自噬在晚期糖基化終產(chǎn)物誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡中的作用*

胡鵬飛， 賴東武， 何 紅

(浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬邵逸夫醫(yī)院心內(nèi)科，浙江杭州310016)

晚期糖基化終產(chǎn)物(advanced glycation end products，AGEs)是非酶糖化反應(yīng)的終末期產(chǎn)物，正常人隨著年齡的增加，AGEs會(huì)緩慢增加，但糖尿病病人由于長(zhǎng)期高血糖狀態(tài)，導(dǎo)致體內(nèi)糖化反應(yīng)及AGEs生成加速。已有多項(xiàng)研究表明AGEs是引起糖尿病血管并發(fā)癥的重要誘因之一［1］。AGEs能夠在糖尿病病人血管壁沉積，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡并增加其促凝活性，從而啟動(dòng)并加速動(dòng)脈粥樣硬化的形成［2］。自噬是一種溶酶體依賴的細(xì)胞內(nèi)受損細(xì)胞器或代謝產(chǎn)物的降解過(guò)程，其作為細(xì)胞的防御保護(hù)機(jī)制，與細(xì)胞凋亡之間有密不可分的聯(lián)系［3］。多項(xiàng)研究表明AGEs能誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡［4］，但關(guān)于AGEs與自噬之間可能存在的病理生理聯(lián)系，目前尚不清楚。調(diào)節(jié)自噬的相關(guān)信號(hào)通路較多，其中，PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路是一條重要的自噬相關(guān)信號(hào)通路。本研究以自噬相關(guān)蛋白LC3－II的表達(dá)作為衡量自噬水平的主要指標(biāo)，初步研究AGEs誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞自噬的相關(guān)機(jī)制及其在AGEs誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡中的作用。為臨床上保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞，防治糖尿病合并動(dòng)脈粥樣硬化開(kāi)辟新的途徑。

材料和方法

1 材料

人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)購(gòu)自上海中科院細(xì)胞研究所;抗LC3－Ⅱ多克隆抗體購(gòu)自Novus;蛋白激酶B(protein kinase B，Akt)多克隆抗體、磷酸化蛋白激酶B(phospho－protein kinase B，p－Akt)多克隆抗體、哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)多克隆抗體和磷酸化哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(phospho－mammalian target of rapamycin，p－mTOR)多克隆抗體均購(gòu)自Cell Signaling;DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco;胎牛血清購(gòu)自四季青公司;內(nèi)毒素凋亡試劑盒購(gòu)自上海潤(rùn)成公司;3－甲基腺嘌呤(3－methyladenine，3 － MA)、MTT、牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)和D－葡萄糖均購(gòu)于 Sigma;胰島素樣生長(zhǎng)因子1(insulin－like growth factor 1，IGF－1)購(gòu)自 R＆D;Alexa Fluor 488 Annexin V/PI細(xì)胞凋亡試劑盒購(gòu)自Invitrogen。

2 方法

2.1 HUVECs的培養(yǎng) HUVECs用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基在37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。用0.25%胰酶(含EDTA)消化傳代。細(xì)胞在培養(yǎng)24 h后加入AGEs等處理因素。

2.2 AGEs的制備 參照文獻(xiàn)［5］，0.5 g BSA 和 3.0 g D－葡萄糖溶于10 mL 0.5 mol/L PBS(pH 7.4)中，濾膜除菌后恒溫37℃避光孵育16周。相同條件下，以不含D－葡萄糖的PBS孵育BSA作為對(duì)照組，AGEs和BSA內(nèi)毒素含量由內(nèi)毒素檢測(cè)試劑盒測(cè)定并確保 ＜ 2.5 kU/L。

2.3 透射電鏡 電鏡檢測(cè)AGEs處理HUVECs后細(xì)胞內(nèi)自噬體的變化。將 HUVECs以 4.0×105cells/well的密度接種于6 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，24 h后加入AGEs(終濃度100 mg/L)處理6 h，消化收集細(xì)胞，用3%戊二醛固定，Hitachi H－7650 TEM電鏡分析。

2.4 Alexa Fluor 488 Annexin V/PI雙標(biāo)記法檢測(cè)細(xì)胞凋亡 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)AGEs誘導(dǎo)HUVECs的凋亡情況。將HUVECs以2.0×105cells/well的密度接種于6孔板中，培養(yǎng)24 h后處理并收集細(xì)胞。1×Annexin－binding buffer重懸，調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為1×109/L，加入 5 μL Alexa Fluor 488 和 5 μL(100 mg/L)PI工作液，室溫孵育15 min后，加入400 μL 1×Annexin－binding buffer輕混后用FACS Calibur流式細(xì)胞儀檢測(cè)，結(jié)果用BD CellQuest軟件分析。

2.5 MTT比色法測(cè)定細(xì)胞活性 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期內(nèi)皮細(xì)胞接種于96孔板，培養(yǎng)24 h后分別加入AGEs或 BSA(100 mg/L)，3－MA(2 mmol/L)，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔，每孔終體積為200 μL。培養(yǎng)48 h后每孔加入MTT溶液(5 g/L)20 μL，37℃孵育4 h后吸去上清，每孔加入100 μL DMSO，振蕩搖勻。用酶標(biāo)儀于570 nm波長(zhǎng)條件下測(cè)定吸光度值。

2.6 Western blotting 檢測(cè) LC3、p － Akt、Akt、p －mTOR和mTOR的表達(dá) 收集HUVECs后，用含蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液裂解30 min，13 000×g離心10 min，取上清，BCA法進(jìn)行蛋白定量。與5×樣品緩沖液混合后，煮沸5 min。將樣品(50 μg)進(jìn)行SDS－PAGE，然后轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜上。用5%脫脂牛奶封閉1 h，相應(yīng)的Ⅰ抗4℃孵化過(guò)夜。TBS－T洗3次后加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的Ⅱ抗室溫孵育1 h，ECL法顯色，圖像結(jié)果采用 LAS－4000－Mini化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)進(jìn)行分析。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

1 AGEs誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞自噬

1.1 100 mg/L AGEs或 BSA 處理 HUVECs 6 h，與對(duì)照組及BSA組相比，AGEs組的自噬相關(guān)蛋白LC3－II的表達(dá)量明顯增加(P＜0.05)，見(jiàn)圖1A。不同時(shí)點(diǎn)(0、2、6、24 h)100 mg/L AGEs處理 HUVECs，與對(duì)照組比較，隨著時(shí)間變化，自噬相關(guān)蛋白LC3－II的表達(dá)量先升高后下降，峰值出現(xiàn)在6 h(P＜0.05)，見(jiàn)圖 1B。不同濃度(0、50、100、200 mg/L)AGEs處理HUVECs 6 h，隨著AGEs濃度的增加，自噬相關(guān)蛋白LC3－II的表達(dá)量明顯增加(P＜0.05)，見(jiàn)圖1C。以上結(jié)果表明在人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中AGEs能顯著增高內(nèi)皮細(xì)胞的自噬水平，并具有一定的濃度和時(shí)間依賴性。

1.2 透射電鏡檢測(cè)自噬 100 mg/L AGEs或BSA處理HUVECs 6 h后，未處理組和BSA組均未見(jiàn)到明顯的自噬體，但AGEs組可看到胞質(zhì)中出現(xiàn)較多的獨(dú)立雙層及多層膜結(jié)構(gòu)的自噬體，見(jiàn)圖1D。

Figure 1.AGEs induced autophagy in HUVECs.A，B and C:Western blotting analysis of LC3－II protein levels treated with BSA or AGEs.A:cells were treated with 100 mg/L AGEs or BSA for 6 h;B:cells were treated with 100 mg/L AGEs for 0，2，6，12 and 24 h;C:cells were treated for 6 h with 0，50，100，200 mg/L AGEs.Compared with control and BSA groups，the expression of LC3－II protein was notably increased in a time－and dose－dependent manner in AGE－treated cells±s.n=4.*P ＜0.05 vs control;△P ＜0.05 vs 0 h;#P ＜0.05 vs 0 mg/L.D:representative electron micrographs of HUVECs treated with 100 mg/L BSA or AGEs for 6 h.Typical autophagic vacuoles containing cellular material or membranous structures(bold arrows)were frequently found in cells treated with AGEs but not BSA.圖1 AGEs誘導(dǎo)HUVECs自噬相關(guān)蛋白LC3－II的表達(dá)

Figure 2.Effect of autophagy on viability of HUVECs treated with AGEs.Compared with control group，HUVECs treated with AGEs(100 mg/L，48 h)showed decreased viability.This effect could be further decreased by pretreating cells with the autophagy inhibitor 3－MA.±s.n=4.*P＜0.05 vs control;△P＜0.05 vs AGEs.圖2 自噬對(duì)AGEs誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞活性的影響

2 自噬在AGEs誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡中的作用

2.1 MTT比色法測(cè)定細(xì)胞活性 用 100 mg/L AGEs處理HUVECs 48 h，其中1組用自噬抑制劑3－MA(2 mmol/L)提前0.5 h預(yù)處理，單用3－MA組與對(duì)照組比較細(xì)胞活性沒(méi)有差異。AGEs組與對(duì)照組相比細(xì)胞活性明顯下降(P＜0.05)。預(yù)先用3－MA處理后的AGEs組細(xì)胞活性較單用AGEs組進(jìn)一步下降(P＜0.05)，見(jiàn)圖2，說(shuō)明抑制自噬加劇了AGEs誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞活性下降。

2.2 Annexin V－FITC/PI雙染標(biāo)記法檢測(cè)細(xì)胞凋亡 用100 mg/L AGEs處理HUVECs 48 h，其中1組用自噬抑制劑3－MA(2mmol/L)提前0.5h預(yù)處理，單用3－MA組與對(duì)照組比較細(xì)胞凋亡率沒(méi)有差異，AGEs組與對(duì)照組比較細(xì)胞凋亡率明顯升高(P＜0.05)，預(yù)先用3－MA處理后的AGEs組細(xì)胞凋亡率較AGEs組進(jìn)一步下降(P＜0.05)，見(jiàn)圖3。抑制自噬加劇了AGEs誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡。以上2項(xiàng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明自噬在AGEs誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡中起保護(hù)作用。

Figure 3.Effect of autophagy on apoptosis of HUVECs treated with AGEs.Compared with control group，HUVECs treated with AGEs(100 mg/L，48 h)showed increased apoptosis.This effect could be further increased by pretreating cells with the autophagy inhibitor 3－MA.±s.n=4.*P＜0.05 vs control;△P＜0.05 vs AGEs.圖3 自噬對(duì)AGEs誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的影響

3 PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路在AGEs誘導(dǎo)HUVECs自噬過(guò)程中的作用

AGEs刺激之后，p－Akt和p－mTOR的表達(dá)水平隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)而下降，并在15或30 min時(shí)達(dá)最低值(P＜0.05)，見(jiàn)圖4A。這表明在HUVECs中，AGEs可以抑制PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路。200 μg/L IGF－1能夠明顯激活A(yù)kt的磷酸化水平(P＜0.05)，見(jiàn)圖4B。與AGEs處理組相比較，IGF－1提前2 h預(yù)處理組能顯著抑制AGEs誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白LC3－II的表達(dá)(P＜0.05)，見(jiàn)圖4C，這表明PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路在AGEs誘導(dǎo)HUVECs自噬的過(guò)程中起著重要作用。

討 論

AGEs是蛋白質(zhì)的氨基與糖的醛基發(fā)生非酶性糖化氧化反應(yīng)生成不可逆的終末期產(chǎn)物，糖尿病患者體內(nèi)AGEs水平較正常人明顯升高，AGEs在體內(nèi)的累積與糖尿病血管并發(fā)癥密切相關(guān)。有研究表明AGEs通過(guò)與其特異性受體(receptor for advanced glycation end products，RAGE)結(jié)合，激活核轉(zhuǎn)錄因子(nuclear factor－kappa B，NF－κB)，促進(jìn)腫瘤壞死因子((tumor necrosis factor－α，TNF－α)分泌增加，誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡［4］。內(nèi)皮細(xì)胞凋亡不僅會(huì)減弱血管內(nèi)皮預(yù)防血脂沉積的屏障作用、局部抗凝和纖溶機(jī)制，而且凋亡的內(nèi)皮細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生促凝作用，這些因素會(huì)啟動(dòng)并加速動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展［6］。自噬是廣泛存在于真核細(xì)胞中的生命現(xiàn)象，即細(xì)胞利用溶酶體降解自身受損的細(xì)胞器和大分子物質(zhì)，清除受損細(xì)胞器、代謝產(chǎn)物，以維持細(xì)胞的穩(wěn)定狀態(tài)。自噬作為一種生理或病理現(xiàn)象存在于動(dòng)脈粥樣硬化、心衰等多種心血管疾病當(dāng)中［7－8］。但自噬是否參與了AGEs誘導(dǎo)的多種病理生理過(guò)程，目前尚不清楚。我們的研究發(fā)現(xiàn)AGEs能夠誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞自噬水平增加，自噬在AGEs誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡中起保護(hù)作用，同時(shí)我們進(jìn)一步闡明了AGEs誘導(dǎo)自噬的機(jī)制。

低水平的自噬廣泛存在于細(xì)胞的正常生理過(guò)程中。但在缺氧、炎癥、氧化應(yīng)激等不良環(huán)境中，細(xì)胞可通過(guò)增強(qiáng)自噬來(lái)清除細(xì)胞內(nèi)受損細(xì)胞器及代謝產(chǎn)物，對(duì)細(xì)胞起保護(hù)作用，但過(guò)度自噬也會(huì)損傷細(xì)胞，觸發(fā)自噬性細(xì)胞死亡機(jī)制，促進(jìn)細(xì)胞死亡［9－10］。在疾病的不同發(fā)展階段，自噬的作用也不盡相同。Matsui等［11］發(fā)現(xiàn)在心肌缺血階段，自噬對(duì)心肌細(xì)胞起保護(hù)作用，而在再灌注階段進(jìn)一步增強(qiáng)的自噬則對(duì)心肌細(xì)胞有損傷作用。在本實(shí)驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)AGEs能夠降低內(nèi)皮細(xì)胞活性，增加內(nèi)皮細(xì)胞凋亡率。但使用自噬抑制劑3－MA特異性抑制自噬后細(xì)胞活性進(jìn)一步下降，細(xì)胞的凋亡率也進(jìn)一步增加。我們推測(cè)在AGEs作用于內(nèi)皮細(xì)胞時(shí)，自噬作為一種防御機(jī)制被誘導(dǎo)發(fā)生，用于清除AGEs引起的一些損傷細(xì)胞器和代謝產(chǎn)物，延緩凋亡的發(fā)生，從而發(fā)揮保護(hù)作用。這說(shuō)明AGEs既能誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，也能誘導(dǎo)其發(fā)生自噬，自噬在AGEs誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡中起保護(hù)作用，它部分對(duì)抗了AGEs引起的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡。

Figure 4.Role of the PI3K/Akt/mTOR signal pathway in AGE－induced HUVECs autophagy.A and B:Western blotting analysis of the Akt/mTOR pathway in HUVECs treated with AGEs.In HUVECs，phosphorylation of Akt and mTOR decreased 30 min and 1 h after treatment with 100 mg/L AGEs.C:insulin－like growth factor 1(IGF－1)was used to activate the Akt pathway.Cells pretreated with IGF －1(200 μg/L)for 2 h showed a notable increase in Akt phosphorylation.D:Western blotting analysis of LC3－II expression in AGE(100 mg/L，6 h)－ and IGF－1－treated cells.Pretreatment with IGF－1(200 μg/L)suppressed the AGE－induced expression of LC3－II in HUVECs.±s.n=4.*P＜0.05 vs control;△P＜0.05 vs AGEs.圖4 PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路在AGEs誘導(dǎo)HUVECs自噬過(guò)程中的作用

PI3K/Akt/mTOR通路是調(diào)節(jié)自噬的一條重要的信號(hào)通路，當(dāng)Akt被激活后可磷酸化馬鈴薯球蛋白(tuberous sclerosis complex 2，TSC2)，后者可增強(qiáng)mTOR活性，從而抑制自噬，故該通路對(duì)自噬起負(fù)性調(diào)節(jié)作用［12－13］。我們的研究發(fā)現(xiàn)，AGEs刺激能使內(nèi)皮細(xì)胞Akt和mTOR的磷酸化水平都顯著下降，但使用Akt激活劑IGF－1使Akt的磷酸化水平恢復(fù)后，AGEs誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白LC3－II的表達(dá)量即明顯下降，這說(shuō)明在HUVECs上，AGEs是通過(guò)抑制PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞自噬水平的升高。mTOR作為調(diào)節(jié)自噬的關(guān)鍵靶點(diǎn)，也是臨床上多重種藥物的作用靶點(diǎn)。該機(jī)制的闡明為進(jìn)一步在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)或臨床上干預(yù)AGEs誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞自噬提供了理論依據(jù)。

綜上所述，通過(guò)實(shí)驗(yàn)我們證明了AGEs能夠誘導(dǎo)HUVECs自噬活性增強(qiáng)，自噬在AGEs誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡中起保護(hù)作用，能夠?qū)箖?nèi)皮細(xì)胞的凋亡。Akt的激動(dòng)劑IGF－1能夠抑制該作用，說(shuō)明PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路在AGEs誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞自噬的過(guò)程中發(fā)揮重要作用。因此，對(duì)細(xì)胞的自噬水平進(jìn)行干預(yù)可能是治療糖尿病心血管并發(fā)癥新的突破口，但還需要具體的動(dòng)物學(xué)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步深入研究。

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