虞紅珍， 祝 敏， 王 豫， 徐勤枝， 周平坤△

(1安徽醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)與病理生理學(xué)教研室，安徽合肥230032;2軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所，北京100850)

肌球蛋白VI(myosin VI)是其家族中唯一一個向微絲負(fù)極移動的蛋白，能水解ATP酶產(chǎn)生能量推動肌動蛋白絲的運動，是細(xì)胞的馬達(dá)蛋白，能為細(xì)胞的遷移提供動力，參與吞飲或吞噬泡的運輸，負(fù)責(zé)將高爾基體的分泌泡運輸?shù)桨麅?nèi)適當(dāng)?shù)奈恢玫龋?－4］。Yoshida等［5］發(fā)現(xiàn) myosin VI在卵巢癌中異常高表達(dá)，與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。但在人體其它腫瘤中沒有做進(jìn)一步的探討。本研究通過cDNA多腫瘤表達(dá)譜陣列芯片技術(shù)篩查myosin VI在19種人體不同腫瘤組織和10種腫瘤細(xì)胞株中的表達(dá)情況，進(jìn)一步采用組織芯片，利用免疫組化方法檢測myosin VI在不同病理分級卵巢上皮腫瘤組織中的表達(dá)情況，以驗證芯片結(jié)果的準(zhǔn)確性，從而為探討myosin VI在腫瘤中的作用機(jī)制提供實驗基礎(chǔ)。

材料和方法

1 材料

Cancer Profiling ArrayⅡ及Express Hyb雜交液為Clontech產(chǎn)品;引物合成與序列測定由北京英駿生物有限公司完成;Prime－a－Gene標(biāo)記試劑盒為Promega產(chǎn)品;myosin VI單抗購自 Sigma;DNA Taq聚合酶為鼎國生物有限公司產(chǎn)品;瓊脂糖凝膠回收試劑盒為天根生化(北京)公司產(chǎn)品;［α－32P］dCTP購自北京福瑞生物有限公司;不同病理級別人卵巢癌及癌旁正常組織組織芯片及資料由解放軍總醫(yī)院病理科自制提供;免疫組化檢測試劑(SP法)及二氨基聯(lián)苯胺(3，3＇－diaminobenzidine，DAB)顯色試劑盒由北京中杉金橋生物技術(shù)公司購買。

2 Northern雜交

2.1 探針合成與標(biāo)記 以HeLa細(xì)胞cDNA為模板，以myosin VI mRNA序列隨機(jī)設(shè)計1對引物，擴(kuò)增myosin VI片段用于Northern雜交。引物序列為:上游引物 5＇－ CGGAGGAGACACAAACCT －3＇，下游引物5＇－GCTATCTCCGCAGCGCCAGGT －3＇。反應(yīng)條件為94 ℃ 30 s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35 個循環(huán);產(chǎn)物600 bp。將目的PCR產(chǎn)物割膠回收純化，DNA測序后，按照 Prime－a－Gene標(biāo)記試劑盒的說明用［α－32P］dCTP標(biāo)記探針。

2.2 Northern雜交 將雜交液在68℃預(yù)熱，加入150 μL(1.5 mg)變性鮭魚精 DNA。將芯片置于雜交管中，加入10 mL的雜交液，預(yù)雜交30 min。棄雜交液，將標(biāo)記好的探針與5 mL雜交液混勻，加入雜交管，68℃雜交過夜。棄雜交液，200 mL 2×SSC+0.5%SDS，于68 ℃洗膜30 min×3次;200 mL 0.2×SSC+0.5%SDS，于68℃洗膜30 min;最后200 mL 2×SSC，室溫洗膜5 min。將芯片小心取出，濾紙吸去表面殘留液體，以保鮮膜包裹、壓片，于－70℃冰箱顯影，3～7 d后顯影。以ubiquitin為內(nèi)參照。

3 芯片雜交圖像處理及統(tǒng)計學(xué)分析

分別將myosin VI和內(nèi)參照ubiquitin的雜交膠片于相同條件下拍照，使用Labwork軟件對圖片上的雜交點進(jìn)行灰度值及面積分析，結(jié)果以Excel表格形式呈現(xiàn)。以myosin VI與ubiquitin的比值作為目的基因的相對豐度。采用SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示。數(shù)據(jù)間比較采用配對t檢驗、U檢驗及χ2檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

4 組織芯片免疫組化

80例不同病理分級卵巢上皮腫瘤組織芯片的相關(guān)資料如下:卵巢癌52例(包含漿液性和黏液性)，其中中低分化腺癌(高級別)33例，高分化腺癌(低級別)19例;交界性腫瘤16例;囊腺瘤8例及癌旁組織40例。均為手術(shù)切除標(biāo)本，癌旁組織取鄰近腫瘤5 cm以外的正常卵巢上皮組織。采用免疫組化SP法檢測myosin VI蛋白的表達(dá)情況，染色步驟按照試劑說明書進(jìn)行。Ⅰ抗為鼠抗人單抗myosin VI(1∶200稀釋);所使用的Ⅱ抗試劑盒為福州邁新公司的SP試劑盒，DAB顯色，蘇木素復(fù)染。用已明確myosin VI蛋白表達(dá)陽性的切片作為陽性對照，用PBS代替Ⅰ抗作為陰性對照。染色結(jié)果以細(xì)胞漿/核內(nèi)出現(xiàn)陽性信號為判斷標(biāo)準(zhǔn)，著色強(qiáng)度判讀:無色為陰性(－)，淺黃色為弱陽性(+)，黃色為中等陽性(++)，棕黃色或棕褐色為強(qiáng)陽性(+++)。

結(jié) 果

1 Myosin VI DNA探針合成

使用PCR的方法，在已知的myosin VI全長mRNA序列中擴(kuò)增一段DNA片段作為探針序列。通過割膠回收目的條帶并純化后，再次行瓊脂糖凝膠電泳，最終得到單一的目的條帶，見圖1。產(chǎn)物經(jīng)測序顯示正確。

Figure 1.The electrophoretogram of myosin VI probe generated by PCR amplification.圖1 PCR擴(kuò)增的myosin VI DNA探針割膠回收電泳圖

2 腫瘤譜陣列芯片雜交結(jié)果

Northern雜交結(jié)果顯示myosin VI在19種腫瘤和癌旁正常組織及10種細(xì)胞株中均有表達(dá)，見圖2。但能用于統(tǒng)計學(xué)處理的共有14組(樣本數(shù)較少的膀胱、女性外陰、前列腺、氣管和肝臟共5組未作統(tǒng)計學(xué)分析)。統(tǒng)計學(xué)分析發(fā)現(xiàn)myosin VI在11種腫瘤如卵巢、結(jié)腸、乳腺、胃、肺、胰腺等癌組織表達(dá)明顯高于癌旁組織，其中卵巢癌和結(jié)腸癌組織的表達(dá)豐度與配對正常組織差異顯著(P＜0.01);而腎、皮膚和睪丸癌組織中myosin VI的表達(dá)是下調(diào)的，見圖3。

Figure 2.The gene expression map of myosin VI on the Cancer Profiling ArrayⅡ.A:the gene expression map of myosin VI;B:the gene expression map of ubiquitin.1:breast;2:ovary;3:colon;4:stomach;5:lung;6:kidney;7:bladder;8:vagina;9:prostate;10:trachea;11:liver;12:uterus;13:cervix;14:rectum;15:thyroid;16:testis;17:skin;18:small intestine;19:pancreas;20:cell lines(from up to down:HeLa，Daudi，K562，HL60，G361，A549，MOLT4，SW480 and Raji).N:normal;T:tumor;UBI:ubiquitin.圖2 Myosin VI在Cancer Profiling ArrayⅡ中的表達(dá)圖譜

Figure 3.Altered expression of myosin VI in diverse human carcinomas and adjacent normal tissues.±s.n=154.＊＊P＜0.01 vs normal.圖3 人體不同癌及其癌旁組織中myosin VI的差異表達(dá)

3 組織芯片免疫組織化學(xué)結(jié)果

Myosin VI只表達(dá)于卵巢上皮細(xì)胞，陽性信號定位于細(xì)胞漿，細(xì)胞核也有少量表達(dá)。在癌旁及囊腺瘤組織中不表達(dá)或弱表達(dá)，陽性率為10.4%(5/48);交界性腫瘤表達(dá)陽性，陽性率為81.3%(13/16);而在癌組織中均表達(dá)，陽性率為100%(52/52)，且表達(dá)強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，見圖4、表1。按組織分化程度不同將卵巢腫瘤分為高級別(中低分化)、低級別(高分化)和交界性腫瘤共3組，其表達(dá)呈中等陽性(++)以上的陽性率分別為87.9%(29/33)、73.7%(14/19)和31.3%(5/16)，經(jīng) χ2檢驗前兩者差異不明顯(P＞0.05)，但后兩者之間差異顯著(P＜0.05)。Myosin VI在卵巢的交界性上皮腫瘤、低級別卵巢癌和高級別卵巢癌的表達(dá)呈逐漸增強(qiáng)趨勢，見表1。

討 論

腫瘤譜陣列芯片技術(shù)是從人體不同癌和配對的癌旁組織中提取的cDNA樣本，呈點狀陣列排布固定于尼龍雜交膜，通過與靶基因雜交，分析靶基因在不同癌組織中的表達(dá)差異，該技術(shù)的優(yōu)點在于信息量大，實驗過程簡單方便，一次Northern雜交可以分析靶基因在幾十種不同癌組織中的表達(dá)差異，避免多次實驗造成的批次間的實驗誤差并可減少實驗成本，為靶基因功能的深入研究提供依據(jù)［6－7］。

Figure 4.The expression of myosin VI in cystadenoma(A)，borderline ovarian tumor(B)and ovarian carcinoma(C)(immunohistochemical staining，×200).圖4 Myosin VI在囊腺瘤、交界性卵巢腫瘤及卵巢癌中的表達(dá)

表1 Myosin VI在各種卵巢腫瘤及癌旁組織中的表達(dá)Table 1.Differentiated expression of myosin VI in diverse ovarian tumors and adjacent normal tissues

Myosin VI有動力馬達(dá)之美稱，能水解ATP酶產(chǎn)生能量推動肌動蛋白絲的運動，從而促使微絲聚合，為細(xì)胞內(nèi)及細(xì)胞之間的運動遷移、物資運輸?shù)忍峁﹦恿?。早期的研究顯示myosin VI基因的點突變可導(dǎo)致耳聾和不育，并已證實其在內(nèi)耳的功能是穩(wěn)定靜纖毛基底的連接［8－9］;表明 myosin VI與細(xì)胞的運動、遷移密切相關(guān)?，F(xiàn)有的報道顯示myosinVI與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān):Geisbrecht等［10］發(fā)現(xiàn)myosinVI起著維持調(diào)控E－cadherin和beta－catenin蛋白的作用。而Yoshida等［5］通過果蠅來模擬人卵巢癌遷移實驗中，發(fā)現(xiàn)myosinVI在正常的卵巢組織中低表達(dá)，但在高度惡性的卵巢癌中高度表達(dá)，同時抑制卵巢癌中的myosinVI的表達(dá)量可以減弱腫瘤細(xì)胞的擴(kuò)散，提示myosinVI在卵巢癌細(xì)胞的遷移中起到至關(guān)重要的作用。在人的前列腺癌中也發(fā)現(xiàn)中分化前列腺癌持續(xù)過表達(dá)myosin VI蛋白，而侵襲性強(qiáng)的前列腺癌組織myosin VI的表達(dá)更強(qiáng)于侵襲性弱的［11－12］;近期文獻(xiàn)報道免疫組化標(biāo)記 myosin VI、E －cadherin和β－catenin可以作為腎癌診斷的分子標(biāo)志物，與腎癌的預(yù)后相關(guān)［13］。上述研究說明myosin VI參與微絲聚合，促使細(xì)胞運動遷移，在腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移中扮演極為重要的角色。那是否所有的上皮惡性腫瘤中都有myosin VI的表達(dá)，扮演著腫瘤轉(zhuǎn)移關(guān)鍵因子的作用呢?

本實驗cDNA腫瘤譜列陣芯片包括了源自人體19種不同癌組織和配對正常組織cDNA樣本及10種腫瘤細(xì)胞株，其中12對組織各有10對cDNA樣本，小腸和胰腺各7對，膀胱5對，女性外陰5對，前列腺4對，氣管3對，肝臟3對，連同10種腫瘤細(xì)胞株總共154對。每對樣本均取自同一病人的腫瘤組織及癌旁5 cm以外的正常組織，通過病理學(xué)形態(tài)檢測無誤。一次Northern雜交即可完成myosin VI在不同癌組織中的表達(dá)情況，因膀胱等5對組織樣本量相對較少，本實驗未納入統(tǒng)計學(xué)分析;在其余14種上皮腫瘤中，myosin VI在11種腫瘤如卵巢、結(jié)腸、乳腺、胃、肺、胰腺等癌組織表達(dá)明顯高于癌旁組織，其中卵巢癌和結(jié)腸癌組織的表達(dá)豐度與配對正常組織差異顯著(P＜0.01);而在腎、皮膚、睪丸組織中myosin VI表達(dá)下調(diào);這與 Yoshida等［5］報道的基本一致。前列腺因其只含有4對cDNA樣本，未納入統(tǒng)計學(xué)分析，因而與Dunn等［11］的報道有出入。腎癌組織中myosin VI表達(dá)下調(diào)，但差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義，與前人的研究結(jié)果不一致，有待進(jìn)一步實驗驗證。

卵巢腫瘤組織芯片進(jìn)一步證實了Northern雜交結(jié)果的準(zhǔn)確性，免疫組化結(jié)果顯示myosin VI只表達(dá)于卵巢上皮細(xì)胞，陽性信號主要定位于細(xì)胞漿，細(xì)胞核也有少量表達(dá)。其在癌旁及囊腺瘤組織中不表達(dá)或弱表達(dá)，陽性率為10.4%(5/48);交界性腫瘤表達(dá)陽性，陽性率為81.3%(13/16);而在癌組織中均表達(dá)，陽性率為100%(52/52)。按組織分化程度不同將卵巢腫瘤分為高級別(中低分化)、低級別(高分化)和交界性腫瘤共3組，其表達(dá)呈中等陽性(++)以上的陽性率分別為 87.9%(29/33)、73.7%(14/19)和31.3%(5/16)，經(jīng)χ2檢驗前兩者差異不明顯(P＞0.05)，但后兩者之間差異顯著(P＜0.05)。Myosin VI在卵巢的交界性上皮腫瘤、低級別卵巢癌和高級別卵巢癌的表達(dá)呈逐漸增強(qiáng)趨勢。這說明myosin VI不僅在卵巢癌組織異常高表達(dá)，驗證了芯片結(jié)果的可靠性，還進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)myosin VI的表達(dá)與卵巢癌的組織分化程度密切相關(guān)，隨著惡性度的增強(qiáng)其表達(dá)也呈逐漸增強(qiáng)趨勢。本研究提示myosin VI可能在卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用，可能與卵巢癌的侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)。而myosin VI在其它腫瘤如結(jié)腸癌和腎癌中的作用如何將是下一步實驗研究的方向。

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