楊海青，朱劍梅，邱發(fā)麒，鄧成蓮，何英，游傳蓉

(四川省醫(yī)學科學院·四川省人民醫(yī)院城東病區(qū)內(nèi)一科，四川 成都 610101)

人巨細胞病毒(human cytomegalovirus，HCMV)屬皰疹病毒科，是一種常見的機會性感染病原體，在成人中的感染率可達90%，其中絕大部分為“健康帶毒狀態(tài)”，即血清中可檢測到抗HCMV-IgG陽性，但無相關病毒疾病癥狀出現(xiàn)［1］。初始感染后，病毒基因組進入單核細胞并潛伏。免疫機能低下的狀態(tài)時，如獲得性免疫缺陷綜合征(AIDS)和器官移植后使用免疫抑制劑的患者，HCMV可再次活化并導致嚴重的CMV疾病。

HCMV在體內(nèi)可感染多種細胞，包括成纖維細胞、內(nèi)皮/上皮細胞、平滑肌細胞、單核/巨噬細胞、中性粒細胞，但只能在少數(shù)細胞內(nèi)成功復制并產(chǎn)生有感染力的病毒，包括單核/巨噬細胞、成纖維細胞及內(nèi)皮細胞［2］。感染過程是衣殼蛋白參與病毒與細胞膜的融合，使病毒核衣殼進入胞漿，DNA-蛋白質(zhì)復合物進入核孔［3］。正常狀態(tài)下，病毒基因組整合于細胞基因組內(nèi)并隨細胞DNA復制，形成長期潛伏感染狀態(tài)。在免疫低下狀態(tài)時，病毒DNA復制并在細胞內(nèi)裝配成成熟的病毒顆粒，通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)運輸?shù)郊毎砻?，釋放到細胞外。在HCMV感染宿主細胞中，衣殼蛋白B(glycoproteinB，gB)起重要作用，可與細胞膜融合，并與衣殼蛋白gH、gL形成三聚體，還與細胞膜表面手體(整聯(lián)蛋白α2β1、α6β1和αVβ3)結(jié)合，完成感染［4］。

本研究選用人間充質(zhì)干細胞(human marrow stromal cell，HMSC)、人胚成肌細胞(humanembryomyoblasts，HEM)、人皮膚成纖維細胞(human demal fibroblasts，HDF)，檢測其對HCMV的易感性，并通過Western-blot的方法檢測感染后蛋白質(zhì)的表達情況。

1 材料與方法

1.1 病毒珠及細胞培養(yǎng) HCMV病毒珠購自ATCC(VR-807)。所使用的人源細胞為 HMSC、HEM、HDF，用DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)(含10%新生小牛血清、2 mM谷維酸、1 mM丙酮酸鈉、100 U/ml青霉素及鏈霉素)，所有細胞2～3天換液一次。

1.2 HCMV感染靶細胞 HCMV病毒上清由MRC-5細胞產(chǎn)生。為去除細胞碎片，將上清離心(3000 rbm，30 min)，將HMSC、HEM和HDF按1× 106/瓶接種;第二天接病毒上清接種細胞，感染2小時后用無血清DMEM洗細胞兩次，加入完全培養(yǎng)基培養(yǎng)。

1.3 蛋白質(zhì)提取 在感染后3、7、10天收集感染后的細胞及對照細胞，計數(shù)后離心(1500 rpm，5 min);用PBS洗細胞一次(1500 rpm，5 min);將離心后的細胞放置冰上，并配置蛋白質(zhì)裂解緩沖液(500 μl RIPA，0.5 μl PMSF和1/2片蛋白酶抑制劑)，并混勻;按10 μl/L million加入裂解緩沖液，渦旋混均后放置冰上15 min，且每5 min渦旋混均一次;離心沉淀(14000 rpm，15 prm，4℃);收集上清并用牛血清白蛋白測定蛋白質(zhì)濃度后儲存-80℃。

1.4 蛋白質(zhì)印跡

1.4.1 電泳 將一次性SDS-PAGE凝膠放于電泳槽中;每孔加入20 μg提取的蛋白質(zhì)，加入4 μl 4×l aemmli緩沖液，并用RIPA緩沖液補齊體積至20 μl;100℃或沸水浴加熱3～5分鐘，以充分變性蛋白。為了便于觀察電泳效果和轉(zhuǎn)膜效果，以及判斷蛋白分量分子量大小，還加入預染蛋白質(zhì)分子量標準(Marker);用1×Tris-glycine-SDS電泳液加滿電泳槽后電泳(80 V，2.5 h)。

1.4.2 轉(zhuǎn)膜 將準備好的醋酸纖維素膜預先浸泡于轉(zhuǎn)膜緩沖液中(包括100 ml 10×TBS緩沖液，200 ml甲醇，700 ml水);將電泳好的凝膠放于醋酸纖維素膜上后有轉(zhuǎn)膜(300 mA，2 h);轉(zhuǎn)膜完成后用麗春紅或考馬斯亮藍染色，以觀察轉(zhuǎn)膜效果。

1.4.3 封閉 轉(zhuǎn)膜完成后，加入100 ml TBST封閉液(含5%脫脂奶粉和1%牛血清白蛋白)，4℃震蕩過夜。

1.4.4 抗體孵育 封閉完成后，用蛋白質(zhì)洗滌緩沖液1×TBST(含5%Tween-20)洗3次(5 min/次)后加入用封閉緩沖液的一抗(鼠抗人CMVpp65單克隆抗體，Millipore，5097R);4℃震蕩過夜。用100 ml蛋白質(zhì)洗滌緩沖液1×TBST(含5%Tween-20)洗膜5次，5 min/次;按1︰2000加入二抗(辣根過氧化物酶標免抗鼠IgG)，室溫震蕩1 h;100 ml洗滌緩沖液洗膜5次，5 min/次。

1.4.5 顯色 用ECL化學發(fā)光試劑盒，將試劑1和2按1︰1混合，室溫下顯色5 min后進入暗室曝光(曝光時間分別為:30 s和1、2、3、5 min，以尋找最佳曝光時間)。

2 結(jié)果

HCMV感染人源靶細胞3天后，已可以檢測到CMV特異性蛋白質(zhì)。在HEM的檢測中，觀察到在感染后第3、7、10及14天，CMV-pp65的表達是沒有變化的(圖1)。人胚軟骨的檢測中，感染后第3天可檢測到較強的CMV蛋白質(zhì)表達;但在感染后第7天，發(fā)現(xiàn)CMV表達已下降到無法檢測到的水平;感染后第10天和第14天，又重新檢測到CMV-PP65高表達，并且表達強度超過第3天，表明在感染后兩周，CMV在人胚軟骨中的表達更高(圖2)。在HMSC的感染檢測中，發(fā)現(xiàn)在感染后第7、10、14天的CMV-pp65蛋白質(zhì)表達水平相當，而且均高于感染后的第3天，同時發(fā)現(xiàn)出現(xiàn)另外一條蛋白質(zhì)帶，其原因可能是由于抗體的非特異結(jié)合，或者該細胞在表達中表現(xiàn)另外一個CMV-PP65蛋白質(zhì)亞型，具體原因需通過進一步實驗室驗證。

本實驗中，為避免蛋白質(zhì)總量不一致所造成的誤差，特采用β-actin為內(nèi)參照，結(jié)果表明所加入的蛋白質(zhì)無顯著差異。

圖1 CMV感染人胚成肌細胞后的蛋白質(zhì)表達檢測N-陰性對照(未感染的人胚成肌細胞)

圖2 CMV感染人胚軟骨細胞后的蛋白質(zhì)表達檢測N-陰性對照(未感染的人胚軟骨細胞)

圖3 CMV感染人間充質(zhì)干細胞后的蛋白質(zhì)表達檢測N-陰性對照(未感染的人間充質(zhì)干細胞)

3 討論

迄今為止對人類健康造成危害的病原體中，HCMV感染占重要地位。CMV具有典型的皰疹病毒形態(tài)，其DNA結(jié)構(gòu)也與HSV相似，但比HSV大5%［5］。CMV對宿主或培養(yǎng)細胞有高度的種特異性。HCMV可用人胚肌皮、肺、睪丸等的成纖維細胞分離或培養(yǎng)細胞。一般認為只有分化細胞才是CMV的容許細胞，未分化或者轉(zhuǎn)化細胞是非容許細胞，在非容許細胞中，病毒基因不表達［6］。

HCMV初始感染宿主后，病毒基因組進入單核細胞并潛伏。應用敏感的PCR技術可在健康攜帶者的外周血單核細胞中檢測到病毒DNA，提示單核細胞為病毒持續(xù)存在的位點之一。HCMV與單核細胞、巨噬細胞和組織細胞的相互作用可能是引起病毒持續(xù)和潛伏感染的主要原因(醫(yī)學分子病毒學)。近年大量的實驗結(jié)果證實，HCMV的致病機理為誘細胞周期蛋白和細胞周期相關激酶的高水平表達，刺激細胞的有絲分裂，從而誘導原癌基因的表達或表達增高，以這種方式干擾細胞的調(diào)控機制尤其是干擾細胞增生、分化的調(diào)控，使細胞惡性變;同時HCMV感染的細胞中，腫瘤抑制蛋白p53蓄積增加，HCMV IE2能與其結(jié)合并抑制報告基因的轉(zhuǎn)錄，IE2蛋白還能結(jié)合另一個與細胞周期調(diào)控有關的腫瘤抑制蛋白PRB，因此HCMV感染既損傷了抗癌基因產(chǎn)物的功能，又刺激了原癌基因的過度表達，直接參與了細胞的惡性變過程［7，8］。

在本研究采用三種未轉(zhuǎn)化的人源原代細胞，包括HMSC、HEM和人胚軟骨細胞，研究CMV是否會感染這三種原代細胞，以及感染后不同時間病毒蛋白質(zhì)的表達情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CMV可成功感染這3種原代細胞，并在感染后不同時間段均表達病毒蛋白，表明CMV在這3種細胞中處于活化狀態(tài)。但CMV對這3種細胞的致病情況仍待研究。

［1］Wei Wang，Ping Yu，Peng Zhang，et al.The infection of human primary cells and cell lines by human cytomegalovirus:new tropism and new reservoirs for HCMV［J］.Virus research，2008，131:160-169.

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［5］金奇.醫(yī)學分子病毒學［M］.北京:科學出版社，2001.

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