吳秀香， 張 妍， 孫柳青， 唐劍濤， 靳俊峰

(遵義醫(yī)學(xué)院珠海校區(qū)1病理學(xué)與病理生理學(xué)教研室，2計(jì)算機(jī)教研室，廣東珠海519041)

高血壓病是嚴(yán)重危害人類健康的疾病之一。高血壓病時(shí)會(huì)引起機(jī)體發(fā)生血流動(dòng)力學(xué)等變化，導(dǎo)致血管重塑。血管重塑既是高血壓病的一種重要病理特征，也是造成高血壓病人發(fā)生重要臟器(心、腎、腦)損害的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)［1］。因此，如何減緩或逆轉(zhuǎn)血管重塑，進(jìn)而減少重要臟器的損傷，對(duì)于治療高血壓病，至關(guān)重要。我們前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明［2］，葡萄籽原花青素(grape seed procyanidin，GSP)具有明顯的降壓作用，但其是否具有緩解或逆轉(zhuǎn)高血壓血管重塑的作用及機(jī)制如何，報(bào)道甚少。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立腎血管性高血壓(renovascular hypertension，RH)大鼠模型，觀察GSP對(duì)腎性高血壓時(shí)血管重塑的影響，并初步探討其機(jī)制，以期為開(kāi)發(fā)GSP成為治療高血壓病的理想新藥進(jìn)一步提供理論依據(jù)。

材料和方法

1 材料

1.1 動(dòng)物 清潔級(jí)雄性Sprague－Dawley(SD)大鼠(180～200 g)，購(gòu)自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)為SCXK(粵)2008－0002。

1.2 藥品 GSP由天津尖峰天然產(chǎn)物研究開(kāi)發(fā)有限公司惠贈(zèng)，純度≥95%;卡托普利(captopril)，中美上海施貴寶制藥有限公司產(chǎn)品。

1.3 主要試劑和儀器 大鼠血管緊張素Ⅱ(angiotensinⅡ，AngⅡ)酶聯(lián)免疫分析試劑盒購(gòu)于武漢博士德生物工程有限公司。兔抗鼠腫瘤壞死因子 α(tumor necrosis factor α，TNF － α)、辣根過(guò)氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)標(biāo)記的山羊抗兔Ⅱ抗(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)。蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)(MBI);蛋白電泳儀(Bio－Rad);大鼠尾動(dòng)脈收縮壓(systolic blood pressure，SBP)測(cè)定裝置、多道生理信號(hào)采集處理系統(tǒng)(RM6240型，成都儀器廠)。其余試劑為市售分析純。

2 方法

2.1 RH大鼠模型復(fù)制、分組及給藥方法 50只SD大鼠經(jīng)稱重和測(cè)量基礎(chǔ)尾動(dòng)脈SBP后，隨機(jī)分為手術(shù)組和假手術(shù)組(對(duì)照組，control，n=7)。手術(shù)組43只大鼠按照先前的方法復(fù)制RH大鼠模型［2］。術(shù)后2周選取鼠尾動(dòng)脈SBP≥130 mmHg的大鼠28只，進(jìn)入本研究，隨機(jī)分為4組:RH模型組(RH model);GSP高劑量治療組(high GSP)、GSP低劑量治療組(low GSP)和卡托普利陽(yáng)性對(duì)照治療組(captopril)，每組各7只。于模型復(fù)制成功后，治療組大鼠每天灌胃給藥1次，劑量分別為:high GSP 200 mg·kg－1·d－1，low GSP 50 mg·kg－1·d－1，captopril 30 mg·kg－1·d－1。對(duì)照組及RH模型組每天灌胃相同體積的蒸餾水，連續(xù)灌胃6周。

2.2 血管重塑形態(tài)學(xué)參數(shù)的測(cè)量 自主動(dòng)脈弓下1 cm處剪取0.5 cm胸主動(dòng)脈，用10%甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋、切片(厚度為4 μm)，行HE染色，用Image－Pro Plus 6.0系統(tǒng)軟件進(jìn)行圖像分析，在統(tǒng)一放大40倍的顯微鏡下，分別測(cè)量胸主動(dòng)脈血管中膜厚度(media thickness，MT)和血管內(nèi)徑(luminal internal diameter，LD)，按順時(shí)針?lè)较驕y(cè)12個(gè)值取其平均值［3］，并計(jì)算 MT/LD。

2.3 膠原定性和半定量分析 石蠟切片進(jìn)行Masson染色(平滑肌細(xì)胞染成紅色，膠原纖維染成藍(lán)色，細(xì)胞核染成藍(lán)色)，每張切片取圖5張，用Image－Pro Plus 6.0系統(tǒng)軟件進(jìn)行圖像分析，計(jì)算出膠原面積與統(tǒng)計(jì)場(chǎng)面積的比值。

2.4 AngⅡ含量檢測(cè) 術(shù)后6周，取大鼠腹主動(dòng)脈制備10%的勻漿液，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作。

2.5 總蛋白的提取和Western blotting檢測(cè)TNF－α蛋白的表達(dá) 取大鼠腹主動(dòng)脈，按照質(zhì)量體積比1∶9加入勻漿液(含組織蛋白抽提試劑，多種蛋白酶抑制劑cocktail)進(jìn)行勻漿，加入等體積的2×上樣緩沖液，煮沸10 min使蛋白變性，12 000 r/min 4℃離心5 min取上清液，BCA法(武漢博士德)測(cè)定樣品的蛋白濃度。用上樣緩沖液調(diào)整蛋白濃度，使各泳道的蛋白上樣體積為10 μL(含蛋白20 μg)。進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，隨后轉(zhuǎn)印至硝酸纖維膜上，經(jīng)脫脂奶粉封閉、洗脫后加抗TNF－α抗體(1∶300)4℃孵育過(guò)夜，再加入相應(yīng)Ⅱ抗(1∶2 500)搖床孵育80 min。洗脫后，加ECL發(fā)光顯示劑，暗盒壓片、曝光，顯影、定影于膠片。膠片經(jīng)照相后，用Bio－Rad提供的Quantity One軟件進(jìn)行灰度值分析，以實(shí)驗(yàn)各組蛋白條帶平均灰度值與同一樣品中內(nèi)參蛋白條帶的平均灰度值比值作為蛋白的相對(duì)含量。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

1 各組大鼠尾動(dòng)脈SBP的變化

灌胃治療6周后，與對(duì)照組相比，RH模型組大鼠尾動(dòng)脈SBP升高顯著(P＜0.01);與RH模型組相比，2個(gè)不同劑量GSP灌胃的治療組大鼠尾動(dòng)脈SBP均降低，其中以GSP高劑量治療組的降壓效果尤為明顯(P＜0.01)，與 captopril組的降壓效果相當(dāng)，與對(duì)照組相比無(wú)顯著差異，見(jiàn)表1。

2 血管重塑形態(tài)學(xué)參數(shù)的變化

與對(duì)照組相比，RH模型組大鼠胸主動(dòng)脈管壁增厚，管腔狹窄，MT和MT/LD明顯增高(P＜0.01);各治療組MT增厚和LD縮小的表現(xiàn)緩解，MT/LD增高的幅度下降;低劑量治療組有上述作用(P＜0.05)，但MT和MT/LD仍高于對(duì)照組，LD仍小于對(duì)照組;高劑量治療組的上述作用明顯，與captopril治療組的效果相當(dāng)(P＜0.01)，與對(duì)照組沒(méi)有顯著差異，見(jiàn)圖 1、表2。

表1 GSP對(duì)大鼠尾動(dòng)脈SBP和腹主動(dòng)脈組織中AngⅡ水平的影響Table 1.Effect of GSP on SBP and AngⅡ in the abdominal aorta of rats in each group(±s.n=7)

表1 GSP對(duì)大鼠尾動(dòng)脈SBP和腹主動(dòng)脈組織中AngⅡ水平的影響Table 1.Effect of GSP on SBP and AngⅡ in the abdominal aorta of rats in each group(±s.n=7)

＊＊P ＜0.01 vs control;#P ＜0.05，##P ＜0.01 vs RH model.

Control —95.05 ±4.15 4 023.73 ±306.98 RH model — 144.07 ±7.00＊＊ 5 357.37 ±295.60＊＊Low GSP 50 134.14 ±11.95# 4 938.34 ±235.43#High GSP 200 107.01 ±5.51## 4 157.46 ±307.34##Captopril 30 105.10 ±4.97## 4 076.50 ±313.43##

Figure 1.The changes of morphological parameters of thoracic aorta remodeling of rats in each group(HE staining，×40).±s.n=7.A:control;B:RH model;C:GSP(50 mg/kg);D:GSP(200 mg/kg);E:captopril.圖1 各組大鼠胸主動(dòng)脈血管重塑形態(tài)學(xué)參數(shù)的變化

表2 各組大鼠胸主動(dòng)脈血管重塑形態(tài)學(xué)參數(shù)的變化Table 2.The changes of morphological parameters of thoracic aorta remodeling of rats in each group(±s.n=7)

表2 各組大鼠胸主動(dòng)脈血管重塑形態(tài)學(xué)參數(shù)的變化Table 2.The changes of morphological parameters of thoracic aorta remodeling of rats in each group(±s.n=7)

＊＊P ＜0.01 vs control;#P ＜0.05，##P ＜0.01 vs RH model.

Group MT(μm) LD(μm)MT/LD Control 65.7±2.8 1 262.0±12.0 0.0520±0.0017 RH model 108.9±4.8＊＊ 1 044.0±12.1＊＊ 0.1040±0.0034＊＊GSP(50 mg/kg) 100.1±3.0# 1 077.0±12.8# 0.0930±0.0032##GSP(200 mg/kg) 71.2±3.2## 1 249.0±11.5## 0.0570±0.0021##Captopril 71.4±3.0## 1 249.0±9.5## 0.0570±0.0020##

3 各組大鼠胸主動(dòng)脈膠原含量的變化

由圖2可見(jiàn)，對(duì)照組大鼠胸主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞間藍(lán)色的膠原纖維較少，呈直線狀，分布均勻。RH模型組大鼠主動(dòng)脈平滑肌束間見(jiàn)大量藍(lán)色的膠原纖維增生，彎曲排列;膠原面積和統(tǒng)計(jì)場(chǎng)總面積比值高于對(duì)照組。經(jīng)GSP和卡托普利治療后，大鼠胸主動(dòng)脈平滑肌束間膠原纖維有不同程度的減少，膠原面積和統(tǒng)計(jì)場(chǎng)總面積比值亦明顯降低。

4 各組大鼠腹主動(dòng)脈組織中AngⅡ含量的變化

灌胃治療6周后，RH模型組的大鼠血管組織中AngⅡ的含量顯著高于對(duì)照組(P＜0.01);GSP治療組大鼠血管組織中AngⅡ有所降低(P＜0.05)，但低劑量治療組仍高于對(duì)照組，高劑量治療組降低更顯著，與captopril組治療效果相當(dāng)，與對(duì)照組沒(méi)有顯著差異，見(jiàn)表1。

Figure 2.Expression of collagen in abdominal aorta of rats in each group(Masson staining，×400).A:control;B:RH model;C:GSP(50 mg/kg);D:GSP(200 mg/kg);E:captopril.±s.n=7.＊＊P＜0.01 vs control;#P＜0.05，##P＜0.01 vs RH model.圖2 各組大鼠腹主動(dòng)脈膠原的表達(dá)

Figure 3.The expression of TNF－α protein detected by Western blotting.±s.n=7.＊＊P＜0.01 vs control;#P＜0.05，##P ＜0.01 vs RH model.圖3 Western blotting檢測(cè)TNF－α蛋白的表達(dá)

5 各組大鼠腹主動(dòng)脈組織中TNF－α蛋白表達(dá)的變化

RH模型組TNF－α蛋白表達(dá)與對(duì)照組相比明顯增多，各治療組的TNF－α蛋白表達(dá)有不同程度的降低(low GSP組有降低作用，但是仍高于對(duì)照組;high GSP組降低作用十分顯著，與captopril組的降低效果相當(dāng))，見(jiàn)圖3。

討 論

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，RH模型組大鼠尾動(dòng)脈SBP明顯升高，胸主動(dòng)脈中膜明顯增厚，平滑肌肌束間膠原纖維明顯增生，管腔內(nèi)徑變小，說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)成功復(fù)制了腎血管性高血壓大鼠模型，且主動(dòng)脈血管發(fā)生了重塑。應(yīng)用GSP治療后，能顯著降低RH模型組大鼠尾動(dòng)脈SBP(與我們先前的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致)，同時(shí)亦能明顯減輕高血壓大鼠胸主動(dòng)脈的中膜增厚、管腔狹窄和膠原纖維的增生程度，即GSP在降壓的同時(shí)，也能夠明顯抑制血管結(jié)構(gòu)的改變，具有改善高血壓血管重塑的作用。鑒于近年來(lái)高血壓臨床治療目標(biāo)已從過(guò)去的僅限于控制血壓水平，到現(xiàn)在提高到逆轉(zhuǎn)血管重塑的高度［4］這一新理念，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果對(duì)于開(kāi)發(fā)GSP成為治療高血壓病的理想藥物提供了新的理論依據(jù)。

血管活性物質(zhì)如AngⅡ的促血管重塑作用是近年研究的熱點(diǎn)［5］。AngⅡ可通過(guò)某些生長(zhǎng)因子或炎癥因子的介導(dǎo)，刺激膠原纖維增生和細(xì)胞外基質(zhì)沉積，加速血管平滑肌細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育，促進(jìn)高血壓血管重塑的形成［6－7］。此外，AngⅡ還可以促進(jìn)核酸合成，調(diào)控某些基因表達(dá)，刺激血管增殖［8］;通過(guò)激活氧化還原敏感通路以及轉(zhuǎn)錄因子來(lái)誘導(dǎo)整合素、黏連分子、細(xì)胞因子以及促生長(zhǎng)和纖維化催化劑的合成，發(fā)揮促炎癥和促血管重塑的作用［7］。本研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，RH模型組大鼠血管中AngⅡ含量明顯增高，經(jīng)GSP治療后，AngⅡ含量有所降低，且血管重塑的形態(tài)學(xué)參數(shù)變化減小，提示GSP可通過(guò)抑制AngⅡ的生成，減輕高血壓的血管重塑。

TNF－α是人體內(nèi)最重要的炎癥細(xì)胞因子之一，近年來(lái)發(fā)現(xiàn)其與高血壓心血管重塑密切相關(guān)。TNF－α可使自發(fā)性高血壓大鼠血管平滑肌細(xì)胞的增殖從G1期進(jìn)入S期更快(與WKY大鼠相比)，從而可促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞增殖，調(diào)節(jié)動(dòng)脈壁厚度［9］;TNF－α能促進(jìn)IL－1的分泌(IL－1可以促進(jìn)血管平滑肌增殖，使血管壁增厚，管腔變小)及AngⅡ的釋放，使血管發(fā)生重塑;也可通過(guò)促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞c－sis、cmyc和c－fos等原癌基因的異常表達(dá)，增加內(nèi)皮素表達(dá)，從而導(dǎo)致DNA合成增加，使血管壁增厚，管腔縮小，外周阻力增加，動(dòng)脈順應(yīng)性減退［10－11］。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用Western blotting檢測(cè)大鼠主動(dòng)脈TNF－α的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)GSP能明顯降低RH模型組大鼠主動(dòng)脈中TNF－α的高表達(dá)，降低效果與陽(yáng)性對(duì)照藥captopril相當(dāng)，提示，GSP亦可通過(guò)抑制血管組織中促炎因子TNF－α的表達(dá)，發(fā)揮抗高血壓血管重塑作用。

總之，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明GSP在降壓的同時(shí)，還可以通過(guò)降低血管組織中AngⅡ的含量和TNF－α的蛋白表達(dá)，以減輕高血壓的血管重塑。鑒于GSP具有多種藥理活性，其抗高血壓血管重塑的其它機(jī)制有待進(jìn)一步探討。

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