原子力顯微鏡觀察青蒿琥酯對(duì)人胃癌細(xì)胞株SGC－7901 膜表面形貌的影響*

柳佳利， 王 珣， 楊亞萍， 梁志紅， 孫 浩， 林 熙， 張 洋

(暨南大學(xué)1醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)專業(yè)，2分析測(cè)試中心，3醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)藥理學(xué)系，廣東 廣州510632;4廣東省人民醫(yī)院病理醫(yī)學(xué)部檢驗(yàn)科，廣東 廣州510080)

細(xì)胞膜是由磷脂雙分子層和鑲嵌、貫穿在其中及吸附在其表面的蛋白質(zhì)組成。它不單是細(xì)胞的物理屏障，而且在細(xì)胞的生命活動(dòng)中還發(fā)揮著細(xì)胞間信號(hào)的檢測(cè)與傳遞、物質(zhì)運(yùn)輸、能量轉(zhuǎn)換、細(xì)胞表面識(shí)別和細(xì)胞分化等許多復(fù)雜的功能。由于細(xì)胞外部化學(xué)信號(hào)無(wú)論是作用于細(xì)胞核的信號(hào)，還是作用于核外的信號(hào)，它們的傳遞都必須經(jīng)由細(xì)胞膜，與細(xì)胞膜表面的受體結(jié)合，或經(jīng)膜表面的特殊部位，如膜通道，進(jìn)入到細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮作用。因此研究細(xì)胞膜的形態(tài)和功能對(duì)認(rèn)識(shí)膜分子的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，蛋白質(zhì)分選及膜微結(jié)構(gòu)域的生理功能有重要的意義。

原子力顯微鏡(atomic force microscope，AFM)自20 世紀(jì)80 年代問(wèn)世以來(lái)，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域［1］。AFM 通過(guò)探測(cè)探針與被測(cè)樣品之間微弱的相互作用力(范德華力)來(lái)獲取樣品表面形貌的信息，與傳統(tǒng)的光學(xué)顯微鏡和電鏡相比，AFM 具有制作標(biāo)本簡(jiǎn)單、觀察環(huán)境廣泛、高分辨率的2D 和3D 形貌圖像［2］，以及在分子水平上進(jìn)行力譜曲線的檢測(cè)，獲得細(xì)胞機(jī)械性能的相關(guān)物理參數(shù)［3］等諸多優(yōu)點(diǎn)。AFM 被廣泛應(yīng)用于紅細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、細(xì)菌等成像研究［4-6］，使AFM 成為觀察和鑒別某些細(xì)胞的有力工具;同時(shí)近些年來(lái)，AFM 亦用于腫瘤細(xì)胞的成像研究，可作為檢測(cè)腫瘤細(xì)胞的凋亡以及評(píng)估抗腫瘤藥物療效的工具［7］。青蒿琥酯(artesunate，ART)是中藥青蒿提取物青蒿素的衍生物，已證實(shí)青蒿素及其衍生物具有抗瘧疾、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)等多種重要藥理作用，其中抗腫瘤作用日益受到重視［8］。如Yamachika 等［9］提出青蒿素通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡而殺傷腫瘤細(xì)胞;Cai 等［7，10］應(yīng)用AFM 觀察了青蒿素誘導(dǎo)Jurkat 細(xì)胞株(急性T 細(xì)胞白血病細(xì)胞系)凋亡，促使Jurkat 細(xì)胞膜的損傷的作用。盡管目前國(guó)內(nèi)外對(duì)青蒿素抗腫瘤的作用有不少的報(bào)道，但利用AFM 觀察青蒿素對(duì)腫瘤細(xì)胞膜(尤其是對(duì)實(shí)體瘤的細(xì)胞膜)形貌影響的相關(guān)報(bào)道仍比較少。本文以人胃癌細(xì)胞株SGC -7901 為研究對(duì)象，通過(guò)作用不同濃度的ART，采用原子力顯微鏡來(lái)觀察藥物對(duì)細(xì)胞表面形貌和超微結(jié)構(gòu)的影響，并結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)和激光共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞凋亡的情況。

材 料 和 方 法

1 主要試劑和儀器

人胃癌細(xì)胞株SGC -7901(中山大學(xué)中山醫(yī)學(xué)院);青蒿琥酯注射用滅菌粉末(廣西桂林制藥廠);RPM I -1640 培養(yǎng)基及胰酶(Gibco);胎牛血清(杭州四季青生物工程材料公司);Annexin V -FITC 試劑盒(南京凱基生物技術(shù)發(fā)展有限公司);DAPI 熒光探針(Sigma)。倒置顯微鏡(Olympus);BIOSCOPE Catalyst Scanasyst 型原子力顯微鏡(Bruker);FACS Aria 型流式細(xì)胞儀(BD);LSM 510 型激光共聚焦顯微鏡(Karl Zeiss)。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將人胃癌細(xì)胞株SGC -7901 接種于含10%胎牛血清的RPMI-1640 培養(yǎng)基中，置5%CO2、37 ℃的孵箱中常規(guī)培養(yǎng)，細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，每2 ～3 d 換液1 次，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)匯合時(shí)，按1∶3 傳代，每周傳代1 ～2 次。用0.25%胰蛋白酶+0.02% 乙二胺四乙酸消化，收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2.2 AFM 樣品制備 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，用完全培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為1 ×109cells/L，接種于6 孔培養(yǎng)板中，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h 后加入不同濃度(2.5 μmol/L、5 μmol/L 和10 μmol/L)青蒿琥酯。藥物作用24 h后用PBS 洗滌并重懸，滴于玻片上，使其自然鋪展，吸附10 min。然后用pH 7.4的PBS 緩沖液沖洗，用1%戊二醛溶液固定15 min，用蒸餾水沖洗3 次，室溫自然干燥后上機(jī)觀察。

2.3 AFM 樣品成像 將制備好的樣品置于Nano-Scope AFM 載物臺(tái)上，利用Olympus 倒置顯微鏡觀察細(xì)胞的分散情況，在大氣中應(yīng)用AFM 對(duì)樣品進(jìn)行掃描成像。在操作軟件中選擇 Scanasyst 模式，Scanasyst-Air 型探針，微懸臂彈性系數(shù)為0.4 N/m。AFM 圖像經(jīng)過(guò)自帶軟件(Nanoscope Analysis)平滑處理，以消除掃描方向上的低頻背景噪音。通過(guò)測(cè)量細(xì)胞核高度反映經(jīng)藥物作用后細(xì)胞核是否發(fā)生坍塌、腫脹等變化，利用軟件測(cè)量納米級(jí)表面粗糙度來(lái)觀察膜表面的粗糙程度，反映細(xì)胞表面超微結(jié)構(gòu)的變化。

2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡情況 采用Annexin V - FITC 和PI 雙染法對(duì)凋亡細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)。具體操作如下:收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SGC -7901細(xì)胞，常規(guī)消化后，接種于6 孔板，每孔加細(xì)胞液1 mL，待24 h 細(xì)胞完全貼壁后，加入青蒿琥酯干預(yù)24 h，然后用胰酶消化，在Buffer 液體中重懸，調(diào)整細(xì)胞濃度為1 ×109cells/L，加FITC 結(jié)合的Annexin V和PI 孵育15 min，上流式細(xì)胞儀測(cè)定凋亡細(xì)胞所占比例。流式細(xì)胞儀激發(fā)光波長(zhǎng)采用488 nm，檢測(cè)光波長(zhǎng)采用525 ～550 nm 的綠色FITC 熒光和 ＞575 nm 的紅色PI 熒光?；罴?xì)胞僅有很低的熒光強(qiáng)度，早期凋亡細(xì)胞有較強(qiáng)的綠色熒光，晚期凋亡細(xì)胞有綠色和紅色熒光雙重染色。每樣本收集1 ×105個(gè)細(xì)胞熒光信號(hào)，Cellquest 軟件分析結(jié)果，細(xì)胞凋亡率(%)=(早期凋亡細(xì)胞數(shù)+晚期凋亡細(xì)胞數(shù))÷ 細(xì)胞總數(shù)×100%。

2.5 DAPI 染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，用完全培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為1 ×109cells/L，接種于6 孔培養(yǎng)板中，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h 后，加入青蒿琥酯干預(yù)24 h，然后用PBS 洗滌并重懸，加入濃度為1 μmol·L-1DAPI 熒光染料，室溫避光反應(yīng)15 min，于激光共聚焦顯微鏡觀察并拍攝圖像。激發(fā)光為405 nm 氬離子激光，檢測(cè)波長(zhǎng)BP 420 ～470 nm。物鏡為63 倍油鏡，針孔直徑為1 μm。掃描激光強(qiáng)度為8%，觀察細(xì)胞核形態(tài)，以細(xì)胞皺縮、核固縮、染色質(zhì)凝聚和熒光強(qiáng)度增強(qiáng)等作為凋亡細(xì)胞指征。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 11.5 統(tǒng)計(jì)分析軟件處理。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 青蒿琥酯對(duì)SGC－7901 細(xì)胞形態(tài)學(xué)的影響

倒置顯微鏡下觀察各組細(xì)胞，對(duì)照組細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)牢固，呈長(zhǎng)梭形或三角形，分化較好，細(xì)胞明亮清晰，折光性好，胞質(zhì)分布均勻，且在細(xì)胞中間部分有明顯的細(xì)胞核，見(jiàn)圖1A。不同濃度的青蒿琥酯作用24 h 后，細(xì)胞貼壁不牢，細(xì)胞脫落，懸浮細(xì)胞增多，細(xì)胞變圓，體積變小，伴核固縮，染色質(zhì)濃縮致密，胞質(zhì)內(nèi)分泌顆粒增多，細(xì)胞折光性下降，可見(jiàn)大量細(xì)胞碎片，見(jiàn)圖1B、C、D。

2 原子力顯微鏡觀察藥物作用后細(xì)胞表面形貌的變化

應(yīng)用原子力顯微鏡在大氣中對(duì)4 組細(xì)胞掃描成像，獲得了各組單個(gè)細(xì)胞的拓?fù)湫蚊矆D和三維結(jié)構(gòu)圖，并對(duì)細(xì)胞表面超微結(jié)構(gòu)進(jìn)行掃描分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，3 組加藥組的細(xì)胞形態(tài)明顯不同。掃面范圍為40 μm×40 μm，對(duì)照組的細(xì)胞鋪展的舒展，核區(qū)飽滿，膜表面平坦光滑，見(jiàn)圖2A、E;而3 組加藥組細(xì)胞逐漸萎縮，核區(qū)發(fā)生明顯塌陷，核區(qū)高度依次降低，見(jiàn)圖2M、N、O、P，且膜表面形成了明顯的孔洞，凹陷和裂隙。隨藥物濃度的加大，孔洞直徑加大，數(shù)量增多，見(jiàn)圖2B、C、D、F、G、H。利用原子力顯微鏡自帶的分析軟件Nanoscope Analysis 測(cè)量核區(qū)高度:對(duì)照組(1280.41 ±82.52)nm 顯著高于2.5 μmol/L ART 組(855.38 ±76.88)nm，5 μmol/L ART組(742.82 ±39.82)nm 和10 μmol/L ART 組(648.25 ±34.01)nm，P ＜0.05，見(jiàn)表1。這說(shuō)明藥物使腫瘤細(xì)胞的膜表面形貌和細(xì)胞核形態(tài)均產(chǎn)生了變化。

Figure 1. Morphological changes of SGC - 7901 cells treated with different concentrations of ART for 24 h (×200).A:control;B:2.5 μmol/L ART;C:5 μmol/L ART;D:10 μmol/L ART.圖1 不同濃度的青蒿琥酯處理SGC－7901 細(xì)胞24 h 后細(xì)胞形態(tài)的變化

為了進(jìn)一步探索細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)與藥物之間的關(guān)系，用AFM 獲取細(xì)胞表面精細(xì)結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，AFM 能清楚地觀察到細(xì)胞表面布滿顆粒狀物質(zhì)，且顆粒形態(tài)有明顯差異。對(duì)照組表面顆粒較密集，有的呈條索狀，有的聚集成團(tuán)，堆積較為緊湊，見(jiàn)圖2I。而加藥組細(xì)胞表面有明顯的陷窩，顆粒稀少，分布較疏松，見(jiàn)圖2J、K、L。細(xì)胞表面粗糙度是與細(xì)胞形貌相關(guān)的重要參數(shù)之一，通過(guò)分析軟件測(cè)量得到超微結(jié)構(gòu)參數(shù)值，見(jiàn)表1。與對(duì)照組細(xì)胞膜表面的平均粗糙度(average roughness，Ra)和均方粗糙度(root mean square roughness，Rq)(Rq = 89.96 nm ±8.90 nm，Ra= 74.20 nm ±8.05 nm)相比，隨藥物濃度的增加，2.5 μmol/L ART 組(Rq = 59.28 nm ± 7.65 nm，Ra = 46.98 nm ±6.54 nm)，5 μmol/L ART 組(Rq = 53.28 nm±6.98 nm，Ra = 42.28 nm± 6.77 nm)和10 μmol/L ART 組(Rq = 49.36 nm ±6.81 nm，Ra=38.86 nm± 5.38 nm)均降低(P ＜0.05)。目前認(rèn)為AFM 觀察到得這些膜表面顆粒是細(xì)胞表面蛋白質(zhì)、脂、糖等生物大分子的超微表征，它們?cè)诩?xì)胞生命活動(dòng)中發(fā)揮著重要作用。粗糙度是細(xì)胞形貌的超微結(jié)構(gòu)重要參數(shù)之一，已證實(shí)細(xì)胞表面粗糙度的大小與細(xì)胞骨架的完整性相關(guān)［11］。我們推測(cè)粗糙度的降低可能是藥物作用于膜表面分子，使細(xì)胞骨架發(fā)生重排，導(dǎo)致細(xì)胞呈現(xiàn)不同的形貌，而這些形貌的改變被認(rèn)為是與細(xì)胞粘附、增殖等特性密切相關(guān)的［12-13］。由AFM 獲得的以上這些定量的數(shù)據(jù)是無(wú)法由其它高分辨率成像儀器(例如透射電子顯微鏡、掃描電子顯微鏡和激光共聚焦掃描顯微鏡)獲得的。

Figure 2. AFM morphological images of SGC-7901 cells treated with different concentrations of ART for 24 h. A，E，I，M:control;B，F(xiàn)，J，N:2.5 μmol/L ART;C，G，K，O:5 μmol/L ART;D，H，L，P:10 μmol/L ART. A ～D:topography (40 μm×40 μm);E ～H:three-dimensional morphological images;I ～L:ultrastructure of the corresponding areas in A ～D;M ～P:height profiles along the corresponding lines in A ～D.圖2 不同濃度的青蒿琥酯處理24 h 后各組細(xì)胞的原子力顯微鏡形貌圖

表1 不同濃度的青蒿琥酯作用下SGC－7901 細(xì)胞的各種超微結(jié)構(gòu)參數(shù)Table 1. Ultrastructure parameters of SGC -7901 cells treated with different concentrations of ART(nm. ±s.n=6)

表1 不同濃度的青蒿琥酯作用下SGC－7901 細(xì)胞的各種超微結(jié)構(gòu)參數(shù)Table 1. Ultrastructure parameters of SGC -7901 cells treated with different concentrations of ART(nm. ±s.n=6)

* P ＜0.05 vs control.

Group Mean height Surface root mean square roughness Surface average roughness Control 1280.41±82.52 89.96±8.90 74.20±8.05 2.5 μmol/L ART 855.38±76.88* 59.28±7.65* 46.98±6.54*5 μmol/L ART 742.82±39.82* 53.28±6.98* 42.28±6.77*10 μmol/L ART 648.25±34.01* 49.36±6.81* 38.86±5.38*

3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡

經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)分析，2.5、5 和10 μmol/L ART 作用于SGC -7901 細(xì)胞24 h 后，細(xì)胞凋亡率分別為(9. 80 ±0. 99)%、(17. 70 ±1. 87)% 和(21. 20 ±2.28)%，細(xì)胞凋亡率逐漸增加，與對(duì)照組［(6.90 ±0.69)%］相比，均有顯著差異(P ＜0.05)，見(jiàn)表2。

表2 各組凋亡率比較Table 2. Comparison of the apototic rate in each group (%. ±s.n=6)

表2 各組凋亡率比較Table 2. Comparison of the apototic rate in each group (%. ±s.n=6)

* P ＜0.05 vs control.

Group Apotosis rate Control 6.90 ±0.69 2.5 μmol/L ART 9.80 ±0.99*5 μmol/L ART 17.70 ±1.87*10 μmol/L ART 21.20 ±2.28*

4 DAPI 熒光染料染色觀察細(xì)胞核形態(tài)

激光共聚焦顯微鏡顯示，對(duì)照組細(xì)胞形態(tài)規(guī)則，偶有凋亡細(xì)胞，見(jiàn)圖3A。ART 作用24 h 后，加藥組呈現(xiàn)出許多凋亡細(xì)胞的形態(tài):細(xì)胞皺縮，核呈波紋狀，折縫樣或菊花狀，部分染色質(zhì)出現(xiàn)濃縮狀態(tài)，見(jiàn)圖3B;細(xì)胞核的染色質(zhì)高度凝聚、邊緣化，核膜裂解、染色質(zhì)分割成塊狀，見(jiàn)圖3C;細(xì)胞凋亡晚期細(xì)膜依然完整，核裂解為碎塊，形成膜包被的細(xì)胞碎片產(chǎn)生凋亡小體，見(jiàn)圖3D。

Figure 3. The apoptosis of SGC -7901 cells treated with different concentrations of ART observed under laser scanning confocal microscope (DAPI staining).A:control;B:2.5 μmol/L ART;C:5 μmol/L ART;D:10 μmol/L ART.圖3 激光掃描共聚焦顯微鏡觀察不同濃度青蒿琥酯誘導(dǎo)的SGC－7901 細(xì)胞的凋亡情況

討 論

本研究利用AFM 高分辨的成像特點(diǎn)，選取人胃癌細(xì)胞株SGC-7901 為研究對(duì)象，通過(guò)作用不同濃度的抗腫瘤藥物青蒿琥酯，觀察藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞表面形貌的影響。AFM 結(jié)果顯示:加藥組細(xì)胞核發(fā)生萎縮和塌陷，核區(qū)高度明顯下降，我們推測(cè)細(xì)胞出現(xiàn)了凋亡形態(tài)學(xué)的改變，結(jié)合流式細(xì)胞儀檢測(cè)到的青蒿琥酯誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，激光共聚焦顯微鏡在形態(tài)學(xué)上進(jìn)一步證明了細(xì)胞發(fā)生了凋亡，形成了凋亡的典型形態(tài)-凋亡小體。提示AFM 圖像的細(xì)胞核區(qū)的變化可能正是細(xì)胞形態(tài)隨凋亡的發(fā)展而發(fā)生的相應(yīng)改變，凋亡過(guò)程中伴隨一系列的形態(tài)學(xué)變化，當(dāng)藥物濃度較低時(shí)，細(xì)胞核出現(xiàn)凋亡的早期變化，即細(xì)胞脫離臨近細(xì)胞，胞質(zhì)及胞漿濃縮，染色質(zhì)固縮，AMF 圖像觀察到細(xì)胞萎縮，核高度降低;隨藥物濃度的加大，出現(xiàn)凋亡核碎裂、核微塊等，細(xì)胞核完全崩解，所以AMF 圖像觀察到細(xì)胞核萎縮，坍塌，核區(qū)高度進(jìn)一步的降低。由此可見(jiàn)，細(xì)胞凋亡的發(fā)生、發(fā)展與AFM 圖像的核區(qū)變化呈對(duì)應(yīng)關(guān)系。我們還觀察到細(xì)胞膜表面形成了明顯的孔洞和凹陷;隨藥物濃度的增加，空洞變大，數(shù)量也增多。這是細(xì)胞膜完整性受到破壞的表現(xiàn)，必將改變細(xì)胞內(nèi)外的離子環(huán)境，影響正常的生化過(guò)程，提示藥物可能有改變膜通透性的作用。因?yàn)樗幬锎龠M(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡的途徑可能是多方面的。通過(guò)超微結(jié)構(gòu)觀察到加藥組細(xì)胞顆粒狀物質(zhì)的形態(tài)有明顯差異，膜表面粗糙度降低。細(xì)胞表面粗糙度是與細(xì)胞形貌相關(guān)的重要參數(shù)之一，已證實(shí)細(xì)胞表面粗糙度的大小與細(xì)胞骨架的完整性相關(guān)。細(xì)胞骨架是真核細(xì)胞中的蛋白質(zhì)纖維網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)，構(gòu)成細(xì)胞的骨骼，支持著整個(gè)細(xì)胞，它緊貼在細(xì)胞膜下，賦予細(xì)胞一定的形狀，對(duì)細(xì)胞及細(xì)胞器的運(yùn)動(dòng)也起著至關(guān)重要的作用。細(xì)胞骨架包括3 種類(lèi)型，即微絲、中間纖維及微管。微絲的主要構(gòu)成成分是肌動(dòng)蛋白(actin)，在細(xì)胞內(nèi)以兩種形式存在:聚合態(tài)(fibrous actin，F(xiàn)-actin)和游離態(tài)(globular actin，G-actin)，F(xiàn)-actin 呈纖維狀，參與維持細(xì)胞的形態(tài)、賦予質(zhì)膜機(jī)械強(qiáng)度，細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)，胞質(zhì)分裂，肌肉收縮等多種功能，其結(jié)構(gòu)重排及聚合和解聚的變化，在一定程度上反映了細(xì)胞的功能狀況。F -actin 能夠解聚成G -actin，G -actin 也能夠聚合成F -actin，這個(gè)過(guò)程是可逆的。正常情況下細(xì)胞內(nèi)的兩種肌動(dòng)蛋白處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，當(dāng)受到一定的刺激后，細(xì)胞內(nèi)游離的G-actin 彼此結(jié)合形成F-actin，進(jìn)而通過(guò)自身螺旋組裝形成微絲，此過(guò)程即細(xì)胞的骨架重排。微絲的重組裝與分布，為細(xì)胞內(nèi)外信息傳遞提供分子橋梁，控制細(xì)胞形態(tài)、運(yùn)動(dòng)、增殖等生物效應(yīng)。細(xì)胞骨架的改變是細(xì)胞凋亡的一個(gè)重要標(biāo)志［14］。藥物誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡的途徑可能是多方面的，其中有可能是通過(guò)細(xì)胞骨架來(lái)實(shí)現(xiàn)的。而另一方面，細(xì)胞凋亡的發(fā)生、發(fā)展也需要依賴細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)和功能的完整性，細(xì)胞凋亡過(guò)程中伴隨的一系列形態(tài)學(xué)改變，如凋亡細(xì)胞從周?chē)?xì)胞中脫離、胞質(zhì)出芽、凋亡小體的形成等也都是與細(xì)胞骨架系統(tǒng)密不可分［15-16］。

Ehrenhoefer 等［17］提出AFM 觀測(cè)到的細(xì)胞膜表面的這些顆粒很可能是膜表面的蛋白質(zhì)、脂、糖等的單體或聚集體等特化結(jié)構(gòu)。在細(xì)胞的生命活動(dòng)中，膜磷脂雙分子層內(nèi)富含鞘脂類(lèi)和膽固醇的細(xì)胞膜微結(jié)構(gòu)域，可選擇性地募集某些蛋白分子，此微結(jié)構(gòu)域像“筏”一樣，在細(xì)胞膜表面可側(cè)向移動(dòng)，故而被稱為脂筏(lipid raft)。脂筏區(qū)含有很多的脂質(zhì)及蛋白質(zhì)組分，在細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)和細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，當(dāng)參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和蛋白質(zhì)運(yùn)轉(zhuǎn)時(shí)，其構(gòu)像也會(huì)發(fā)生相應(yīng)的轉(zhuǎn)化和優(yōu)化，有利于蛋白質(zhì)之間的相互作用。van Meer 等［18］在誘導(dǎo)凋亡的藥物實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，脂伐參與配體、受體和激酶之間相互作用所激發(fā)的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)而激活凋亡途徑。因此我們推測(cè)青蒿琥酯與脂伐內(nèi)凋亡有關(guān)的信號(hào)分子結(jié)合，使蛋白質(zhì)發(fā)生變構(gòu)，啟動(dòng)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的級(jí)聯(lián)反應(yīng)而誘導(dǎo)靶細(xì)胞凋亡，具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

本研究利用原子力顯微鏡在納米級(jí)分辨率下觀察到抗腫瘤藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞膜超微結(jié)構(gòu)的影響，為研究抗腫瘤藥物與細(xì)胞膜的相互作用提供新的思路，使原子力顯微鏡發(fā)展成為研究生命科學(xué)的一個(gè)有力工具，為揭示藥物的作用機(jī)制提供可視化參考。如果將AFM 和其它儀器設(shè)備(如透射電子顯微鏡、掃描電子顯微鏡、激光共聚焦掃描顯微鏡、生物質(zhì)譜、核磁共振等)有機(jī)地結(jié)合起來(lái)，相互補(bǔ)充，取長(zhǎng)補(bǔ)短，一定會(huì)獲得很好的研究結(jié)果。

［1］ Binnig G，Quate C，Gerber C. Atomic force microscope［J］. Phys Rev Lett，1986，56(9):930 -933.

［2］ Rinia HA，de Kruijff B. Imaging domains in model membranes with atomic force microscope［J］. FEBS Lett，2001，504 (3):194 -199.

［3］ 蔡穎謙，徐如祥，姜曉丹. 原子力顯微鏡技術(shù)在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用［J］. 中華神經(jīng)醫(yī)學(xué)雜志，2005，4(7):735 -738.

［4］ Canetta E，Walker GM，Adya AK. Correlating yeast cell stress physiology to changes in the cell surface morphology:atomic force microscopic studies［J］. ScientificWorld-Journal，2006，6:777 -780.

［5］ Willemsen OH，Snel MM，Cambi A，et al. Biomolecular interactions measured by atomic force microscopy［J］.Biophys J，2000，79(6):3267 -3281.

［6］ 曾潔銘，曾耀英，蔡繼業(yè)，等.原子力顯微鏡在生命科學(xué)中的應(yīng)用［J］.中國(guó)病理生理雜志，2001，17 (2):180-185.

［7］ Cai X，Gao S，Cai J，et al. Artesunate induced morphological and mechanical changes of Jurkat cell studied by AFM［J］.Scanning，2009，31(1):83 -89.

［8］ Crick SL，Yin FC. Assessing micromechanical properties of cells with atomic force microscopy:importance of the contact point［J］. Biomech Model Mechanobiol，2007，6(3):199 -210.

［9］ Hu M，Wang J，Zhao H，et al. Nanostructure and nanomechanics analysis of lymphocyte using AFM:from resting，activated to apoptosis［J］. J Biomech，2009，42(10):1513 -1519.

［10］ Cai X，You P，Cai J，et al. ART - induced biophysical and biochemical alterations of Jurkat cell membrane［J］.Micron，2011，42(1):17 -28.

［11］ Zhang PC，Bai C，Huang YM，et al. Atomic force microscopy study of fine structures of the entire surface of red blood cells［J］. Scanning Microsc，1995，9(4):981 -988.

［12］ Lehenkari PP，Charras GT，Nyk?nen A，et al. Adapting atomic force microscopy for cell biology［J］. Ultramicroscopy，2000，82(1 -4):289 -295.

［13］ 陳 勇，蔡繼業(yè)，邢少碌，等.多種腫瘤細(xì)胞表面超微結(jié)構(gòu)的原子力顯微鏡觀察及藥物對(duì)細(xì)胞膜表面超微結(jié)構(gòu)影響的初步研究［J］.電子顯微學(xué)報(bào)，2003，22(2):100 -104.

［14］ Gourlay CW，Ayscough KR. A role for actin in aging and apoptosis［J］. Biochem Soc Trans，2005，33(6):1260-1264.

［15］ Shen ZY，Shen WY，Chen MH，et al. Mitochondria，calcium and nitric oxide in the apoptotic pathway of esophageal carcinoma cells induced by As2O3［J］. Int J Mol Med，2002，9(4):385 -390.

［16］ Guruswamy S，Lightfoot S，Michael AG，et al. Effects of retinoids on cancerous phenotype and apoptosis in organotypic cultrues of ovarian tumors［J］. J Natl Cancer Inst，2001，93(7):516 -525.

［17］ Ehrenhoefer U，Rakowska A，Schneider SW，et al. The atomic force microscope detects ATP - sensitive protein clusters in the plasma membrane of transformed MDCK cells［J］. Cell Biol Int，1997，21 (11):737 -746.

［18］ van Meer G.The different hues of lipid rafts［J］. Science，2002，296(5569):855 -857.