M3受體激動(dòng)劑膽堿對(duì)大鼠心肌細(xì)胞內(nèi)鈣離子的影響

欒海蓉，李海林，何志鵬，吳 紅

(牡丹江醫(yī)學(xué)院機(jī)能學(xué)教研室，黑龍江省高校腫瘤疾病防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江牡丹江157011)

心臟M3受體具有重要的生理功能和病理意義，在充血性心力衰竭、缺血性心律失常等疾病的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用［1］。近期研究表明，激動(dòng)M3受體對(duì)心肌缺血及H2O2誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡有保護(hù)作用，可以減少離體細(xì)胞中烏頭堿和毒毛花苷誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)鈣超載，對(duì)烏頭堿和氯化鋇誘發(fā) Wistar大鼠心律失常的發(fā)生和發(fā)展具有保護(hù)作用［2-4］。

激動(dòng)M3受體可以介導(dǎo)IKM3電流，使鉀離子通道開(kāi)放，促進(jìn)鉀離子外流，引起心肌細(xì)胞膜的超極化，縮短動(dòng)作電位時(shí)程，導(dǎo)致Ⅱ期平臺(tái)期縮短，間接使鈣離子內(nèi)流減少，心肌細(xì)胞［Ca2+］i降低。M3受體還可以通過(guò)Gq/11激活磷脂酶 C，使膜結(jié)合的二磷酸磷脂酰肌醇(PIP2)水解為三磷酸肌醇(inositol triphosphate，IP3)和二酰甘油，兩者作為細(xì)胞內(nèi)第二信使，均可以使心肌細(xì)胞［Ca2+］i增加。以上兩個(gè)通路作用結(jié)果使細(xì)胞內(nèi)鈣變化截然相反，因此，該研究采用激光掃描共聚焦顯微鏡技術(shù)，分別利用高鉀激活細(xì)胞膜電壓依賴(lài)性鈣通道，引起外鈣的內(nèi)流，以及咖啡因和IP3激活心肌細(xì)胞內(nèi)“鈣池”內(nèi)質(zhì)網(wǎng)/肌漿網(wǎng)引起細(xì)胞內(nèi)鈣的釋放，觀察M3受體激動(dòng)劑膽堿對(duì)心肌細(xì)胞胞質(zhì)游離鈣離子濃度的影響，探討其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康成年Wistar大鼠，雌雄兼用，體質(zhì)量250～300 g，由哈爾濱醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2 藥品和儀器 4-羥乙基哌嗪乙磺酸［4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid，HEPES］，乙二醇-雙-(2-氨基乙醚)四乙酸［ethylene glycol bis(2-aminoethyl)tetraacetic acid，EGTA］，Na2-ATP，小牛血白蛋白(BSA)，膠原酶Ⅱ，實(shí)驗(yàn)藥物膽堿和4-DAMP(4-diphenylacetoxy-N-methylpiperidine-methiodide)等購(gòu)自 Sigma公司;Fluo-3/AM，F(xiàn)-127等購(gòu)自Invitrogen公司，日本Olympus FV-300激光掃描共聚焦顯微鏡。

1.3 溶液配制 包括［5］臺(tái)氏液:NaCl 126 mmol/L，KCl 5.4 mmol/L，HEPES 10 mmol/L，NaH2PO40.33 mmol/L，MgCl2110 mmol/L，CaCl21.8 mmol/L，Glucose 10 mmol/L，用NaOH調(diào)pH至7.35。無(wú)鈣臺(tái)氏液除沒(méi)有CaCl2之外，其余成分與臺(tái)氏液相同。細(xì)胞保存液(KB液):Glutamic acid 70 mmol/L，Taurin 15 mmol/L，KCl 30 mmol/L，HEPES 10 mmol/L，KH2PO410 mmol/L，MgCl20.5 mmol/L，EGTA 0.5 mmol/L，Glucose 10 mmol/L，用 KOH 調(diào) pH 為7.3～7.4。

1.4 大鼠單個(gè)心室肌細(xì)胞的制備 將大鼠撞擊頭部致昏，仰臥位固定于鼠臺(tái)上，迅速開(kāi)胸取出心臟，置于4℃臺(tái)氏液中，游離主動(dòng)脈并逆行插管連接于Langendorff灌流裝置上，臺(tái)氏液8 mL/min流速連續(xù)灌流約5 min，洗去心臟殘血，然后用無(wú)鈣臺(tái)氏液灌流約10 min至心臟停搏后，用含0.02%膠原酶Ⅱ的無(wú)鈣臺(tái)氏液灌流分離豚鼠單個(gè)心室肌細(xì)胞，消化約10 min后自左心室分段剪取心室肌組織，置于盛有KB液的試管中，用吸管輕輕吹打，使之分散成單個(gè)細(xì)胞，棄除大塊組織，置于 4℃冰箱穩(wěn)定1 h待用［6-7］。

1.5 熒光染料的配制與細(xì)胞染色 取穩(wěn)定好的細(xì)胞，用20 μmol/L的Fluo-3/AM染色，在37℃恒溫水浴中孵育45 min，去除負(fù)載液后，用正常臺(tái)氏液再洗滌1次，最后將細(xì)胞用正常臺(tái)氏液稀釋到所需濃度。取染好色的細(xì)胞置于浴槽中，靜置貼壁5 min后用于實(shí)驗(yàn)，光鏡下選取桿狀、橫紋清晰無(wú)顆粒的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)［8］。細(xì)胞內(nèi)鈣的增加以熒光強(qiáng)度(fluorescence intensity，F(xiàn)I)升高表示。

1.6 細(xì)胞內(nèi)鈣離子(［Ca2+］i)變化的檢測(cè) 在Time seriesXYT模式下掃描記錄心?。跜a2+］i，激發(fā)波長(zhǎng)為488 nm，掃描時(shí)間程序設(shè)定為每10秒采集一次數(shù)據(jù)，連續(xù)采集30次?；A(chǔ)熒光值按最小噪聲最大圖像信號(hào)設(shè)定，預(yù)掃描獲得基礎(chǔ)值后于第2次和第3次掃描間隙之間加入終濃度為30.0 mmol/L KCl，平均熒光強(qiáng)度以給藥后與給藥前的熒光強(qiáng)度比值(FI/FI0)表示。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 圖像分析時(shí)，細(xì)胞內(nèi)基礎(chǔ)鈣FI定為1.0，加藥后鈣FI的變化為其相對(duì)值，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用方差分析，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 膽堿對(duì)靜息狀態(tài)下大鼠心肌細(xì)胞內(nèi)鈣熒光強(qiáng)度的作用 在正常臺(tái)氏液(含Ca2+1.8 mmol/L)加入膽堿5.0 mmol/L 和 4-DAMP 2.0 nmol/L，對(duì)照組加相同體積0.9%的生理鹽水，鈣Fmax/FI0無(wú)明顯改變(表1)。

表1 膽堿對(duì)靜息狀態(tài)下心肌細(xì)胞鈣熒光強(qiáng)度的影響

2.2 膽堿對(duì)咖啡因介導(dǎo)Rynaodine受體激動(dòng)所致大鼠心肌細(xì)胞內(nèi)“鈣池”Ca2+釋放的影響 在無(wú)鈣臺(tái)氏液(含 EGTA 2.0 mmol/L)中，加入終濃度10.0 mmol/L的咖啡因可使細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度比值(FI/FI0)增加(2.53±0.24)倍(峰值處)(n=20，與靜息值相比，P＜0.01)。10.0 mmol/L Rynaodine受體的拮抗劑普魯卡因(procaine)孵育心肌細(xì)胞15 min，可以抑制咖啡因誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞內(nèi)鈣FI/FI0的增強(qiáng)。5.0 mmol/L膽堿預(yù)先孵育細(xì)胞15 min后再用咖啡因激動(dòng)，內(nèi)鈣升高倍數(shù)無(wú)明顯改變(表2)。

10.0mmol/L咖啡因使得心肌細(xì)胞內(nèi)FI/FI0增高達(dá)到峰值后，加入5.0 mmol/L膽堿不能使FI/FI0降低(圖1)。

表2 膽堿對(duì)咖啡因誘導(dǎo)心肌細(xì)胞內(nèi)鈣釋放鈣熒光強(qiáng)度的影響

圖1 choline對(duì)Caeffni和IP3誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)鈣釋放的影響

2.3 膽堿對(duì)IP3介導(dǎo)IP3受體激動(dòng)所致大鼠心肌細(xì)胞內(nèi)“鈣池”Ca2+釋放的影響 在無(wú)鈣臺(tái)式液中，加入終濃度10.0 mmol/L IP3使細(xì)胞FI/FI0增加(1.81±0.24)倍(n=20，與靜息值相比，P ＜0.01)。測(cè)定前預(yù)先用IP3受體的拮抗劑肝素(heparin)孵育心肌細(xì)胞15 min，肝素可以抑制IP3誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞內(nèi)鈣FI/FI0的增強(qiáng)。5.0 mmol/L膽堿預(yù)先孵育細(xì)胞15 min后，不能抑制IP3誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)鈣熒光強(qiáng)度的增強(qiáng)(表3)。

10.0mmol/L IP3使得心肌細(xì)胞內(nèi)FI/FI0增高達(dá)到峰值后，加入5.0 mmol/L膽堿不能使FI/FI0降低(圖1)。

表3 膽堿對(duì)IP3誘導(dǎo)心肌細(xì)胞內(nèi)鈣釋放鈣熒光強(qiáng)度的影響

2.4 膽堿對(duì)KCI誘導(dǎo)大鼠心肌細(xì)胞內(nèi)鈣熒光強(qiáng)度增高(外鈣內(nèi)流)的影響 在正常臺(tái)氏液(含1.8 mmol/L Ca2+)中加入30 mmol/L KCl后，［Ca2+］i逐漸升高，F(xiàn)I/FI0增加(2.62 ±0.11)倍(n=20，與靜息值相比，P ＜0.01)。10.0 μmol/L 鈣拮抗劑維拉帕米(verapamil)孵育心肌細(xì)胞15 min，可以抑制KCl心肌細(xì)胞內(nèi)鈣FI/FI0的增強(qiáng)。當(dāng)細(xì)胞用5.0 mmol/L膽堿預(yù)孵15 min后加入KCl，可以明顯降低鈣FI/FI0至(1.42 ±0.13)倍(n=30，與 KCl相比，P ＜0.01)。而細(xì)胞用5.0 mmol/L膽堿與2.0 nmol/L 4-DAMP共同預(yù)孵 15 min后加入 KCl，F(xiàn)I/FI0恢復(fù)至(2.24±0.12)倍(n=30，與膽堿相比，P ＜0.01)(圖 2A)。30.0 mmol/L KCl使得心肌細(xì)胞內(nèi)FI/FI0增高達(dá)到峰值后，加入5.0 mmol/L膽堿可使FI/FI0明顯降低(圖2B)。

圖2 膽堿對(duì)KCI誘導(dǎo)大鼠心肌細(xì)胞外鈣內(nèi)流的影響

3 討論

Ca2+在生命活動(dòng)中起著至關(guān)重要的作用，是影響或決定許多細(xì)胞反應(yīng)和活性的第二信使。細(xì)胞內(nèi)Ca2+的調(diào)節(jié)主要包括兩方面:跨膜鈣轉(zhuǎn)運(yùn)和胞內(nèi)鈣池的調(diào)節(jié)?？缒も}轉(zhuǎn)運(yùn)包括質(zhì)膜鈣通道、質(zhì)膜鈣泵和Na+/Ca2+交換。胞內(nèi)鈣池的調(diào)節(jié)則包括胞內(nèi)鈣池Ca2+-ATP酶、胞內(nèi)鈣池鈣結(jié)合蛋白、胞內(nèi)鈣池受體鈣通道的調(diào)節(jié)。其中，通過(guò)心肌細(xì)胞膜電壓依賴(lài)性L(fǎng)-鈣離子通道的“外鈣內(nèi)流”和心肌細(xì)胞內(nèi)鈣釋放通道IP3R和RyR介導(dǎo)的“內(nèi)鈣釋放”在調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子的穩(wěn)定水平發(fā)揮著最重要的作用［9］。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，M3受體激動(dòng)劑膽堿對(duì)靜息狀態(tài)下的細(xì)胞內(nèi)鈣的濃度無(wú)影響，說(shuō)明膽堿不參與自發(fā)的外鈣內(nèi)流和內(nèi)鈣釋放，不影響靜息狀態(tài)下的心肌細(xì)胞對(duì)鈣離子的調(diào)節(jié)。

細(xì)胞內(nèi)鈣池貯存鈣的釋放主要是由Ryanodine受體系統(tǒng)和IP3受體系統(tǒng)介導(dǎo)，它們均是受體依賴(lài)性鈣通道。本實(shí)驗(yàn)采用咖啡因激動(dòng)心肌細(xì)胞Ryanodine受體和IP3激動(dòng)IP3受體，從而引起心肌細(xì)胞［Ca2+］i的增加。結(jié)果表明，不論是前給藥還是后給藥，膽堿均不能拮抗咖啡因和IP3介導(dǎo)胞內(nèi)鈣熒光強(qiáng)度的升高，表明膽堿對(duì)心肌細(xì)胞內(nèi)鈣池內(nèi)儲(chǔ)鈣的釋放沒(méi)有影響。

本實(shí)驗(yàn)中，采用30.0 mmol/L KCl誘導(dǎo)心肌細(xì)胞膜上的電壓依賴(lài)性鈣通道被激活，L-型鈣通道開(kāi)放，外鈣內(nèi)流，使得［Ca2+］i明顯升高。分別采用膽堿孵育細(xì)胞預(yù)先給藥，和先用KCl增高［Ca2+］i然后加入膽堿后給藥兩種方式，結(jié)果表明膽堿均可以拮抗KCl誘導(dǎo)心肌細(xì)胞外鈣內(nèi)流的作用，說(shuō)明膽堿可以阻斷細(xì)胞膜L-型鈣通道，從而減少鈣內(nèi)流。4-DAMP是M3受體特異性阻斷劑［10］，2.0 nmol/L 4-DAMP 能恢復(fù) 5.0 mmol/L膽堿抑制的KCl除極誘導(dǎo)的心?。跜a2+］i升高，提示該作用可由M3受體調(diào)節(jié)。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，雖然M3受體介導(dǎo)的“IKM3”通路和“Gq/11”通路對(duì)細(xì)胞內(nèi)鈣離子作用相反，但實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，M3受體激動(dòng)劑膽堿可以通過(guò)阻斷細(xì)胞膜L-型鈣通道，從而減少鈣內(nèi)流，降低心肌細(xì)胞內(nèi)總鈣濃度，抑制鈣超載，從而對(duì)缺血性心肌發(fā)揮保護(hù)作用。

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