果看出，可值得推廣；母源抗體高的個(gè)體在免疫后會(huì)產(chǎn)生一些中和，促使抗體下降，保護(hù)率下降，這就要求在疫苗免疫之前做好抗體檢測(cè)對(duì)后期疫苗的防疫有著直接的指導(dǎo)意義。

從圖4可以看出，實(shí)驗(yàn)A組豬瘟第1次到第2次采樣OD值有所升高，是由于母源抗體因素，產(chǎn)生中和，導(dǎo)致抗體滴度降低；在第2次免疫之后，到第3次、第4采樣后所測(cè)OD值大部分均呈下降趨勢(shì)，到第5次采樣所測(cè)OD值大部分呈反彈趨勢(shì)，表示抗體滴度在降低，保護(hù)率有所下降。

由圖5可以看出，實(shí)驗(yàn)C組豬瘟第1次到第2次采樣OD值下降，明顯可見(jiàn)所測(cè)母源抗體OD值比較高，即抗體滴度低，與免疫抗原產(chǎn)生的反應(yīng)小，隨著疫苗在體內(nèi)刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體到第2～第4次采樣后所測(cè)OD值呈下降，到第5次采樣所測(cè)OD值成上升趨勢(shì)，是由于免疫后隨著時(shí)間的推移，機(jī)體內(nèi)的抗體滴度有所下降。

圖2 豬瘟純陽(yáng)性率

圖3 豬瘟抗體OD值

圖4 C組豬瘟抗體OD值

2.2.2 高致病性藍(lán)耳病抗體檢測(cè)

本次實(shí)驗(yàn)豬在19日齡全部免疫2頭份豬藍(lán)耳病活疫苗1次，在27、57、87、118、149日齡采血樣進(jìn)行抗體檢測(cè)。該檢測(cè)利用特異的PRRS被包被在96孔板上，在反應(yīng)過(guò)程中，檢測(cè)樣本被加入反應(yīng)孔中，樣本中的特異性抗體會(huì)與孔中包被的特異性抗原反應(yīng)，在洗板的過(guò)程中不會(huì)被清洗掉，當(dāng)添加酶標(biāo)復(fù)合物時(shí)，這些酶標(biāo)復(fù)合物就會(huì)與豬的抗體發(fā)生反應(yīng)。沒(méi)有結(jié)合的酶標(biāo)復(fù)合物在洗板的過(guò)程中被清洗。在加入對(duì)氧化酶敏感的可以顯色底物。顯色的顏色深淺與樣本所含PRRS的抗體濃度成正比?？贵w陰陽(yáng)性界定以臨界值為界，低于該臨界值為陽(yáng)性，低于臨界值為陰性，個(gè)體抗體滴度與所測(cè)OD值成正比。

從圖6可以看出，C、D組PRRS抗體滴度隨著時(shí)間的推移到第4次采樣所測(cè)OD值均呈上升趨勢(shì)，到第5次部分呈下降，分析由于免疫后時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，抗體有所下降?？梢?jiàn)PRRS的免疫超過(guò)一定時(shí)間必須加強(qiáng)免疫1次，每次間隔時(shí)間大約為4個(gè)月左右。

本試驗(yàn)報(bào)告基于2011年江蘇省農(nóng)業(yè)三項(xiàng)工程，項(xiàng)目編號(hào)：sx（2011）181。

項(xiàng)目名稱(chēng)：生豬口蹄疫O型疫苗（O/MAY98/BY/2010株）免疫試驗(yàn)與推廣。