施海霞，陳 煒，鄧 巍，梁 虹

（中國醫(yī)學科學院，北京協(xié)和醫(yī)學院，醫(yī)學實驗動物研究所衛(wèi)生部人類疾病比較醫(yī)學重點實驗室，北京 100021）

本課題組利用造血干細胞囊胚顯微注射法構建了人源化小鼠造血嵌合體模型，在2月齡人源化小鼠中仍可檢測到人源化細胞的存在［2］，但2月齡雄性人源化小鼠中出現(xiàn)顯著的疝氣癥狀。本文對疝氣的病因、對動物生理、行為表型及對模型應用的潛在影響進行了研究。

1 材料和方法

1.1 人造血干祖細胞制備

正常健康新生兒臍血由北京市臍帶血造血干細胞庫提供（孕母排除病毒性肝炎、艾滋病和梅毒感染）。臍血用肝素鈉抗凝，12 h內分選。用Ficoll Paque PLUS淋巴細胞分離液（密度1.077，GE Healthcare公司）以不連續(xù)密度梯度離心，收集界面白膜層懸浮細胞即為臍血單個核細胞（MNC），MNC再經(jīng)EasySep復選人造血干祖細胞（含CD41）試劑盒（stemcell公司）分選獲得人造血干祖細胞。

1.2 干細胞囊胚顯微注射

以3～4周齡ICR雌鼠作為囊胚供體鼠。采用PMSG和hCG進行超排處理，第2.5天取桑椹胚，KSOM液培養(yǎng)過夜，次日囊胚充分擴張后進行造血干細胞的顯微注射，每個囊胚內注射15～20枚造血干細胞，移植入假孕鼠2.5 d子宮中。

1.3 人源化小鼠的鑒定

小鼠出生后9～14 d剪尾，堿裂解法提取基因組DNA，用人線粒體DNA特異性引物進行PCR檢測：hm tDNA-FP：5＇CAC CCT ATT AAC CAC TCA CG 3＇；hmtDNA-RP：5＇ATG TCT GTG TGG AAA GCG 3＇，擴增產物大小為264 bp。反應條件：94℃預變性3 min，94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，40個循環(huán)，72℃延伸10 min。

Michael Mauer:優(yōu)秀的設計源自于“天馬行空”一般的創(chuàng)意，但它們最終要回歸到源于紀律、架構、目標等略顯枯燥的細化階段。在這個階段，除了自由和創(chuàng)意，我們還需要勤奮、認真和嚴謹?shù)墓ぷ鲬B(tài)度。就像我剛才說的，設計師可以用感性的方式來創(chuàng)新，但也必須要具備理性的思維來實踐。好的設計師就像一名經(jīng)驗豐富的運動員，擁有十分準確的預判技巧，也有著沉著、冷靜的執(zhí)行能力。設計雖然能夠令人沉醉其中，但我也不否認，做一名優(yōu)秀的設計師其實很辛苦。

1.4 病理學觀察

小鼠斷頸處死，取5只疝氣癥狀的人源化陽性小鼠和5只野生型小鼠的腹股溝區(qū)和陰囊組織，10％中性福爾馬林（neutral buffered formalin，NBF）固定，脫水，石蠟包埋，切片厚度10μm，Masson染色觀察膠原纖維含量。采用特異性人CD45抗體（abcom ab8216）進行免疫組織化學染色，檢測相應組織中人源化細胞的表達。

1.5 行為學檢測

選用2月齡的人源化陽性和陰性雄性小鼠各9只，野生型小鼠10只，采用modified SHIRP進行行為學初篩［3］。隨后采用Rota-rod轉輪測試儀（UGO公司，意大利）進行小鼠運動與耐力測定，參數(shù)設置：最小速度為5 rpm，最大速度為20 rpm，加速度時間為5 min，將實驗小鼠分別放到相應的跑道上，開啟儀器，記錄動物的爬行持續(xù)時間。最后，采用Morris水迷宮進行運動型和游泳耐力測定，水溫25℃，記錄動物在1m in內的游泳距離、速度和活躍期時間。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

實驗結果采用平均值±SE表示，并用SPSS軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計，數(shù)據(jù)經(jīng)正態(tài)分布和方差齊性檢驗后，采用獨立樣本t檢驗對人源化陽性組合野生型對照組數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計，采用one-way ANOVA分析對陽性組、陰性組和野生對照組數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。當P＜0.05時為差異顯著。

2 結果

本研究通過干細胞顯微注射法將人臍血干祖細胞注射到小鼠囊胚中，成功獲得了人源細胞嵌合體小鼠，嵌合體陽性率為23％［2］。在20只人源化雄性小鼠中，有90％的個體出現(xiàn)程度不一的疝氣癥狀，本研究對這些疝氣癥狀小鼠進行了病理學、生理學和行為學表型分析：

1.病理觀察

我們解剖了5只2月齡以上的雄性小鼠，小鼠的體表外觀上可見程度不等的陰囊腫脹，剪開疝囊，內容物包括小腸、大腸、膀胱等腹部臟器（彩插8圖1），這些內容物不可回縮至腹腔。

鏡下Masson染色顯示，與野生型小鼠相比，人源化嵌合體小鼠腹膜腹股溝區(qū)致密結締組織減少（彩插8圖2）。但免疫組化研究結果表明，這些病變組織中不存在人源化細胞。

2.睪丸系數(shù)與血液激素含量

人源化嵌合體陽性和陰性及野生型雄性小鼠的睪丸系數(shù)（F2，10=2.982，P=0.108）、血液睪酮（F2，10=0.009，P=0.991）和皮質酮（F2，10=0.008，P =0.992）濃度之間均無顯著差異。

表1 人源化小鼠繁殖系統(tǒng)功能Tab.1 Mean values of reproductive system function

3.運動行為學

對人源化小鼠行為學初篩表明，在尾巴姿勢和反抗行為這兩個指標上，人源化小鼠、人源化陰性小鼠和野生型小鼠之間具有顯著差異（尾巴姿勢：F =3.571，P=0.043；反抗行為：F=3.551，P= 0.044），其中，人源化小鼠的尾巴姿勢得分顯著高于野生型小鼠（P=0.014），人源化小鼠尾巴上翹的比例高于野生型小鼠，這可能是因為陰囊腫大引起的尾巴姿勢變化，而不代表動物的應激性升高。人源化小鼠的逃逸行為（P=0.03）和反抗行為（P =0.015）顯著低于陰性嵌合小鼠。人源化小鼠的正位反射（P=0.034）高于野生型小鼠。人源化小鼠的抓力（P=0.027）顯著低于野生型小鼠，表明小鼠的后肢運行協(xié)調性下降（表2）。

在Rota-rod轉輪實驗中，各組之間具有顯著差異（F2，25=4.330，P=0.024）。其中，陽性和人源化陰性小鼠在轉棒上的運動持續(xù)時間均顯著低于野生型小鼠（P=0.03；P=0.012）。

各組小鼠在游泳距離（F2，26=3.572，P= 0.043）、速度（F2，26=3.546，P=0.043）上具有顯著差異，人源化小鼠的游泳距離和速度顯著低于野生型小鼠（P=0.014）而各組小鼠的活躍期時間（F2，26=1.373，P=0.271）無顯著差異。

表2 Modified SHIRPA行為學實驗結果Tab.2 Behavior anaylsis in modified SHIRPA

表3 Rota-rod轉輪實驗Tab.3 The Rota-rod Test

3 討論

恥骨肌孔（myopectineal orifice）是一個位于腹股溝區(qū)的卵圓形裂孔，僅以一層腹橫筋膜結締組織抵抗腹腔內壓力，這部位區(qū)域的薄弱會引起疝氣形成［4］。本研究表明人源化小鼠腹股溝區(qū)致密結締組織減少，致密結締組織是筋膜鞘的主要組分，因此致密結締組織的減少可能是疝氣形成的直接原因。并且，疝氣僅在2月齡以上成年雄性個體中發(fā)生。因此，人源化小鼠疝氣表型屬于直接性腹股溝疝。

研究發(fā)現(xiàn)睪丸和精索由腹股溝管下降到陰囊的過程受雄激素的調節(jié)，兒童可因疝氣的擠壓而影響睪丸的正常發(fā)育［5，6］。本研究結果表明人源化小鼠的疝氣癥狀不影響睪丸的大小和功能，疝氣發(fā)生與睪酮變化無顯著相關性，這與人類男性腹股溝疝的發(fā)生與雄激素變化無關的結果相一致［7，8］。而在形成間接腹股溝疝的Insl3轉基因小鼠中，鞘狀突的形成與雄激素介導的睪丸引帶外突也無相關性。

人類疝氣患者具有易疲勞和體質下降等癥狀。本研究也發(fā)現(xiàn)，造血干細胞人源化小鼠的運動機能和耐力均顯著下降，但與運動興奮性相關的皮質酮激素含量卻無顯著變化。以往對人源化小鼠的相關研究發(fā)現(xiàn)，恒河猴骨髓間充質干細胞嵌合體小鼠在懸尾實驗時具有四肢抱攏的反?，F(xiàn)象［9］。而在本研究中，modified SHIRPA行為觀察發(fā)現(xiàn)，人源化小鼠的正位反射高于野生型小鼠，即懸尾狀態(tài)下動物頭部抬起概率增加。這與上述現(xiàn)象不同，但均說明嵌合體小鼠的神經(jīng)系統(tǒng)或運動系統(tǒng)中存在某種異常反射。提示在神經(jīng)系統(tǒng)或運動系統(tǒng)中有異源動物細胞嵌合，靈長類與小鼠神經(jīng)細胞及神經(jīng)系統(tǒng)反射機制的巨大差別可能是前述現(xiàn)象發(fā)生的原因。

異種動物造血嵌合體模型在人造血干細胞體內生物學特性、人類免疫相關疾病及其它應用研究方面具有巨大的應用潛力。目前常見的重癥聯(lián)合免疫缺陷小鼠干細胞移植系統(tǒng)在人類免疫系統(tǒng)功能塑造方面存在一定局限。在免疫系統(tǒng)尚未成熟的胚胎發(fā)育早期進行的人源干細胞顯微注射嵌合體小鼠是方法學上的一種新突破，對這種人源化小鼠的表型分析是該模型進一步應用的基礎，本研究結果表明人源化小鼠的疝氣表型對于小鼠運動性和耐力具有顯著抑制，但不影響小鼠的繁殖系統(tǒng)功能。

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