閻 豐， 楊志明， 劉 娟

(山西醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院心內(nèi)科，山西太原030001)

動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成是冠心病的病理學(xué)基礎(chǔ)，泡沫細(xì)胞的形成在動(dòng)脈粥樣斑塊的形成中起著重要的作用［1］。三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)子A1(ATP-binding cassette transporter A1，ABCA1)是細(xì)胞膜上重要的膽固醇流出調(diào)節(jié)蛋白，它介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)膽固醇流出是膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)(reverse cholesterol transport，RCT)的起始環(huán)節(jié)［2］。環(huán)磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate，cAMP)是細(xì)胞內(nèi)重要的第二信使，亦是調(diào)節(jié)ABCA1表達(dá)的重要因子［3］。血管緊張素-(1-7)［angiotensin-(1-7)，Ang-(1-7)］是近幾年發(fā)現(xiàn)的可拮抗血管緊張素Ⅱ(angiotensinII，Ang II)的一種激素，它通過(guò)和Mas受體結(jié)合起到抗炎、抑制血管平滑肌增殖的作用［4］。通過(guò)前一階段研究，我們已證明Ang-(1-7)可以使單核細(xì)胞ABCA1蛋白表達(dá)增加，膽固醇流出率增加。那么cAMP是否在Ang-(1-7)影響泡沫細(xì)胞ABCA1的表達(dá)過(guò)程中起作用呢?尚缺乏充分證據(jù)。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)分別對(duì)泡沫細(xì)胞施加Ang-(1-7)和腺苷酸環(huán)化酶抑制劑MDL(MDL-12，330A)因素，觀察泡沫細(xì)胞ABCA1表達(dá)及膽固醇含量的變化。

材料和方法

1 材料

人THP-1單核細(xì)胞株購(gòu)自中科院上海細(xì)胞庫(kù)，RPMI-1640培養(yǎng)基購(gòu)于 HyClone，Ang-(1-7)、MDL和佛波酯(phorbol myristate acetate，PMA)均購(gòu)于Sigma，鼠抗人ABCA1Ⅰ抗購(gòu)自 Santa Cruz，羊抗鼠Ⅱ抗購(gòu)于武漢博士德公司，膽固醇標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)于中國(guó)藥品生物制品檢定所，氧化低密度脂蛋白(oxidized low-density lipoprotein，ox-LDL)購(gòu)于北京欣和佳源公司，RNAiso Plus總RNA提取試劑、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、實(shí)時(shí)熒光定量試劑盒均購(gòu)自TaKaRa，［3H］膽固醇購(gòu)于American Life Science，ABCA1和 β-actin引物購(gòu)自上海生工生物工程有限公司，油紅O試劑購(gòu)于北京索萊寶公司，甲醇、異丙醇和乙腈為天津市河?xùn)|區(qū)紅巖試劑廠產(chǎn)品，CO2培養(yǎng)箱購(gòu)自Thermo，高效液相色譜儀購(gòu)自Waters。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將人THP-1單核細(xì)胞懸浮于含15%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中，在5%CO2、37℃條件下培養(yǎng)。顯微鏡下可見(jiàn)細(xì)胞呈球形、懸浮生長(zhǎng)。根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)情況換液、傳代。選取生長(zhǎng)良好的3～5代細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究。實(shí)驗(yàn)前在培養(yǎng)液中加入160 nmol/L PMA孵育THP-1細(xì)胞24 h，誘導(dǎo)單核細(xì)胞分化為巨噬細(xì)胞，顯微鏡下觀察細(xì)胞可見(jiàn)細(xì)胞由懸浮狀態(tài)向貼壁狀態(tài)轉(zhuǎn)化，伸出偽足，呈現(xiàn)巨噬細(xì)胞形態(tài)。換液后加入50 mg/L ox-LDL，培養(yǎng)48 h，使其變成泡沫細(xì)胞。換含15%胎牛血清的培養(yǎng)液后加入干預(yù)因素。實(shí)驗(yàn)分為4組:(1)泡沫細(xì)胞組:不加干預(yù)因素;(2)MDL組:加MDL 10 mmol/L;(3)Ang-(1-7)組:加 Ang-(1-7)1 000 nmol/L;(4)MDL+Ang-(1-7)組:分別加10 mmol/L MDL和1 000 nmol/L Ang-(1-7)。

2.2 泡沫細(xì)胞模型的鑒定 采用Lillie氏油紅O染色法。將THP-1源性單核細(xì)胞接種于6孔板中，按上述方法誘導(dǎo)泡沫細(xì)胞模型。后棄上清，PBS洗3次，加10%甲醛固定15 min，PBS洗3次，60%異丙醇漂洗1次20～30 s，稀釋油紅O儲(chǔ)存液，油紅O∶去離子水=3∶2，濾紙過(guò)濾4～5次，室溫放置10 min，染色15 min左右，經(jīng)60%異丙醇分化數(shù)秒鐘，水洗1～2 min，用稀釋1倍的明礬蘇木素染液淡染細(xì)胞核30 s，水洗返藍(lán)，顯微鏡下觀察并攝像。

2.3 ELISA檢測(cè)各組cAMP的含量 各組細(xì)胞處理后，樣品棄上清，PBS洗3次，刮刀刮取細(xì)胞，置于離心管中，用1 mL注射器反復(fù)抽吸裂解細(xì)胞，每孔分別加入標(biāo)準(zhǔn)品和上述裂解液各100 μL，將反應(yīng)板充分混勻后置37℃ 120 min，用洗滌液將反應(yīng)板充分洗滌4～6次，向?yàn)V紙上印干，每孔中加入第Ⅰ抗體工作液100 μL，將反應(yīng)板充分混勻后置于37℃ 60 min洗板同上，每孔加酶標(biāo)抗體工作液100 μL，將反應(yīng)板置于37℃ 30 min，洗板同前，每孔加入底物工作液100 μL，置于37℃暗處反應(yīng)15 min。每孔加入100 μL終止液混勻。30 min內(nèi)用酶標(biāo)儀在450 nm處檢測(cè)吸光度值。制定cAMP標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)公式y(tǒng)=3.4603 × x1.0629/(6.00151.0629+x1.0629)計(jì)算各組cAMP數(shù)值。

2.4 實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(realtime RT-PCR)檢測(cè)ABCA1 mRNA的表達(dá) 使用Trizol提取總RNA，按試劑盒說(shuō)明(TaKaRa)逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。以ABCA1 cDNA為模板，ABCA1上游引物P1為aacagtttgtggcccttttg，下游引物P2為agttccaggctggggtactt。按兩步法進(jìn)行反應(yīng):95℃預(yù)變性30 s，95℃ 5 s，60℃ 31 s，擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值，根據(jù)以下相對(duì)定量公式計(jì)算:待測(cè)樣本相對(duì)量 =2-ΔΔCt，ΔΔCt= ΔCt內(nèi)參照- ΔCt待測(cè)樣品，ΔCt=Ct陰性對(duì)照-Ct待測(cè)樣品。

2.5 Western blotting檢測(cè) ABCA1蛋白的表達(dá) 胰蛋白酶消化、離心收集細(xì)胞，PBS洗滌3次后加入細(xì)胞裂解液，4℃、12 000×g離心15 min，提取細(xì)胞總蛋白。經(jīng)12%SDS聚丙烯酰胺變性凝膠分離蛋白，電轉(zhuǎn)膜法將蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維膜上，封閉，先后加I抗、II抗，酶法顯色。顯影后掃描圖像進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2.6 高效液相色譜儀檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)膽固醇的含量(1)總膽固醇的提取:收集細(xì)胞冰浴超聲10 min裂解細(xì)胞，加15%KOH乙醇溶液，50℃水解2 h，用正己烷-異丙醇抽提2次，有機(jī)相液氮吹干干燥，用流動(dòng)相溶液溶解搖勻，作為總膽固醇標(biāo)準(zhǔn)品的供試液。(2)游離膽固醇的提取:取細(xì)胞裂解液，加入乙醇，用正己烷-異丙醇如上法抽提2次，并液氮吹干干燥，溶解搖勻，作為游離膽固醇標(biāo)準(zhǔn)品的供試液。(3)取膽固醇標(biāo)準(zhǔn)品倍比稀釋法配成5個(gè)不同的濃度，將上述標(biāo)準(zhǔn)品溶液分別注入高效液相色譜儀，進(jìn)樣量為10 μL，以膽固醇的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)X軸，其電壓波峰面積為縱坐標(biāo)Y軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。(4)按流動(dòng)相異丙醇 -乙腈(50∶50)、流速1 mL/min、柱溫40℃的色譜條件，進(jìn)樣20 μL，記錄膽固醇的峰面積，代入回歸方程，計(jì)算總膽固醇量和游離膽固醇量，總膽固醇量減去游離膽固醇量為膽固醇酯的量。

2.7 閃爍計(jì)數(shù)法測(cè)定細(xì)胞內(nèi)膽固醇流出率 隨機(jī)選擇誘導(dǎo)好的泡沫細(xì)胞，在含15%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液中加入0.37×109Bq/L［3H］標(biāo)記膽固醇共同孵育48 h之后，用PBS液洗滌細(xì)胞2次，再在新培養(yǎng)液中按以上分組分別加入Ang-(1-7)、MDL和Ang-(1-7)+MDL干預(yù)因素培養(yǎng)24 h，再用PBS液洗滌細(xì)胞。在無(wú)血清含10 mg/L載脂蛋白A-I(apolipoprotein A-I，ApoA-I)的新培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)12 h，閃爍液裂解細(xì)胞后，用閃爍計(jì)數(shù)法檢測(cè)培養(yǎng)液和細(xì)胞的［3H］標(biāo)記膽固醇。膽固醇流出率(%)=培養(yǎng)液(counts/min)值 ÷［培養(yǎng)液(counts/min)值 +細(xì)胞(counts/min)值］×100%。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，多組間比較采用單因素方差分析(ANOVA)，組間兩兩比較采用最小顯著差異法(LSD法)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 THP－1源性單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞及泡沫細(xì)胞的形態(tài)

將THP-1單核細(xì)胞用PMA誘導(dǎo)24 h后可見(jiàn)細(xì)胞呈梭形貼壁生長(zhǎng)，多數(shù)細(xì)胞伸出偽足，說(shuō)明細(xì)胞己分化為巨噬細(xì)胞。再用50 mg/L ox-LDL與巨噬細(xì)胞共同孵育48 h后，經(jīng)油紅O染色，顯微鏡下觀察，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)有大量的紅色脂質(zhì)顆粒存在，符合泡沫細(xì)胞形態(tài)特點(diǎn)，見(jiàn)圖1。

Figure 1.The induction process of foam cells(×400).A:THP-1 monocytes;B:macrophages;C:foam cells.The THP-1 monocytes were induced to be macrophages by 160 nmol/L PMA for 48 h，followed by methanol fixation for 15 min，oil red O staining for 15 min and alum hematoxylin staining for 30 s.圖1 THP－1單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和泡沫細(xì)胞的形態(tài)

2 ELISA檢測(cè)各組cAMP的含量

Ang-(1-7)組較泡沫細(xì)胞組、MDL組和Ang-(1-7)+MDL組cAMP含量明顯增加(P＜0.05);MDL組較泡沫細(xì)胞組明顯降低(P＜0.05);Ang(1-7)+MDL組介于Ang-(1-7)組與泡沫細(xì)胞組間，且與兩組有顯著差異(P＜0.05)。cAMP標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖2，各組cAMP含量值見(jiàn)表1。

3 細(xì)胞內(nèi)ABCA1 mRNA的表達(dá)

以泡沫細(xì)胞中ABCA1 mRNA作為空白對(duì)照，經(jīng)Ang-(1-7)干預(yù)的泡沫細(xì)胞中ABCA1 mRNA表達(dá)較泡沫細(xì)胞、MDL組顯著增加(P＜0.05);MDL干預(yù)的泡沫細(xì)胞中，ABCA1 mRNA的表達(dá)較泡沫細(xì)胞組顯著降低(P＜0.05);MDL+Ang-(1-7)組介于泡沫細(xì)胞組與Ang-(1-7)組之間，與兩組有顯著差異(P＜0.05)，各組mRNA相對(duì)表達(dá)量見(jiàn)表2。

Figure 2.The standard curve of cAMP sample generated by Hill curve fitting.圖2 通過(guò)Hill曲線擬合生成的cAMP標(biāo)準(zhǔn)曲線

表1 各組細(xì)胞cAMP含量Table 1.The content of cAMP in different groups(nmol/L.±s.n=3)

表1 各組細(xì)胞cAMP含量Table 1.The content of cAMP in different groups(nmol/L.±s.n=3)

*P ＜ 0.05 vs foam cells.

Foam cells 0.9547 ±0.0031 MDL 0.8508 ±0.0060*Ang-(1-7) 1.1397 ±0.0020*Ang-(1-7)+MDL 1.0693 ±0.0028*

表2 細(xì)胞內(nèi)ABCA1 mRNA的表達(dá)Table 2.The expression of ABCA1 mRNA in different groups(%.±s.n=3)

表2 細(xì)胞內(nèi)ABCA1 mRNA的表達(dá)Table 2.The expression of ABCA1 mRNA in different groups(%.±s.n=3)

*P ＜ 0.05 vs foam cells.

Foam cells 1.0000 ±0.0000 MDL 0.8945 ±0.0201*Ang-(1-7) 1.8966 ±0.0272*MDL+Ang-(1-7) 1.5873 ±0.0110*

4 各組細(xì)胞ABCA1蛋白的表達(dá)

泡沫細(xì)胞組、MDL組、Ang(1-7)+MDL組、Ang-(1-7)組細(xì)胞ABCA1蛋白表達(dá)分別為65.05% ±6.70%、50.44% ± 1.41%、70.06% ± 4.40% 和75.20% ±1.29%。Ang-(1-7)組與泡沫細(xì)胞組、MDL組和Ang-(1-7)+MDL組比較，ABCA1表達(dá)明顯增高，差異顯著(P＜0.05)，MDL組較泡沫細(xì)胞組明顯降低(P ＜0.05)，Ang-(1-7)+MDL介于Ang-(1-7)組與泡沫細(xì)胞組之間，與泡沫細(xì)胞組比較有升高趨勢(shì)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，見(jiàn)圖 3、4。

5 各組細(xì)胞膽固醇含量

Ang-(1-7)組與泡沫細(xì)胞組、MDL組和Ang-(1-7)+MDL組比較，膽固醇含量減低(P＜0.05)，MDL組與泡沫細(xì)胞組比較膽固醇含量增加(P＜0.05)。MDL+Ang-(1-7)組膽固醇含量介于泡沫細(xì)胞組與Ang-(1-7)組之間，與兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)，見(jiàn)圖5、6 及表3。

Figure 3.The expression of ABCA1 protein in different groups.1:foam cells group;2:MDL group;3:Ang-(1-7)+MDL group，4:Ang-(1-7)group.圖3 各組細(xì)胞ABCA1蛋白的表達(dá)

6 各組細(xì)胞膽固醇流出率

Ang-(1-7)組與泡沫細(xì)胞組、MDL組和Ang-(1-7)+MDL組比較，膽固醇流出率最高(P＜0.05)，MDL組與泡沫細(xì)胞組比較膽固醇流出率下降(P＜0.05)。MDL+Ang-(1-7)組膽固醇流出率介于泡沫細(xì)胞組與Ang-(1-7)組之間，與兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見(jiàn)表4。

討 論

近年研究認(rèn)為，冠狀動(dòng)脈粥樣硬化形成過(guò)程中，血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷與泡沫細(xì)胞的形成在冠脈粥樣硬化的病變中起著重要的作用［5］。腎素-血管緊張素系統(tǒng)(renin-angiotensin system，RAS)是維持機(jī)體正常水電解質(zhì)平衡、血壓的重要系統(tǒng)。近年發(fā)現(xiàn)其在血管平滑肌細(xì)胞增殖和遷移及冠狀動(dòng)脈粥樣斑塊形成和進(jìn)展過(guò)程中起著重要的作用。Ang II是這一作用的關(guān)鍵分子，而Ang-(1-7)是血管緊張素家族的終末活性產(chǎn)物，是Ang II的內(nèi)源性拮抗因子，在心血管系統(tǒng)中起重要調(diào)控作用［6］，其與Mas受體結(jié)合后通過(guò)NO/cGMP途徑、鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶/T細(xì)胞活化核因子、細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellular signal-regulated protein kinase，ERK)/p38、核因子κB等途徑發(fā)揮擴(kuò)張血管、降低血壓、抑制平滑肌細(xì)胞增殖、利尿、利鈉及抑制新生內(nèi)膜增生等功能［7］。ABCA1是ABCA超家族的一員［8］，它以ATP為能源對(duì)包括脂質(zhì)、細(xì)胞毒素和藥物等底物進(jìn)行轉(zhuǎn)運(yùn)，是RCT過(guò)程中的重要的蛋白。新生高密度脂蛋白主要由ApoA-I與ABCA1結(jié)合后轉(zhuǎn)運(yùn)脂質(zhì)，這是ABCA1介導(dǎo)RCT的第一步，也是限速步驟。隨后高密度脂蛋白運(yùn)送脂質(zhì)到肝臟以膽鹽的形式排泄。cAMP是細(xì)胞內(nèi)重要的第二信使，研究顯示cAMP通過(guò)抑制磷酸二酯酶和活化腺苷酸環(huán)化酶可調(diào)節(jié)血小板聚集及抑制血栓形成［9］。目前已證實(shí) cAMP通過(guò)誘導(dǎo)ABCA1的分泌增加并降低膽固醇的循環(huán)水平，促使巨噬細(xì)胞中多余的游離膽固醇排出，從而抑制泡沫細(xì)胞的形成。其機(jī)制可能為當(dāng)ApoA-I與ABCA1結(jié)合后，活化了與ABCA1偶聯(lián)的Gα，使腺苷酸環(huán)化酶激活，cAMP產(chǎn)生［10］，并作用于 SP1/3及SP1元件調(diào)節(jié)GC-Box的表達(dá)，從而導(dǎo)致ABCA1磷酸化，進(jìn)行膽固醇生理外流調(diào)節(jié)［11］。

Figure 6.The standard curve of cholesterol stardard.圖6 膽固醇的標(biāo)準(zhǔn)曲線

表3 各組細(xì)胞內(nèi)膽固醇含量Table 3.The intracellular content of cholesterol in different groups(mg/L.±s.n=3)

表3 各組細(xì)胞內(nèi)膽固醇含量Table 3.The intracellular content of cholesterol in different groups(mg/L.±s.n=3)

*P ＜ 0.05 vs foam cells.

Foam cells 38.5833 ±0.6171 16.3500 ±0.7000 MDL 43.9500 ±0.5074* 20.9000 ±0.1803*Ang-(1-7) 25.6000 ±0.4359* 12.2500 ±0.0500*MDL+Ang-(1-7) 30.2333 ±0.5008* 13.7800 ±0.6322*

表4 各組細(xì)胞膽固醇流出率Table 4.The cholesterol efflux rates in different groups(%.±s.n=3)

表4 各組細(xì)胞膽固醇流出率Table 4.The cholesterol efflux rates in different groups(%.±s.n=3)

*P ＜0.05 vs foam cells.

Group Cholesterol efflux rate Foam cells 14.10 ±1.02 MDL 12.45 ±1.17*Ang-(1-7) 16.87 ±1.42*MDL+Ang-(1-7) 15.14 ±1.24*

通過(guò)前述研究［12-13］，我們已證明Ang-(1-7)可拮抗Ang II的作用，并通過(guò)轉(zhuǎn)錄級(jí)聯(lián)效應(yīng)促進(jìn)過(guò)氧化物酶體增生物激活受體γ、肝X受體α和ABCA1的表達(dá)使巨噬細(xì)胞膽固醇流出率增加。cAMP作為RCT中影響ABCA1表達(dá)的重要調(diào)節(jié)因子，在Ang-(1-7)調(diào)節(jié)膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)的過(guò)程中是否起作用呢?本研究顯示，Ang-(1-7)與泡沫細(xì)胞組比較可使ABCA1表達(dá)增加，通過(guò)促進(jìn)膽固醇外流，使泡沫膽固醇含量降低。MDL組與泡沫細(xì)胞組比較ABCA1表達(dá)降低，膽固醇外流減少，膽固醇含量增加。這證明cAMP在ABCA1的表達(dá)及RCT過(guò)程中起著重要的作用。Ang-(1-7)+MDL與泡沫細(xì)胞組比較ABCA1有升高趨勢(shì)，膽固醇含量降低。這表明cAMP在Ang-(1-7)作用于泡沫細(xì)胞的RCT起著十分重要的作用，但抑制cAMP的產(chǎn)生并不能完全阻斷Ang-(1-7)對(duì)泡沫細(xì)胞RCT的作用。Ang-(1-7)與Mas受體結(jié)合后，通過(guò)上述一系列信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路影響RCT的過(guò)程。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立THP-1源性泡沫細(xì)胞模型，證實(shí)了Ang-(1-7)可促進(jìn)泡沫細(xì)胞ABCA1 mRNA和蛋白的表達(dá)，并促進(jìn)膽固醇外流使泡沫細(xì)胞膽固醇含量降低;通過(guò)MDL抑制腺苷酸環(huán)化酶的活化而減少cAMP的分泌，可部分拮抗Ang-(1-7)但不能完全阻斷它在泡沫細(xì)胞RCT中的作用，本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步探討了Ang-(1-7)在RCT過(guò)程中的影響因子及通路，提示cAMP在Ang-(1-7)促進(jìn)泡沫細(xì)胞RCT及抑制動(dòng)脈粥樣硬化形成過(guò)程中起著重要的作用。

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