沈 楠， 銀 濤， 王大鵬， 王偉東， 謝 華， 孫艷玲， 林洪麗

(大連醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院腎內(nèi)科，遼寧大連116011)

各種進(jìn)行性慢性腎臟病發(fā)展為終末期腎功能衰竭的共同的病理特征為腎間質(zhì)纖維化［1］。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子 β1(transforming growth factor β1，TGF － β1)是作用最強(qiáng)的致腎纖維化細(xì)胞因子［2－3］，它通過(guò)促進(jìn)腎小管上皮細(xì)胞間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial－mesenchymal transition，EMT)和細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)的過(guò)度沉積最終導(dǎo)致腎臟纖維化［4］。通常情況下，TGF－β先與其Ⅱ型受體結(jié)合，再使Ⅰ型受體磷酸化并與前二者結(jié)合，激活下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，發(fā)揮致纖維化作用［5］。近年來(lái)的研究表明核心巖藻糖化對(duì)TGF－β1生理功能的發(fā)揮具有重要作用［6］，巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶8(fucosyltransferase 8，F(xiàn)UT8)是TGF－β1受體糖基化修飾的關(guān)鍵酶［7］。目前尚未見(jiàn)系統(tǒng)研究參與腎間質(zhì)纖維化的FUT8表達(dá)和分布的報(bào)道。因此，我們以經(jīng)典的單側(cè)輸尿管梗阻(unilateral ureteral obstruction，UUO)模型為腎間質(zhì)纖維化模型［8］，通過(guò)檢測(cè)FUT8和TGF－β致纖維化的關(guān)鍵受體活化素受體樣激酶 5(activin receptor－like kinase 5，ALK5)在腎臟的表達(dá)和分布，以期弄清 FUT8及ALK5在正常腎臟和腎間質(zhì)纖維化發(fā)生和進(jìn)展中的分布和變化規(guī)律，揭示TGF－β在腎間質(zhì)纖維化中的作用機(jī)制。

材料和方法

1 動(dòng)物

雄性Wistar大鼠，體重180～200 g(大連醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供)，常規(guī)飼料喂養(yǎng)。

2 主要試劑

Trizol試劑(Invitrogen)，AMV Hot Start酶、TaKa-Ra RNA PCR Kit 3.0試劑盒，F(xiàn)UT8和 β －actin引物(大連寶生物公司)，兔抗大鼠FUT8、ALK5、α－平滑肌肌動(dòng)蛋白(α －smooth muscle actin，α －SMA)、Ⅰ型膠原(collagen type I，Col I)、纖維連接蛋白(fibronectin，F(xiàn)N)和 β －actin多克隆抗體(Santa Cruz)，辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記抗鼠、抗兔、抗山羊的IgG(H+L)和免疫組化染色試劑盒SP－9003(北京中杉金橋生物技術(shù)公司)，F(xiàn)ITC－兔抗羊 IgG(H+L)(Invitrogen)，TRITC－驢抗羊IgG(H+L)和FITC－驢抗兔IgG(H+L)(Proteintech)。

3 主要方法

3.1 實(shí)驗(yàn)分組 將90只大鼠隨機(jī)分為3組:(1)正常對(duì)照組(control)30只;(2)假手術(shù)組(sham)30只，僅切開(kāi)腹腔并游離左側(cè)輸尿管，不予結(jié)扎和剪斷;(3)UUO組30只，參照文獻(xiàn)［9］行UUO術(shù)。分別于 UUO 術(shù)后1 d、3 d、7 d、14 d 和21 d 處死，每次分別隨機(jī)處死control組、sham組和UUO組各6只大鼠。取大鼠下腔靜脈血上清置于－20℃保存待測(cè)。左側(cè)腎臟用肝素生理鹽水原位灌流去除血細(xì)胞后，腎組織部分行10%中性甲醛固定，部分做冰凍切片處理，其余于液氮中保存。

3.2 生化指標(biāo)的檢測(cè) 使用日立7080全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定各組大鼠血肌酐及尿素氮。

3.3 腎臟病理及腎小管損傷和間質(zhì)纖維化評(píng)估取各組大鼠腎臟組織經(jīng)固定、脫水、浸蠟、包埋、切片，行PAS及Masson染色。腎小管間質(zhì)損傷指數(shù)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)參照文獻(xiàn)［10］。腎小管間質(zhì)纖維化分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)參照文獻(xiàn)［11］，由2名觀察者采用雙盲法獨(dú)立進(jìn)行評(píng)價(jià)。

3.4 RT－PCR檢測(cè)FUT8 mRNA的表達(dá) Trizol法提取各組腎組織總RNA，取RNA 1 μg，按RNA PCR Kit 3.0試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，大鼠FUT8和βactin引物序列來(lái)自PrimerBank。反應(yīng)條件為:30℃10 min，42 ℃ 30 min，99 ℃ 5 min，5 ℃ 5 min。取出5 μL反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，在20 μL PCR反應(yīng)體系中進(jìn)行FUT8 cDNA的擴(kuò)增，反應(yīng)條件為:96℃ 5 min，96℃45 s，60 ℃ 45 s，72 ℃ 90 s，35 個(gè)循環(huán)，72 ℃ 7 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后，使用凝膠成像分析系統(tǒng)進(jìn)行mRNA水平半定量分析，以FUT8與內(nèi)參照β－actin的比值作為FUT8的相對(duì)含量值，引物序列見(jiàn)表1。

表1 引物序列Table 1.Sequences for primers

3.5 Western印跡法檢測(cè)FUT8蛋白的表達(dá) 各組取等量蛋白樣品(100 μg)上樣，經(jīng)10%聚丙烯酰胺凝膠電泳后，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，加入Ⅰ抗(1∶100)4℃孵育過(guò)夜，洗膜后孵育Ⅱ抗(1∶3 000)1 h，用ECL試劑曝光、顯影。以β－actin作內(nèi)參照，應(yīng)用圖像分析軟件對(duì)特異性條帶作吸光度定量分析，以反映蛋白相對(duì)表達(dá)量。

3.6 免疫熒光法檢測(cè)FUT8和ALK5的表達(dá) 將腎皮質(zhì)組織切成3 μm的冰凍切片，室溫封閉1 h，Ⅰ抗(1∶100)4℃孵育過(guò)夜。Ⅱ抗(1∶300)室溫避光孵育0.5 h。DAPI染核并封片，于Leica熒光顯微鏡下觀察。使用Image－Pro Plus 6.0圖像分析系統(tǒng)對(duì)結(jié)果進(jìn)行半定量分析，每張切片隨機(jī)選取10個(gè)視野，計(jì)算每個(gè)視野內(nèi)染色區(qū)域的平均吸光度值，以均值計(jì)算每個(gè)標(biāo)本的IA值，最后以每組的IA值進(jìn)行比較。

3.7 免疫組化檢測(cè)FN、Col I和α－SMA的表達(dá)石蠟包埋的組織切片常規(guī)脫蠟至水，3%過(guò)氧化氫室溫孵育15 min，經(jīng)微波加熱修復(fù)抗原后，每片加10%山羊血清室溫孵育15 min，滴加Ⅰ抗(1∶100)4℃孵育過(guò)夜，再依次加入生物素標(biāo)記Ⅱ抗和辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鏈酶卵白素工作液，室溫孵育30 min，在顯微鏡觀察下DAB顯色，蘇木素復(fù)染。PBS緩沖液代替Ⅰ抗作陰性對(duì)照。結(jié)果為蛋白的陽(yáng)性表達(dá)部位呈棕黃色深染，每例切片隨機(jī)觀察10個(gè)視野，以Imagetools軟件計(jì)算陽(yáng)性表達(dá)部位染色面積總和與視野內(nèi)腎小管間質(zhì)總面積(除去腎小管管腔面積)，以兩者的比值并取平均值作為每只實(shí)驗(yàn)大鼠的實(shí)際檢測(cè)值并記錄結(jié)果。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

1 各組大鼠腎組織病理變化

PAS與Masson染色顯示，UUO術(shù)后第7 d時(shí)腎小管擴(kuò)張明顯，腎間質(zhì)可見(jiàn)大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。第14 d可見(jiàn)皮質(zhì)及近髓萎縮腎小管較多，間質(zhì)纖維化較明顯，見(jiàn)圖1。

Figure 1.PAS and Masson staining of the renal tissue sections from different groups(×400).圖1 各組大鼠腎臟組織病理改變

2 各組大鼠腎功能檢測(cè)

UUO組血肌酐及尿素氮自術(shù)后3 d出現(xiàn)升高(P ＜0.05)，在第21 d達(dá)到最高值(P ＜0.01)，見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠不同時(shí)點(diǎn)血肌酐及尿素氮的比較Table 2.The changes of serum creatinine and urea nitrogen levels in different groups(±s.n=6)

表2 各組大鼠不同時(shí)點(diǎn)血肌酐及尿素氮的比較Table 2.The changes of serum creatinine and urea nitrogen levels in different groups(±s.n=6)

*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs control group.

Days of UUO Creatinine(μmol/L)Urea nitrogen(mmol/L)Control Sham UUO Control Sham UUO 1 41.36 ±3.12 39.57 ±5.03 43.19 ±6.23 4.43 ±1.18 4.27 ±0.25 4.35 ±1.23 3 42.21 ±5.24 42.93 ±7.87 64.47 ±3.22* 4.55 ±0.23 4.79 ±1.27 6.53 ±0.33*41.42 ±1.25 41.57 ±4.12 70.12 ±2.12* 4.43 ±0.05 4.83 ±1.08 8.39 ±1.47*14 42.83 ±2.17 41.18 ±3.44 73.15 ±5.35＊＊ 4.35 ±1.93 4.04 ±0.63 10.17 ±2.26＊＊21 43.47 ±3.37 43.16 ±2.37 75.49 ±4.15＊＊ 4.16 ±0.85 4.26 ±1.67 15.16 ±3.73 7＊＊

3 腎間質(zhì)損傷指數(shù)

UUO組腎間質(zhì)損傷指數(shù)于術(shù)后1 d開(kāi)始升高(P ＜0.05)，并持續(xù)至 21 d(P ＜0.01)，sham 組與control組表達(dá)無(wú)顯著差異(P＞0.05)，見(jiàn)表3。

表3 各組大鼠腎小管間質(zhì)損傷指數(shù)比較Table 3.The changes of tubulointerstitial damage index in different groups(±s.n=6)

表3 各組大鼠腎小管間質(zhì)損傷指數(shù)比較Table 3.The changes of tubulointerstitial damage index in different groups(±s.n=6)

*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs control group.

*3 0.43 ±0.54 0.44 ±0.05 1.95 ±0.25*7 0.34 ±0.27 0.38 ±0.16 4.35 ±0.17＊＊14 0.47 ±0.19 0.53 ±0.08 5.18 ±0.39＊＊21 0.45 ±0.32 0.47 ±0.07 6.47 ±0.14＊＊

4 RT－PCR結(jié)果

與control組相比，UUO術(shù)后第3 d FUT8mRNA的表達(dá)開(kāi)始增加，隨著梗阻時(shí)間的遞增，在第14 d達(dá)到最高(P ＜0.05)，見(jiàn)圖2。

5 Western印跡法與免疫熒光法結(jié)果

與control組相比，UUO術(shù)后第3 d起，腎臟FUT8蛋白表達(dá)增加，隨時(shí)間遞增，術(shù)后第14 d達(dá)到高峰(P ＜0.01)，見(jiàn)圖3。

與 control組相比，UUO術(shù)后第7 d起，腎臟FUT8和ALK5在腎小管上皮細(xì)胞共表達(dá)區(qū)域增強(qiáng)，隨時(shí)間遞增，術(shù)后第14 d達(dá)到高峰(P＜0.05)，見(jiàn)圖4，且表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.87，P ＜0.05)，見(jiàn)表4。

6 免疫組化結(jié)果

與control組相比，UUO術(shù)后第7 d起，腎臟α－SMA、ColⅠ、FN在腎小管間質(zhì)表達(dá)增加，隨時(shí)間遞增，術(shù)后第14 d達(dá)到高峰(P＜0.01)，且表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.89，r=0.76，r=0.80，P ＜ 0.05)，見(jiàn)圖 5、表5。

Figure 2.Expression of FUT8 mRNA in the renal tissues from different groups(RT－PCR).±s.n=6.＊＊P＜0.01 vs control group.圖2 各組大鼠腎組織FUT8 mRNA的表達(dá)

Figure 3.Expression of FUT8 protein in the rat renal tissues from different groups(Western blotting).±s.n=6.*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs control group.圖3 各組大鼠腎組織FUT8蛋白的表達(dá)

Figure 4.Expression of FUT8 and ALK5 proteins in the tubulointerstitium of different groups(immunofluorescence，×400).圖4 各組大鼠腎組織FUT8和ALK5蛋白在腎小管間質(zhì)的表達(dá)

表4 各組大鼠免疫熒光陽(yáng)性染色面積Table 4.The positive staining areas of FUT8 and ALK5 in the tubulointerstitium in different groups(IA.±s.n=10)

表4 各組大鼠免疫熒光陽(yáng)性染色面積Table 4.The positive staining areas of FUT8 and ALK5 in the tubulointerstitium in different groups(IA.±s.n=10)

*P ＜0.05 vs control group.

Control 1.80 ±0.15 1.44 ±0.46 UUO 7 d 5.93 ±0.28* 5.15 ±0.48*UUO 14 d 8.38 ±0.34* 7.59 ±0.39*

Figure 5.Expression of col I，α － SMA and FN proteins in the tubulointerstitium of different groups(immunohistochemistry，×200).圖5 各組大鼠腎組織Col I、α－SMA和FN蛋白在腎小管間質(zhì)的表達(dá)

表5 各組大鼠α－SMA、Col I、FN陽(yáng)性染色面積Table 5.The positive staining areas of α － SMA，Col I and FN in the tubulointerstitium in different groups(IA.±s.n=10)

表5 各組大鼠α－SMA、Col I、FN陽(yáng)性染色面積Table 5.The positive staining areas of α － SMA，Col I and FN in the tubulointerstitium in different groups(IA.±s.n=10)

*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs control group.

Group α －SMA Col I FN Control 2.25 ±1.03 2.48 ±2.46 2.09 ±1.89 UUO 7 d 9.14 ±1.34* 9.35 ±2.48* 8.75 ±2.48*UUO 14 d 13.75 ±1.74＊＊ 12.56 ±3.59＊＊ 11.18 ±3.98＊＊

討 論

TGF－β是促進(jìn)腎間質(zhì)纖維化發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵因子，阻斷TGF－β信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路激活可以延緩腎間質(zhì)纖維化的病理進(jìn)程，以往有針對(duì)于阻斷該通路活化的方法是通過(guò)下調(diào)通路中關(guān)鍵因子或受體的表達(dá)。然而隨著功能蛋白質(zhì)組學(xué)研究的深入，發(fā)現(xiàn)許多蛋白質(zhì)發(fā)揮功能不僅和其表達(dá)水平相關(guān)，與其翻譯后修飾也有著密切聯(lián)系，后者常是其發(fā)揮生物學(xué)功能所必需的［12－13］。糖基化修飾是一種重要的蛋白翻譯后修飾方式，參與了靶蛋白反應(yīng)的多種重要生理及病理過(guò)程:如細(xì)胞轉(zhuǎn)移、增殖、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等過(guò)程，而上述過(guò)程與腎間質(zhì)纖維化發(fā)生發(fā)展過(guò)程密切相關(guān)［14］。TGF－β發(fā)揮作用是通過(guò)它的受體來(lái)完成的，ALK5是TGF－β通路的關(guān)鍵始動(dòng)受體，其表達(dá)和活化是TGF－β通路活化的必備條件。FUT8是催化ALK5糖基化修飾的關(guān)鍵酶。但目前尚不清楚UUO大鼠在腎間質(zhì)纖維化過(guò)程中FUT8表達(dá)的變化。

腎間質(zhì)纖維化有2個(gè)主要的病理特征:一是腎小管上皮細(xì)胞－肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化，一是細(xì)胞外基質(zhì)過(guò)度集聚［15］。α－SMA被認(rèn)為是腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化和腎間質(zhì)纖維化程度的重要指標(biāo)［16］。本實(shí)驗(yàn)選用α－SMA作為評(píng)估EMT的指標(biāo)，選用ECM的主要成分Ⅰ型膠原和FN作為評(píng)估ECM集聚的指標(biāo)［17］。

我們選用UUO大鼠作為腎間質(zhì)纖維化的模型，首次發(fā)現(xiàn)和證實(shí)在腎間質(zhì)纖維化形成過(guò)程中腎小管上皮細(xì)胞 FUT8表達(dá)升高，在 UUO組中 FUT8與ALK5的表達(dá)定位在腎間質(zhì)及小管上皮細(xì)胞同一區(qū)域并且同步增加，與梗阻的時(shí)間及腎間質(zhì)纖維化的程度密切相關(guān)。我們推測(cè)TGF－β信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在腎間質(zhì)纖維化的發(fā)生進(jìn)程中，由FUT8所催化的TGF－βRⅡ糖基化修飾增加，通過(guò)與配體相結(jié)合從而進(jìn)一步促使TGF－βⅠ型受體ALK5表達(dá)增加，作用于其下游信號(hào)分子從而激活其所調(diào)節(jié)的與纖維化相關(guān)聯(lián)靶基因的轉(zhuǎn)錄，最終參與介導(dǎo)了腎小管間質(zhì)纖維化的進(jìn)程。FUT8與ALK5的表達(dá)具有時(shí)空一致性，其表達(dá)與α－SMA、ECM成分及腎間質(zhì)小管損傷指數(shù)均呈正相關(guān)，與腎纖維化的發(fā)展密切相關(guān)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示在腎間質(zhì)纖維化進(jìn)程中，TGF－β受體糖基化修飾發(fā)生改變，這種改變可能參與TGF－β信號(hào)通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程，為TGF－β在腎間質(zhì)纖維化中作用機(jī)制補(bǔ)充了新內(nèi)容。

綜上所述，本研究表明在腎間質(zhì)纖維化的進(jìn)展中，F(xiàn)UT8與ALK5表達(dá)呈時(shí)空一致性升高，可能與腎間質(zhì)纖維化程度密切相關(guān)。這為探索腎小管上皮細(xì)胞EMT的發(fā)生機(jī)制提供了新視角，同時(shí)也為臨床上尋找治療腎臟間質(zhì)纖維化發(fā)生新靶點(diǎn)提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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