長期培養(yǎng)的人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞PCNA、IL－6、IL－11 和galectin－3 的表達(dá)*

毛文哲， 許 超， 李揚(yáng)秋， 陳少華， 柳 菁， 劉 俊， 廖繼東△

(暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院1田家炳醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，2血液病研究所，3生物化學(xué)教研室，廣東 廣州510632)

間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是一群中胚層來源的具有自我更新和多向分化潛能的多能成體干細(xì)胞，在細(xì)胞治療、組織修復(fù)、基因治療等方面顯示出巨大的應(yīng)用潛力。人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells，hUC－MSCs)具有含量豐富、取材方便的特征，其采集過程對母胎均無不良影響，是理想的MSCs 來源［1］。

hUC－MSCs 較骨髓等其它組織來源MSCs 具有更強(qiáng)的分化增殖能力、更低的免疫原性，在體外連續(xù)培養(yǎng)達(dá)80 個(gè)細(xì)胞倍增時(shí)間可仍保持其多向分化潛能和增殖能力［2－3］。有學(xué)者采用基因芯片掃描不同培養(yǎng)條件下50 d 傳代培養(yǎng)的人骨髓MSCs，顯示其基因表達(dá)譜隨培養(yǎng)時(shí)間的增加而波動幅度增大［4］。我們曾報(bào)道在常規(guī)體外培養(yǎng)環(huán)境下，隨著傳代次數(shù)的遞增，hUC－MSCs 的增殖及粘附能力下降，細(xì)胞凋亡率增加，生物學(xué)活性呈逐漸下降趨勢［5］。已知MSCs發(fā)揮其造血支持、免疫調(diào)節(jié)功能與細(xì)胞因子密切相關(guān)［6－7］。本研究進(jìn)一步分析hUC－MSCs 在長期培養(yǎng)傳代過程中增殖細(xì)胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)、白細(xì)胞介素－6 (interleukin－6，IL－6)、IL－11 和半乳糖凝集素－3(galectin－3)mRNA 及蛋白表達(dá)趨勢，為hUC－MSCs 的實(shí)驗(yàn)研究和臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)資料和理論依據(jù)。

材 料 和 方 法

1 材料和試劑

無菌條件下采集足月剖宮產(chǎn)胎兒臍帶6 份，均征得產(chǎn)婦及家屬的同意，由暨南大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科提供;DMEM/F12 培養(yǎng)基和胎牛血清購自Gibco;人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞成骨、成脂誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基購自Cyagen;RNAsimple Total RNA Kit、TIANScript RT Kit、2 ×Taq Platinum PCR MasterMix 和RealMasterMix(SYBR GreenⅠ)購自北京天根生化科技有限公司;人IL－6 和人IL－11 定量檢測試劑盒購自上海西唐生物科技有限公司;RIPA 裂解液購自上海碧云天生物科技研究所;galectin－3 和β－actin 抗體購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司;所有引物由英維捷基貿(mào)易有限公司合成。

2 hUC－MSCs 的分離、傳代和生物學(xué)特征鑒定

取8 cm 無菌臍帶組織，PBS 洗除余血，剪成約1 mm×1 mm×1 mm，經(jīng)0.2%膠原酶Ⅱ37 ℃振蕩消化2 h，過濾收集細(xì)胞，用含10%FBS 的DMEM/F12溶液按2.4 ×104cells/cm2密度接種于康寧25 cm2塑料培養(yǎng)瓶，置37 ℃、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)培養(yǎng)細(xì)胞達(dá)90%融合時(shí)，用0. 25% 胰酶消化，并按同一細(xì)胞密度傳代。收集第3、28 代細(xì)胞，用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞表型。同時(shí)另取適量細(xì)胞于內(nèi)含膠原蛋白處理無菌蓋玻片的6 孔板內(nèi)，如前繼續(xù)培養(yǎng)。成骨誘導(dǎo)組24 h 后將培養(yǎng)基更換為成骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基(含DMEM/F12、10%胎牛血清、青霉素－鏈霉素雙抗、L－谷氨酰胺、抗壞血酸鹽、β－甘油磷酸及地塞米松)，每3 d 換1 次液，2 ～3 周后，茜素紅染色鑒定;成脂誘導(dǎo)組待細(xì)胞達(dá)到過融合狀態(tài)時(shí)，將培養(yǎng)基更換為成脂誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基A 液(含DMEM/F12、10%胎牛血清、青霉素－鏈霉素雙抗、L－谷氨酰胺、胰島素、IBMX、吲哚美辛及地塞米松)，3 d 后更換為B 液(含DMEM/F12、10%胎牛血清、青霉素－鏈霉素雙抗、L－谷氨酰胺和胰島素)，24 h 后再次更換A 液，如此循環(huán)3 ～5 次后，以B 液培養(yǎng)7 d，油紅O 染色鑒定。

3 qRT－PCR 檢測PCNA、IL－6、IL－11 和galectin－3 mRNA 表達(dá)

分別收集第3、8、18、28、33 代達(dá)90%融合狀態(tài)的hUC－MSCs，按天根RNAsimple Total RNA Kit 提取RNA，TIANScript RT Kit 合成cDNA，用前按101，102，103，104稀釋。根據(jù)GenBank 數(shù)據(jù)庫，由Primer premier 5.0 軟件設(shè)計(jì)、公司合成人PCNA、IL－6、IL－11、galectin－3 和β2－微球蛋白(β2－microglobulin，β2M)引物。引物序列和預(yù)計(jì)擴(kuò)增片段長度見表1。根據(jù)Real Master Mix(含SYBR GreenⅠ)配置PCR反應(yīng)體系，95 ℃3 min 30 s，95 ℃15 s，Tm 30 s，70 ℃1 min 15 s，讀板，共44 個(gè)循環(huán)。結(jié)果以擴(kuò)增循環(huán)數(shù)(Ct 值)為縱坐標(biāo)，各稀釋度的對數(shù)值為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。觀察擴(kuò)增動力學(xué)曲線和溶解曲線，用公式2－ΔΔCt方法進(jìn)行相對定量，計(jì)算得出目的基因相對于管家基因β2M 的量。

表1 引物序列Table 1. Sequences of the primers

4 ELISA 檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清IL－6 和IL－11 含量

按1 ×108cells/L 濃度接種hUC－MSCs 于6 孔板中，當(dāng)細(xì)胞達(dá)90%融合時(shí)，收集上清，按人IL－6和IL－11 定量檢測試劑盒操作分別檢測第3、8、18、28、33 代細(xì)胞的IL－6 和IL－11 分泌量。

5 Western bloting 檢測galectin－3 蛋白表達(dá)

采用RIPA 裂解液分別抽提第3、8、18、28、33 代hUC－MSCs 總蛋白。用10%分離膠SDS－PAGE 電泳，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉室溫封閉4 h，加Ⅰ抗孵育，標(biāo)記結(jié)合Ⅱ抗，ECL 熒光顯色定影。

6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用SPSS 16.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，多組間比較采用單因素方差分析(ANOVA)，組間兩兩比較采用最小顯著差異法(LSD 法)。以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 hUC－MSCs 的形態(tài)及生長特性

經(jīng)膠原酶消化分離的人臍帶細(xì)胞接種24 h 后貼壁，3 d 后細(xì)胞形態(tài)呈多邊形或長梭形，同時(shí)含有部分雜細(xì)胞，見圖1A。傳至第3 代時(shí)細(xì)胞呈長梭形、大小均一平行排列為螺旋狀或旋渦狀的成纖維母細(xì)胞樣，見圖1B。繼續(xù)培養(yǎng)至第23 代，細(xì)胞形態(tài)無明顯變化，見圖1C。當(dāng)培養(yǎng)至第28 代時(shí)，細(xì)胞生長速度減緩，細(xì)胞變大，形態(tài)雜亂，見圖1D。

Figure 1. Morphology of human umbilical cord mesenchymal stem cells at different passages (×100). A:primary cells;B:passage 3;C:passage 23;D:passage 28.圖1 不同代人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的形態(tài)

2 hUC－MSCs 的分化能力

第3 代和第28 代hUC－MSCs 經(jīng)成骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)后，茜素紅染色細(xì)胞間可見大量的紅色鈣化基質(zhì)沉積，見圖2A、B;經(jīng)成脂誘導(dǎo)分化培養(yǎng)后，油紅O染色，細(xì)胞內(nèi)可見紅色脂滴，見圖2C、D，表明它們均具有向成骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞分化的潛能。

Figure 2. Osteogenic (A，B;alizarin red staining，×100)and lipogenic (C，D;oil red O staining，×200)differentiation of human umbilical cord mesenchymal stem cells at the 3rd (A，C)and 28th (B，D)passages.圖2 第3、28 代人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨和成脂分化

3 hUC－MSCs 的表型

流式細(xì)胞術(shù)檢測顯示體外培養(yǎng)第3 代和第28代hUC－MSCs 的細(xì)胞表型均為:CD29+/CD44+/CD105+/CD31－/CD34－/CD40－/CD45－/CD106－/HLA－DR－，見圖3A、B。

4 不同代hUC－MSCs PCNA mRNA 的表達(dá)

不同代hUC－MSCs 的qRT－PCR 檢測結(jié)果見表2，隨著傳代次數(shù)的增加，PCNA mRNA 的表達(dá)量逐漸降低，第28、33 代細(xì)胞與第3、8、18 代相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05 或P ＜0.01)，第33 代較第3 代降低了33%(P ＜0.01)。

5 不同代hUC－MSCs IL－6 的mRNA 表達(dá)和蛋白分泌

不同代hUC－MSCs 的qRT－PCR 檢測結(jié)果見表2，隨著傳代次數(shù)的增加，IL－6 mRNA 逐漸降低，第28、33 代與第3、8、18 代相比差異顯著(P ＜0.05 or P ＜0.01)，第33 代較第3 代IL－6 mRNA 的表達(dá)量降低了56%(P ＜0.01)。ELISA 檢測結(jié)果見表3，隨著傳代次數(shù)的增加，IL－6 蛋白分泌量也逐漸降低，第28、33 代與第3、8、18 代相比差異顯著(P ＜0.01)，第33 代較第3 代降低了50.3%(P ＜0.01)。

6 不同代hUC－MSCs IL－11 的mRNA 表達(dá)和蛋白分泌

Figure 3. The surface markers of human umbilical cord mesenchymal stem cells at the 3rd and 28th passages detected by flow cytometry. A:passage 3;B:passage 28.圖3 流式細(xì)胞術(shù)檢測第3 代和第28 代人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞表型

表2 不同代人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的PCNA 、IL－6、IL－11 和galectin－3 mRNA 表達(dá)量Table 2. Expression of PCNA，IL－6，IL－11 and galectin－3 mRNA in different passages of human umbilical cord mesenchymal stem cells (±s.n=6)

表2 不同代人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的PCNA 、IL－6、IL－11 和galectin－3 mRNA 表達(dá)量Table 2. Expression of PCNA，IL－6，IL－11 and galectin－3 mRNA in different passages of human umbilical cord mesenchymal stem cells (±s.n=6)

* P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs passage 3;#P ＜0.05，##P ＜0.01 vs passage 28;△P ＜0.05，△△P ＜0.01 vs passage 33.

Group PCNA IL－6 IL－11 Galectin－3 Passage 3 1##△△ 1##△△ 1##△△1 Passage 8 0.99 ±0.18#△△ 0.99 ±0.24##△△ 1.24 ±0.37##△△ 1.07 ±0.17 Passage 18 0.98 ±0.15##△△ 0.63 ±0.17＊＊#△ 0.88 ±0.15* ##△△ 1.02 ±0.19 Passage 28 0.76 ±0.18＊＊ 0.42 ±0.22＊＊ 0.69 ±0.11＊＊ 1.01 ±0.25 Passage 33 0.67 ±0.15＊＊ 0.44 ±0.14＊＊ 0.63 ±0.14＊＊0.97 ±0.16

表3 不同代人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的IL－6 和IL－11 分泌量Table 3. Secretion of IL－6 and IL－11 in different passages of human umbilical cord mesenchymal stem cells (ng/L.±s.n=6)

表3 不同代人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的IL－6 和IL－11 分泌量Table 3. Secretion of IL－6 and IL－11 in different passages of human umbilical cord mesenchymal stem cells (ng/L.±s.n=6)

* P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs passage 3;#P ＜0.05，##P ＜0.01 vs passage 28;△P ＜0.05，△△P ＜0.01 vs passage 33.

Group IL－6 IL－11 Passage 3 211.44±30.20##△△ 147.23±12.20##△△Passage 8 206.59±28.50##△△ 157.87±13.60##△△Passage 18 144.94±17.10＊＊#△△ 118.85±10.20＊＊##△△Passage 28 118.14±15.80＊＊ 50.10±6.10＊＊△Passage 33 105.01±12.20＊＊ 60.39±5.90＊＊

不同代hUC－MSCs的qRT－PCR 檢測 結(jié)果見表2，隨著傳代次數(shù)的增加，IL－11 mRNA 逐漸降低，第18、28、33 代與第3、8 代相比差異顯著(P ＜0.05 or P ＜0.01)，第33 代較第3 代表達(dá)量降低了37%(P ＜0.01)。ELISA 檢測結(jié)果見表3，隨著傳代次數(shù)的增加，IL－11 蛋白分泌量也會逐漸降低，第28、33代與第3、8、18 代相比差異顯著(P ＜0.01)，第33 代較第3 代降低了58.9%(P ＜0.01)。

7 不同代hUC－MSCs galectin－3 mRNA 和蛋白的表達(dá)

不同代hUC－MSCs 的qRT－PCR 檢測結(jié)果見表2，顯示各代細(xì)胞之間galectin－3 mRNA 表達(dá)量無顯著差異(P ＞0.05)。Western bloting 結(jié)果見圖4，顯示各代間galectin－3 蛋白條帶亮度無明顯差異。

Figure 4. Expression of galectin－3 protein in different passages of human umbilical cord mesenchymal stem cells. 1:passage 3;2:passage 8;3:passage 18;4:passage 28;5:passage 33.圖4 不同代人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞galectin－3 蛋白的表達(dá)

討 論

MSCs 源自發(fā)育早期的中胚層，存在于多種機(jī)體組織內(nèi)，具有來源廣泛、取材容易、分離純化程序簡單，便于體外長期傳代培養(yǎng)擴(kuò)增和保存等優(yōu)點(diǎn)，已成為替代治療和基因治療領(lǐng)域中極具實(shí)用價(jià)值的干細(xì)胞。MSCs 能釋放大量細(xì)胞因子，在機(jī)體內(nèi)相互促進(jìn)或相互抑制，形成十分復(fù)雜的細(xì)胞因子調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)［8］，對于MSCs 發(fā)揮造血支持、免疫調(diào)節(jié)、組織修復(fù)等功能具有重要意義。本文分析常規(guī)條件下長期傳代培養(yǎng)hUC－MSCs 的功能相關(guān)細(xì)胞因子PCNA、IL－6、IL－11 和galectin－3 mRNA 和蛋白表達(dá)變化情況，探討hUC－MSCs 相關(guān)功能在長期培養(yǎng)過程中的變化趨勢，為獲取具有最佳性能的hUC－MSCs 或選擇適當(dāng)?shù)募?xì)胞因子作干細(xì)胞治療輔助手段提供實(shí)驗(yàn)資料和理論依據(jù)。

從正常剖宮產(chǎn)胎兒臍帶華氏膠組織中提取細(xì)胞，經(jīng)塑料培養(yǎng)瓶貼壁、傳代培養(yǎng)3 代后細(xì)胞呈均一的梭形成纖維母細(xì)胞樣聚集分布，傳代至第23 代時(shí)細(xì)胞形態(tài)無明顯變化，而傳代至第28 代時(shí)細(xì)胞有老化現(xiàn)象，繼續(xù)傳代至第33 代時(shí)老化現(xiàn)象尤其突出，細(xì)胞形體較大，碎片較多，生物學(xué)活性明顯降低，細(xì)胞生長不能維持到誘導(dǎo)分化所需的時(shí)間。為鑒定培養(yǎng)傳代起始和后期細(xì)胞的生物學(xué)特性，取第3 代和第28 代細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞表型和誘導(dǎo)分化能力的鑒定。第3 代和第28 代細(xì)胞表型均為CD29+/CD44+/CD105+/CD31－/CD34－/CD40－/CD45－/CD106－/HLA－DR－，且均可向成骨和脂肪細(xì)胞分化，證實(shí)我們從臍帶中分離培養(yǎng)的細(xì)胞符合首屆胎盤來源干細(xì)胞國際研討會及國際細(xì)胞治療協(xié)會關(guān)于MSCs 的標(biāo)準(zhǔn)［9］，且可傳代培養(yǎng)至第33 代，第28 代仍保持MSCs 表型和分化能力。

PCNA 是真核細(xì)胞DNA 聚合酶δ 的輔助蛋白，參與細(xì)胞增殖過程DNA 的合成，是反映細(xì)胞增殖活性的良好標(biāo)志物［10］，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示PCNA mRNA 表達(dá)隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加而減少，第33 代較第3 代PCNA mRNA 表達(dá)量降低了33%，差異顯著(P ＜0.01)，證實(shí)長期傳代培養(yǎng)的hUC－MSCs 增殖能力隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加而下降，與我們報(bào)道的長期傳代培養(yǎng)的hUC－MSCs 生物學(xué)活性呈逐漸下降趨勢的結(jié)果一致［5］。

MSCs 作為造血微環(huán)境主要細(xì)胞成分的來源，通過與造血細(xì)胞直接接觸、分泌細(xì)胞外基質(zhì)及多種細(xì)胞因子維持造血微環(huán)境結(jié)構(gòu)和功能的完整性，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)對造血的精細(xì)調(diào)控［11］。MSCs 與造血干細(xì)胞聯(lián)合移植可促進(jìn)造血重建［12］。Majumdar 等［13］研究發(fā)現(xiàn)骨髓MSCs 穩(wěn)定的表達(dá)多種造血相關(guān)因子，支持長期造血活動。Friedman 等［14］進(jìn)一步證實(shí)hUC－MSCs 分泌的造血相關(guān)細(xì)胞因子(粒細(xì)胞集落刺激因子、粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞刺激因子、肝細(xì)胞生長因子、白細(xì)胞抑制因子、IL－1a、IL－6、IL－8、IL－11)較骨髓MSCs 多。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)體外長期培養(yǎng)hUC－MSCs IL－6 及IL－11 的mRNA 和蛋白表達(dá)會隨細(xì)胞代數(shù)發(fā)生改變。第33 代較第3 代IL－6 和IL－11 mRNA及蛋白表達(dá)量均明顯降低(均P ＜0.01)，提示hUC－MSCs 的造血支持能力可能隨著體外長期培養(yǎng)傳代而降低，因此在臨床應(yīng)用時(shí)需考慮此因素。

MSCs 除了具有支持造血的功能外，還具有獨(dú)特的免疫學(xué)特性，在體外不僅能誘導(dǎo)免疫應(yīng)答，而且還具有抑制免疫反應(yīng)的作用。MSCs 免疫調(diào)節(jié)的機(jī)制主要涉及兩個(gè)方面，一方面是細(xì)胞的接觸機(jī)制，另一方面是非細(xì)胞接觸機(jī)制，即細(xì)胞因子的分泌和細(xì)胞蛋白的表達(dá)。Sioud 等［15］研究發(fā)現(xiàn)，galectin－3 是MSCs 發(fā)揮免疫抑制功能的重要調(diào)節(jié)分子，MSCs 表達(dá)的galectin－3 可以抑制同種異體T 細(xì)胞增殖。本實(shí)驗(yàn)顯示，在體外長期傳代培養(yǎng)過程中hUC－MSCs galectin－3 mRNA 的表達(dá)無明顯變化，且各代細(xì)胞間galectin－3 蛋白的表達(dá)亦無明顯差異，這是否意味著體外長期傳代培養(yǎng)對hUC－MSCs 的免疫調(diào)節(jié)功能沒有影響，這有待進(jìn)一步探討。

［1］ Seshareddy K，Troyer D，Weiss ML. Method to isolate mesenchymal－like cells from Wharton’s Jelly of umbilical cord［J］. Methods Cell Biol，2008，86:101－119.

［2］ Secco M，Zucconi E，Vieira NM. Mesenchymal stem cells from umbilical cord:do not discard the cord［J］. Neuromuscular Disord，2008，18(1):17－18.

［3］ Wulf GG，Chapuy B，Trumper L. Mesenchymal stem cells from bone marrow. Phenotype，aspects of biology，and clinical perspectives ［J］. Medizinische Klinik，2006，101(5):408－413.

［4］ Sawada R，Yamada T，Tsuchiya T，et al. A microarray analysis of the effects of serum－free medium on gene expression changes in human mesenchymal stem cell during the in vitro culture ［J］. Yakugaku Zasshi，2010，130(10):1387－1393.

［5］ 許 超，廖繼東，柳 菁，等.長期培養(yǎng)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的生物活性及其限制性［J］.中國組織工程研究與臨床康復(fù)，2011，15(10):1750－1754.

［6］ Kim DH，Yoo KH，Choi KS，et al. Gene expression profile of cytokine and growth factor during differentiation of bone marrow derived mesenchymal stem cell［J］. Cytokine，2005，31(2):119－126.

［7］ 朱雅姝，趙春華. 間充質(zhì)干細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)能力——臨床治療的希望［J］. 中國科學(xué):C 輯，2009，39(8):727－735.

［8］ Schinkothe T，Bloch W，Schmidt A. In vitro secreting profile of human mesenchymal stem cells［J］. Stem Cells Dev，2008，17(1):199－206.

［9］ Dominici M，Le Blanc K，Mueller I，et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells.The International Society for Cellular Therapy position statement［J］. Cytotherapy，2006，8 (4):315－317.

［10］ Kelman Z. PCNA:structure，functions and interactions［J］. Oncogene，1997，14(6):629－640.

［11］ 霍思維，張 毅. 間充質(zhì)干細(xì)胞在造血調(diào)控中的作用［J］. 中國實(shí)驗(yàn)血液學(xué)雜志，2006，14(1):187－190.

［12］ Battiwalla M，Hematti P.Mesenchymal stem cells in hematopoietic stem cell transplantation ［J］. Cytotherapy，2009，11(5):503－515.

［13］ Majumdar M，Thiede M，Haynesworth S，et al. Human marrow－derived mesenchymal stem cells (MSCs)express hematopoietic cytokines and support long－term hematopoiesis when differentiated toward stromal and osteogenic lineages［J］.J Hematother Stem Cell Res，2000，9(6):841－848.

［14］ Friedman R，Betancur M，Boissel L，et al. Umbilical cord mesenchymal stem cells:adjuvants for human cell transplantation ［J］. Biol Blood Marrow Transplant，2007，13(12):1477－1486.

［15］ Sioud M，Mobergslien A，Boudabous A，et al. Evidence for the involvement of galectin－3 in mesenchymal stem cell suppression of allogeneic T－cell proliferation［J］.Scand J Immunol，2010，71(4):267－274.