丁蘭平, 馬元元, 黃冰心

(汕頭大學(xué), 廣東汕頭 515063)

DNA條形碼(DNA barcoding)是一段特殊的、可用于物種鑒定的DNA序列, 是近幾年以來國際上生物分類學(xué)研究的主要熱點之一[1], 其技術(shù)的發(fā)展為后現(xiàn)代生物分類學(xué)的研究與完善提供了有力的手段。在一定前提條件下, 它既可以用來驗證已知分類群鑒定的準確性, 也可以用來發(fā)現(xiàn)新的物種。

簡單地說, DNA條形碼是通過對一組來自不同生物個體的較短同源DNA序列進行 PCR擴增和測序, 并對序列進行多重比對和聚類分析, 從而將該個體精確定位到一個已描述的分類群中, 甚至還可提供充分的信息將某些物種定位到特定的地理種群[2]。

迄今為止, 已有大量的基因片段被作為DNA條形碼用于物種的鑒定[3], 既有單一序列也有組合序列[3-5], 但對于植物 DNA條形碼的選擇還沒有一個明確的統(tǒng)一標準。目前, 一般認為較理想的DNA條形碼標準要具有如下特征: 1)種間具有明顯的變異而種內(nèi)變異足夠小; 2)應(yīng)盡可能是相同的一段DNA片段; 3)DNA片段應(yīng)足夠短, 長度約700 bp左右, 便于單向測序; 4)存在高度保守區(qū)域, 便于設(shè)計通用引物;5)目標DNA條形碼應(yīng)包含充分的進化信息, 便于對物種進行系統(tǒng)地位確認[6-7]。

用 DNA條形碼對物種進行鑒定具有很多優(yōu)點,1)不受個體形態(tài)特征變異和發(fā)育階段影響; 2)對形態(tài)分類難以區(qū)分的類群, DNA條形碼可從基因水平上提供一種分類鑒定依據(jù); 3)核苷酸序列數(shù)據(jù)庫作為數(shù)字化平臺, 能彌補形態(tài)鑒定的不足, 從而有利于加快已知物種的識別速度。

鑒于近幾年以來DNA條形碼技術(shù)已在海藻學(xué)研究中得到了一定程度的應(yīng)用和發(fā)展[8-19], 為了跟蹤國際上的這種新變化, 本文嘗試論述大型海藻學(xué)研究中DNA條形碼技術(shù)的應(yīng)用及前景, 目的是希望將其更廣泛地應(yīng)用于海藻物種多樣性鑒定、新物種的發(fā)現(xiàn)等研究領(lǐng)域, 促使我國海藻分類學(xué)盡快融入國際后現(xiàn)代分類學(xué)系統(tǒng)中。

1 背景及發(fā)展史

人類在利用地球自然生物資源過程中逐步發(fā)展了生物分類學(xué), 正確區(qū)分物種, 特別是具有重要經(jīng)濟和/或環(huán)境價值的種類, 都離不開對物種的分類鑒定。分類學(xué)的主要任務(wù)包括描述和鑒定物種, 提供簡潔、方便的信息檢索系統(tǒng)。分子系統(tǒng)學(xué)則是借助于分子水平的標記, 如基因序列進行的系統(tǒng)研究。分子水平標記是近十幾年來廣泛采用的指標, 但不同的指標針對的系統(tǒng)水平是不同的, 屬間分類標準一般采用細胞核或質(zhì)體基因組標記[20]。各種分子遺傳標記的研究在陸地生物學(xué)中已深入開展, 在海洋生物學(xué)中分子遺傳標記的研究也是方興未艾[21]。注意到在物種鑒定中分子系統(tǒng)學(xué)的重要性, 最近數(shù)十年,利用DNA中攜帶的遺傳信息來探討植物的系統(tǒng)發(fā)育引起了廣泛關(guān)注, 有許多是關(guān)于海藻的[3-4,8,11,22-23]。隨著該領(lǐng)域研究的不斷發(fā)展, 2003年, 加拿大 Paul Hebert教授等首次正式提出了 DNA條形碼的概念[24]。其基本思想是通過DNA片段中A、T、C和G等 4個堿基在基因中的排列順序識別物種, 原理類似于現(xiàn)代商品零售業(yè)的條形編碼系統(tǒng)。2004年 5月, 在華盛頓成立了生物條形碼聯(lián)盟(consortium for the barcode of life, CBOL), 致力于發(fā)展鑒定生物物種的全球標準。

2 大型海藻及DNA條形碼技術(shù)的應(yīng)用

2.1 大型海藻

大型海藻一般指紅藻、褐藻、綠藻和藍藻等四大門類, 和海洋浮游藻類一起構(gòu)成海洋的主要初級生產(chǎn)者。我國大型海藻物種資源比較豐富, 先后報道了1 277個物種[25]。長期以來, 由于簡單的外部形態(tài)和內(nèi)部生理結(jié)構(gòu)、生理上的趨同性以及高度的表型可塑性, 海洋藻類成為用傳統(tǒng)方法難以區(qū)分和鑒定的類群。海洋藻類的分類學(xué)一直是困擾人們的難題[26],隨著 DNA條形碼的出現(xiàn), 近幾年, 該技術(shù)已被逐漸應(yīng)用于各種海洋大型藻類的分類和鑒定[11-12]。

2.2 DNA條形碼技術(shù)的應(yīng)用

隨著滸苔的暴發(fā), 我國海藻分類學(xué)研究成了頗具爭議的焦點。面對嚴峻的質(zhì)疑和挑戰(zhàn), 開拓新的分類學(xué)方法勢在必行。其中, DNA條形碼技術(shù)由于具有某些較明顯的優(yōu)勢而吸引了大家的關(guān)注, 雖然在海洋藻類方面尚無統(tǒng)一的基因片斷和研究標準。

2.2.1 不同基因序列在大型海藻方面的應(yīng)用

相對于動物DNA條形碼技術(shù)而言, 高等植物和藻類DNA條形碼研究進展緩慢且存在較大爭議。目前, 已知陸續(xù)有10種基因序列、15對引物應(yīng)用到總計3個門類197個屬403個物種中, 而且大多集中在紅藻門, 達到 58%, 而綠藻門僅占 5.8%; 研究的基因主要是 COI(Mitochondrialcytochrome c oxidase subunit I, 細胞色素C氧化酶亞基Ⅰ)基因(26.3%)、ITS(internal transcribed spacer, 內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū))(17.1%)、UPA(universal plastid amplicon, the portion of 23S rDNA)(12.9%)等[27]。然而一些作者選擇的基因序列及研究對象各不相同, 無法判斷目標引物的通用性及適用性。

Lin等[28]利用rbcL(1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/氧化酶大亞基)基因片段擴增了仙菜目紅葉藻科 48個屬91份樣品, 建立了紅葉藻亞科、亮葉藻亞科和紅肋藻亞科等三亞科系統(tǒng)進化樹, 然而在更高分類階元上如科、目等,rbcL基因就起不到應(yīng)有的效果。Saunders等[8]分析了紅藻 3個群體的 46個樣品的COI, 發(fā)現(xiàn)它能準確地區(qū)分形態(tài)相似的種類, 并發(fā)現(xiàn)了一些新物種。Robba等[9]分析了紅藻門 6個目 79份樣品, 發(fā)現(xiàn)其種內(nèi)差異為 0%～2.6%, 屬內(nèi)種間差異為5.2%～27.5%, 因此認為COI可以分辨近緣種,且可劃分科級以下分類階元。Sherwood等[29]分析了107份藻類樣品, 包括紅藻、綠藻、褐藻、藍藻等, 發(fā)現(xiàn) UPA片段變異范圍非常大, 可將大多數(shù)種類區(qū)分開。褐藻分子系統(tǒng)學(xué)研究主要集中在 rRNA基因、rbcL和rbcS序列分析上[26], Lane等[30]利用COI、ITS和rbcSp (Plastid Rubisco operon spacer)基因分析了褐藻門翅藻屬Alaria的54個樣品, 發(fā)現(xiàn)單一的COI基因片段效果不佳, 而 3個基因片段的組合則能有效區(qū)分大部分種類。Brodie等[31]分析了紅藻門紫菜屬 102份樣品, 發(fā)現(xiàn) COI基因片段能將樣品鑒定到種。Yang等[32]分析了紅藻門江蘺屬11個種的28份樣品, 發(fā)現(xiàn) COI基因片段在江蘺屬內(nèi)的種間差異為13%±3.2%, 種內(nèi)差異為0.9%, 可將樣品區(qū)分為7個地理群; 而rbcL基因片段在江蘺屬內(nèi)的種間差異為1.2%～12.6%(平均 9.7%), 種內(nèi)差異為 0.289%。Conklin等[33]分析了紅藻門麒麟菜屬和卡帕藻屬的15個樣品, 發(fā)現(xiàn)這兩個屬的UPA基因片段有明顯差異, 而屬內(nèi)差異則非常小, 而 COI基因片段在屬級水平上則有明顯的差異。Freshwater等[14]發(fā)現(xiàn)紅藻門石花菜目的COI序列比rbcL序列更多變, 在姐妹種間具有更大的間隔區(qū), 認為 COI基因更適合作為石花菜目的分子輔助鑒定標簽。Rueness[34]對海洋紅藻中兩種多管藻 COI序列進行了比較, 表明它們只有1.2%的不同, 這兩種藻類的分類情況被解決。KIM等[35]分析了紅藻門5個種類75個樣本的COI序列,其中4種江蘺, 一種是龍須菜, 種內(nèi)不符合的偏差范圍在 0%～0.9%之間, 種間偏差是 9.2%～16.1%。Sherwood等[36]分析了紅藻門的17個目290份樣品,發(fā)現(xiàn)UPA標記序列成功率為64.7%, 而COI序列是46.8%, 表明這兩個序列在鑒定該樣品方面存在一定的差異性。Mattio等[37]研究潛在的 5種不同的標記作為DNA條形碼應(yīng)用在褐藻門馬尾藻屬, 結(jié)果論證了ITS-2和RubisCO作為條形碼標記的不充分性, 雖然它們暗示了作為線粒體標記的潛在性, 還需要額外的研究去進一步評估這些標記的鑒定成功性。McDevit等[38]分析了褐藻門20個屬106個種的COI基因片段, 發(fā)現(xiàn)其屬內(nèi)種間差異為 3.04%～10.08%,種內(nèi)差異為0.00%～0.46%。Macaya等[13]分析了世界19個地點的巨藻屬樣品(褐藻門)的 COI基因, 發(fā)現(xiàn)分布于南半球的隔離種類均為單倍型的。Kucera[18]將COI-5P(the 5'region of the mitochondrial cytochrome oxidase 1)作為 DNA條形碼應(yīng)用到褐藻門墨角藻屬Fucus的樣品鑒定中, 發(fā)現(xiàn)它與其他標記有相同的作用。

目前在褐藻和紅藻中 COI基因片段都是較為理想的條形碼片段, 但是針對綠藻 COI基因片段研究較少。

Saunders和Kucera[11]評估了海洋綠藻的rbcL、tufA、UPA、LSU和ITS等片段作為DNA條形碼標記的效果, 發(fā)現(xiàn)僅ITS有較低的成功率、tufA標記在擴增時有 95%的成功率(除剛毛藻科外), 認為 tufA適合作為海洋綠藻條形碼的標準分子標記。騰林宏[39]對剛毛藻目不同樣品序列的分析和構(gòu)建的系統(tǒng)樹清楚地表明, ITS和18S r DNA序列種間差異明顯大于種內(nèi)差異, 18S rD N A序列種內(nèi)差異0.0%～0.1%, 種間差異在0.3%～6.1%; ITS序列種內(nèi)差異0.0%～1.7%,種間差異 4.9%～63.4%, 顯示出分子方法對剛毛藻目物種的分類鑒定具有重要輔助作用。因此, 她認為,根據(jù)國際DNA條形碼的技術(shù)標準, 這兩個序列可以作為其分子條形碼對物種進行快速有效的鑒定[39]。

訖今, NCBI(美國國立生物技術(shù)信息中心)已公布了44種藻類葉綠體全基因組和40種藻類線粒體全基因組序列, 這是進一步設(shè)計和開發(fā)大型海藻DNA條形碼的有用資源, 將在基因水平闡述各級分類階元的劃分與系統(tǒng)構(gòu)建提供有力的支撐信息。

2.2.2 作為條形碼的不同基因的優(yōu)缺點

DNA條形碼需要有一個通用的標準序列, 但是找到能夠區(qū)分全部物種的理想DNA片段比較困難。目前認為, 線粒體基因適合作為通用DNA條形碼序列, 因為它沒有內(nèi)含子, 很少有重組現(xiàn)象, 并且大多為母系遺傳的單倍體。但植物線粒體基因組進化速率慢, 達不到條形碼的通用性要求, 因此植物 DNA條形碼序列主要在葉綠體和核基因上進行選擇。生物條形碼聯(lián)盟植物工作組已經(jīng)決定將葉綠體rbcL和matK(葉綠體基因組的成熟酶基因)兩個基因片段作為植物 DNA標準條形碼的核心條碼, 葉綠體trnH-psbA(葉綠體非編碼區(qū)片段)片段和核基因片段ITS為植物DNA條形碼的補充條碼。

(1)COI

2003年, Herbert研究發(fā)現(xiàn)利用COI基因一段長度為648bp的片斷, 能夠在DNA水平上成功地區(qū)分物種。COI基因序列是區(qū)分種間差異的有效分子標記, 因此可以利用 COI基因序列將因地理環(huán)境等因素造成表型各異的不同物種和其他種區(qū)分開來[40]。

COI基因具有以下優(yōu)點: 1) COI基因比核基因具有更豐富的系統(tǒng)進化信息, 和目前已知的其他蛋白質(zhì)基因相比, COI密碼子第3個位點的堿基置換更頻繁, 進化速率比12S r DNA和16S rDNA快3倍[41];2) COI序列比較短, 在650 bp中就有4650個ATGC的可能組合, 一般情況下其序列種間遺傳變異大于種內(nèi)遺傳變異[42]。缺點: 1)COI基因在植物中的進化速率遠慢于在動物中的, 只適用于低等植物中某些藻類的鑒定[43-44]; 2)對通常選擇COI作為DNA條形碼的標記基因的, 因 COI不能含蓋全部物種, 所以有時需要選擇使用其他片段作為輔助標記基因。已有研究者研究證實COI基因作為DNA條形碼能夠準確地區(qū)分紅藻門物種[8-9]。

(2)nrITS

核基因組的核糖體DNA ITS片段廣泛分布于光合真核生物(蔗類植物除外)中, 是系統(tǒng)學(xué)研究中最常用的片段之一。從Baldwin[45]首次把ITS應(yīng)用于植物系統(tǒng)發(fā)育研究以來, ITS已經(jīng)成為系統(tǒng)發(fā)育重建中最受歡迎的序列之一。

ITS的具有如下優(yōu)點: 1)在核基因組中是高度重復(fù)的, 有利于擴增、克隆和測序[46]; (2)經(jīng)過協(xié)同進化,不同 ITS拷貝間的序列接近純合[47], 可對種間關(guān)系進行精確重建。因此Kress等最早將其視為植物條形碼候選片段。組成該片段的不同部分(ITS1、ITS2和5.8S)序列變異差別較大, 5.8S最為保守, ITS1的識別效果好于ITS2[48]。ITS2片段較短, 易于擴增和測序,尤其對發(fā)生DNA降解的材料更為有利[49-50], 該片段在種間水平上變異較大, 已被廣泛用于物種分子鑒定、系統(tǒng)進化和植物條形碼研究[6]。

其缺點: 1)擴增成功率是ITS作為條形碼應(yīng)用的一個限制因素。Kress和Erickson[51]報道, ITS1正確識別率為 81.5%, 但其擴增成功率僅為 60.4%, 因此全部樣品的正確識別率則下降為45.8%。2)長度變異大, 多數(shù)物種擴增片段長度超過1 100 bp。3)存在長的 Poly-G、poly-C和 poly-A, 導(dǎo)致測序和序列分析困難[52]。4)核基因自身存在多拷貝的特性, 在某些類群中種內(nèi)變異較大, 降低了它作為條形碼的應(yīng)用性[51]。已有研究者發(fā)現(xiàn) ITS作為海藻的一些類群的DNA條形碼標記時有較低的成功性[11,37]。

但是, 隨著測序技術(shù)的發(fā)展及數(shù)據(jù)分析技術(shù)的進步, ITS作為組合的條形碼之一, 仍具有很大的應(yīng)用前景。有研究者用包括ITS在內(nèi)的3個基因研究藻類, 發(fā)現(xiàn)用 3個基因片段的組合能夠有效區(qū)分大部分種類[30]。

(3)matK

matK序列是植物葉綠體 DNA中進化較快的一條編碼區(qū)序列, 也是多位研究者推薦的條形碼序列之一[5]。matK基因位于葉綠體賴氨酸 tRNA基因(trnK)的內(nèi)含子中, 長約 1550bp, 編碼一種參與RNA轉(zhuǎn)錄體中II型內(nèi)含子剪切的成熟酶[53], 為單拷貝編碼基因。

matK基因具有如下優(yōu)點: 1)其進化速率大約是rbcL的2～3倍[54]; 2)該基因在系統(tǒng)學(xué)研究方面的應(yīng)用十分普遍[55-58]。缺點: 1)一些學(xué)者發(fā)現(xiàn)在 DNA條形碼研究中, mazK擴增效果并不理想[52,59]; 2)matK片段的引物通用性較差, 鑒定不同類群時往往需要設(shè)計不同的引物[60-61]。因此, 只有在解決了matK序列的擴增問題, 才有可能作為 DNA條形碼使用。Sanders等在分析輪藻科6個屬的藻類時, 發(fā)現(xiàn)matK基因能夠鑒定的輪藻科平均分枝長度超過rbcL基因的5倍, 更適合輪藻科的分類鑒定[62]。目前,matK基因在大型海藻物種鑒定方面的應(yīng)用研究報道較少。

(4)trnH-psbA

trnH-psbA片段是葉綠體基因中進化速率最快的片段之一[63]。其優(yōu)點是1)其序列兩端具有約75bp的保守區(qū), 便于設(shè)計通用引物[64]; 2)trnH-psbA序列已經(jīng)在很多植物中擴增成功, 且有很好的鑒別能力[59];3)92%的物種擴增片段長度為 340～660bp, 且均具有獨特的間隔區(qū)序列, 符合理想的條形碼標準[6]。其缺點是: 1)該片段中普遍存在插入/缺失事件, 即使在近緣種間也是如此[65], 導(dǎo)致不同物種間片段長度變異較大; 2)該片段具有較高的突變率和簡單的序列重復(fù)和重排, 在進行序列分析時需要人工校正[60], 從而限制了在系統(tǒng)發(fā)育研究中的應(yīng)用。由于插入/缺失過多, 導(dǎo)致trnH-psbA在不同屬物種間的比對困難[6,66]。然而, 比對的難易不是條形碼必需的條件,只要建立了適合的條形碼數(shù)據(jù)分析方法, 插入/缺失還將會豐富物種識別信息[6]。由于trnH-psbA變異大,主要適用于被子植物中物種豐富的屬。目前, 很少有研究報道trnH-psbA在大型海藻物種鑒定方面的應(yīng)用。

(5)rbcL

rbcL基因為核酮糖-1, 5-二磷酸羧化/加氧酶(Rubisco)的大亞基, 長度約為1 400 bP, 無內(nèi)含子。

rbcL具有如下優(yōu)點: 1)在大部分植物中,rbcL片段都比較容易擴增和測序, 已有許多相關(guān)報道[67-69];2)目前,rbcL基因已廣泛應(yīng)用于被子植物科級以上較高類群之間的系統(tǒng)發(fā)育分析[70]; 3)rbcL序列具有通用、易擴增、易比對的特點, 被提議作為條形碼片段,可以用作核心片段將某些未知樣品識別到種級以上水平; 4)通過使用GenBank中大約10 300條長度大于1 000 bp的rbcL序列進行比較分析, Newmaster等發(fā)現(xiàn)盡管rbcL不能識別全部物種, 但可以區(qū)分不少同屬植物。缺點: (1)由于Rubisco在光合作用及光呼吸中所起的關(guān)鍵作用,rbcL基因的進化明顯受功能限制, 它的編碼序列高度保守。2)植物中rbcL片段的變異主要存在于種級以上水平, 物種水平的變異通常不夠[51-52,59,66]。因此, 有人建議將rbcL與其他DNA基因片段組合使用[71]。但存在的問題是,rbcL的整體長度較長(至少1 300 bp), 需要使用4個引物并進行雙向測序才能完成整個基因的測序[6], 而理想的條形碼要求片段長度較短, 因此有些研究僅選取其中一段進行擴增, 如rbcL-a[71]。Kucera 在 2010年對rbcL、UPA及ITS等片段進行了評估, 發(fā)現(xiàn)rbcL-3P在若干隱存種類(由于在長期的進化過程中其形態(tài)停滯, 從而使其根據(jù)形態(tài)特征被命名為同一種名的不同種)中作用很顯著, 能夠很好地區(qū)分石莼屬的種類。還有一些研究者已證明了rbcL在鑒定一些大型海藻方面的效果[14,19]。

(6)UPA片段

UPA片段非常適合于藻類的研究, 同時也可作為陸地植物的組合條形碼之一[3]。有研究者提議將UPA片段作為光合作用植物的DNA條形碼, 已有研究表明 UPA片段在海藻中存在一定的變異, 但在陸地植物中變異率很低[52,72-73]。Kucera 在2010年利用COI-5P作為 DNA條形碼對加拿大紅藻門紫菜品種進行鑒定時, 通過與rbcL及UPA進行了比較, 從而發(fā)現(xiàn)了兩個新種。姚雪等[27]發(fā)現(xiàn) COI、UPA、rbcL三種基因片段引物具有較高的通用性, 在三個門類28種海藻的 38份樣品中獲得有效基因序列為65%～82%, 顯示出這三個基因片段具有一定的通用性價值。有研究者分析了紅藻門多個類群的樣品, 發(fā)現(xiàn)其UPA基因片段能夠較好的辨別物種[33,36]。

(7)多片段組合

如上所述, 在植物中, 采用單片段的識別率一般不高, 往往不能達到條形碼的要求[52,59,71-72], 靠一個片段來區(qū)分雜交種或存在基因滲透的類群也存在問題[67]。因此, 很有必要把來源于不同基因組的片段加以組合。任保青等[74]認為: 在整個植物界, 若想用1個基因或1個短的DNA片段來區(qū)別所有物種幾乎是不可能的, 但是可以通過 1個條形碼組合在基因組范圍內(nèi)實現(xiàn)階層條形碼, 進而逐級縮小鑒定范圍,最終達到物種自動鑒定的目的。多序列組合方案為植物DNA條形碼的研究指出了一個新的方向, 但根據(jù)現(xiàn)有的研究結(jié)果篩選出的片段并不能完全滿足DNA條形碼的標準, 仍需要大量的實驗去驗證它們的物種識別和鑒定能力。目前, 多序列組合在大型海藻方面也有很廣闊的應(yīng)用前景[31]。

3 DNA條形碼技術(shù)在海藻學(xué)的應(yīng)用前景及存在的問題

眾所周知, 大型海藻因其生長環(huán)境、發(fā)育階段的不同, 外部形態(tài)經(jīng)常發(fā)生很大的變化, 這就給主要依據(jù)形態(tài)特征來鑒別物種的經(jīng)典分類工作帶來很大困難。某些藻類的分類結(jié)果一直存在爭議。與此同時尚存在大量未命名海藻種類, 已命名的物種也存在同物異名和異物同名現(xiàn)象。新興的DNA條形碼技術(shù)能夠?qū)ξ覈笮秃Ｔ暹M行高效鑒定和分類, 進而加速新物種的發(fā)掘。目前, 利用DNA條形碼技術(shù)對我國大型海藻進行物種鑒定和分類的報道還較少。隨著DNA條形碼的廣泛應(yīng)用, 整個技術(shù)體系日趨完善, 其在我國大型海藻分類鑒定方面將有廣闊的應(yīng)用前景。

需要強調(diào)的是, DNA條形碼技術(shù)的使用不能完全脫離經(jīng)典的分類學(xué)研究方法, 尤其是未知或尚未界定的物種的分類鑒定工作[75]。

DNA條形碼技術(shù)在應(yīng)用時仍然存在一些問題。在整個基因組中, 有大量的基因序列能夠滿足我們一個或多個要求。作為DNA條形碼技術(shù)的標準基因,必須一方面足夠保守(其引物有強的保守性, 能夠進行大范圍的物種擴 増 ), 另一方面有足夠的變異來區(qū)分不同物種從而達到鑒定的目的, 但是理論上不存在一種普遍適用的DNA條形碼基因。任何一個基因都不可能在各種生物中都保守, 同時又包含足夠的序列變異信息來進行物種的辨別。因此, 在鑒定不同的物種時, 需要確定不同的目的基因。另外, 植物的線粒體DNA因雜交和基因滲入而變異很小, 真菌線粒體DNA含有內(nèi)含子。對這些特殊類群的標準條形碼基因的選擇還有待進一步探討。另外物種間雜交造成了在種的水平上有較大的差異, 不同物種同一片段的進化速率不同, 同時受制于取樣數(shù)量以及地理群體代表性等, 都可能導(dǎo)致種間遺傳差異的增大。這使得在藻類中建立類似于動物的 COI基因片段DNA條形碼技術(shù)成為一項艱巨的任務(wù)。但是, 隨著條形碼序列數(shù)據(jù)的不斷積累及其研究范圍的不斷擴大, 條形碼技術(shù)將逐漸實現(xiàn)與世界范圍內(nèi)其他分類學(xué)研究計劃的協(xié)調(diào)發(fā)展, 作為一種物種鑒定工具,勢必在生物系統(tǒng)學(xué)和分類學(xué)研究中得到廣泛應(yīng)用。

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