人胚胎干細胞傳代培養(yǎng)及細胞化學(xué)染色特性

胡嘉波 胡三強 麻全慧 周中衛(wèi) 王曉慧 張 微

（江蘇大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院，鎮(zhèn)江212013； 1江蘇省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院檢驗科，南京210028）

人胚胎干細胞（human embryonic stem cells，hESC）一般是來自人胚胎囊胚內(nèi)細胞團的一種全能性干細胞，可以在體外無限傳代并保持正常的二倍體核型和多向分化潛能［1－3］。hESC經(jīng)過誘導(dǎo)可分化成為特定組織細胞，可以潛在用于臨床疾病的細胞替代治療［4－7］。hESC在體外極易分化，必須在培養(yǎng)基中加入分化抑制因子或?qū)⑵渑囵B(yǎng)在能分泌分化抑制因子的飼養(yǎng)層中［8－9］。小鼠胚胎成纖維細胞（mouse embryonic fibroblasts，MEF）分泌多種細胞因子促進hESC的自我更新，并且抑制hESC的分化［10－11］。目前實驗室還仍在探索胚胎干細胞的檢測方法，細胞化學(xué)染色是常用的組織、細胞鑒定方法，除了堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）染色，其他細胞化學(xué)染色技術(shù)用于研究hESC的報道較少，我們試建立hESC傳代培養(yǎng)方法，觀察hESC及其分化過程中的細胞化學(xué)染色特性，為進一步研究hESC奠定基礎(chǔ)。

材料和方法

1.材 料

1.1 hESC系

SHhES2［12］由中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院／上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院健康科學(xué)研究所（IHS）金穎博士提供。

1.2 主要試劑

Knockout DMEM、Knockout serum replacement（Knockout SR）、非必需氨基酸、L-谷氨酰胺、重組人堿性成纖維細胞生長因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）為invitrogen公司產(chǎn)品，明膠、β－巰基乙醇、Ⅳ型膠原酶為sigma公司產(chǎn)品，絲裂霉素為Roche公司產(chǎn)品，堿性磷酸酶、過碘酸－雪夫反應(yīng)（periodic acid-Schiff reaction，PAS）、α－醋酸萘酚酯酶（α-naphthol acetate esterase，α-NAE）、過氧化物酶（peroxidase，POX）染色試劑盒為上海太陽生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。

1.3 0.1%明膠

稱取0.1g明膠粉末，加入100ml雙蒸水配成0.1%的明膠溶液。高壓121℃，30min，明膠全部溶解，室溫保存。

1.4 1g／L Ⅳ型膠原酶

稱取100mgⅣ型膠原酶粉末，溶解到100ml的Knockout DMEM 中，0.22μm濾器過濾除菌。

1.5 絲裂霉素C配制

儲存液：2mg絲裂霉素C加10ml PBS，配制成0.2mg／ml的儲存液，0.22μm 濾器過濾除菌，錫箔紙包裹，避光，4℃保存。應(yīng)用液：吸取0.125ml儲存液，加 2.375ml Knockout DMEM（內(nèi) 含 10%FBS），混勻，配成濃度為10mg／L的應(yīng)用液。

1.6 hESC培養(yǎng)液配制

80%knockout DMEM，20%knockout SR，1 mmol／L L-谷氨酰胺，0.1mmol／Lβ－巰基乙醇，0.1 mmol／L非必需氨基酸，4μg／L bFGF。

1.7 擬胚體培養(yǎng)液配制

不含bFGF的hESC培養(yǎng)液。

2.實 驗方法

2.1 hESC飼養(yǎng)層制備

MEF制備見文獻［13］，P2-P3代 MEF長到鋪滿瓶底80%-90%時，棄培養(yǎng)液，加入含10mg／L絲裂霉素C的培養(yǎng)液，在37℃孵箱培養(yǎng)2h后，用PBS蕩洗5次，每次2min，0.25%胰蛋白酶消化，800r／min，離心5min。MEF培養(yǎng)液重懸，充池計數(shù)，以7×105個細胞／瓶種到0.1%明膠處理的T25培養(yǎng)瓶中，5%CO2，37℃，飽和濕度培養(yǎng)。24h后，棄MEF培養(yǎng)液，加入適量的hESC培養(yǎng)液，放入孵箱，使MEF適應(yīng)，備用。

2.2 hESC傳代培養(yǎng)

傳代hESC棄培養(yǎng)液，加入適量1g／LⅣ型膠原酶，置37℃孵箱，鏡下觀察，見克隆邊緣卷曲時，棄膠原酶，加入hESC培養(yǎng)液輕輕吹打，800r／min，離心3min，hESC培養(yǎng)液重懸，用滴管輕輕吹打，將hESC團吹打成適當(dāng)大小的團塊，取出飼養(yǎng)層細胞，棄培養(yǎng)液，將已吹打成小團塊的hESC按適當(dāng)密度接種于已準(zhǔn)備好的飼養(yǎng)層細胞上，48h后每日換液，少部分hESC發(fā)生自發(fā)分化，4-5d傳代。

2.3 Giemsa染色

棄hESC培養(yǎng)液，用PBS洗兩次，自然晾干，加甲醇固定約1min，晾干，用Giemsa染色液染色15min，水洗待干。

2.4 擬胚體形成

正常傳代培養(yǎng)的hESC培養(yǎng)5-6d，加入1g／LⅣ型膠原酶37℃消化，當(dāng)克隆完全脫壁時，收集細胞團塊，用擬胚體培養(yǎng)液重懸，種到細菌培養(yǎng)皿懸浮培養(yǎng)，每2d換液一次。

2.5 細胞化學(xué)染色

取狀態(tài)良好的hESC、自發(fā)分化克隆及擬胚體進行 ALP、PAS、α-NAE、POX染色，具體操作按試劑盒說明書進行，所有染色均未復(fù)染。

結(jié) 果

1.h ESC培養(yǎng)及形態(tài)

hESC在MEF上生長狀態(tài)良好，呈巢狀生長，排列緊密，直徑300-800μm不等，培養(yǎng)4-5d可傳代。hESC單個細胞體積較小，核大，胞質(zhì)少，核質(zhì)比高，核仁明顯（如圖1）。

2.h ESC及自發(fā)分化克隆細胞化學(xué)染色

典型hESC的 ALP、PAS、α-NAE染色陽性，POX染色陰性；hESC飼養(yǎng)層 MEF的ALP、PAS、α-NAE、POX染色陰性；hESC自發(fā)分化后，自發(fā)分化克隆邊緣分化細胞ALP、PAS、α-NAE染色陽性程度明顯減弱，POX染色仍陰性，如圖2。

3.擬 胚體形成

hESC懸浮生長后，2d后開始形成擬胚體，擬胚體呈球形，邊緣光滑，折光性好，較致密。擬胚體ALP染色弱陽性，PAS、α-NAE染色陽性，POX染色仍陰性，如圖3。

討 論

胰蛋白酶分步消化法制備的MEF，P2～P5之間都可以用作hESC飼養(yǎng)層細胞，能支持hESC的生長并保持hESC未分化的特性［13］。在hESC傳代過程中，比較將MEF先用絲裂霉素C處理然后再凍存和凍存新鮮MEF復(fù)蘇后再用絲裂霉素C處理兩種方法對hESC傳代的影響，兩種MEF保存時間相同，用絲裂霉素C處理后再凍存的MEF狀態(tài)較差，存活時間相對較短，作為飼養(yǎng)層時，hESC易分化。飼養(yǎng)層MEF密度對hESC的狀態(tài)有影響，飼養(yǎng)層較密時，hESC貼壁較慢，并且易形成不貼壁的致密團塊，hESC生長速度相對較慢；飼養(yǎng)層較稀時，貼壁后的hESC團塊厚度薄，易分化，膠原酶消化后易吹散。在傳代過程中，培養(yǎng)體系bFGF終濃度為0.4μg／L時，添加bFGF前后對飼養(yǎng)層 MEF形態(tài)無明顯變化，hESC易分化；bFGF濃度為4μg／L時，飼養(yǎng)層MEF由不加bFGF時的長條形或者不規(guī)則形變成細長形，hESC的分化較少（5%以內(nèi)），說明bFGF可能通過影響飼養(yǎng)層狀態(tài)而間接影響hESC的生長。在我們的實驗條件下，hESC經(jīng)過30次以上的傳代，hESC克隆形態(tài)上保持不變。

細胞化學(xué)染色是細胞學(xué)和化學(xué)相結(jié)合的一門技術(shù)，它以形態(tài)學(xué)為基礎(chǔ)，結(jié)合運用化學(xué)反應(yīng)對細胞內(nèi)的各種化學(xué)物質(zhì)作定性、定位、半定量的分析。常見的細胞化學(xué)染色法有ALP、PAS、α-NAE、POX染色等，目前主要用于血液細胞的鑒別，對血液疾病的診斷和鑒別診斷具有重要意義。ALP是一種單脂磷酸水解酶，主要功能是破壞生物氧化過程中有劇毒的過氧化物，使其釋放氧，參加細胞內(nèi)氧化還原過程。ALP高表達與干細胞未分化特性相關(guān)，未分化hESC表達豐富，在已分化的hESC中表達減少或消失，ALP染色可作為檢測hESC未分化狀態(tài)的一個重要標(biāo)志［14］。PAS染色可顯示糖原，主要檢測組織、細胞內(nèi)的多糖成分，有報道hESC PAS染色陽性［15］。酯酶是一組具有較大pH范圍的水解酶類，按其對不同脂肪酸水解選擇性不同，可分為非特異性酯酶和特異性酯酶兩大類，α-NAE是一種非特異性酯酶，一般外周血單核細胞含量豐富。POX是外周血中性粒細胞含量最多的一種蛋白質(zhì)。我們的結(jié)果顯示：hESC ALP染色陽性，自發(fā)分化克隆及形成擬胚體后，陽性程度減弱；hESC PAS、α-NAE染色陽性，自發(fā)分化克隆邊緣細胞PAS、α-NAE含量明顯減低，最邊緣甚至呈陰性；hESC POX染色陰性，自發(fā)分化克隆及形成擬胚體后仍保持陰性，說明hESC及早期分化階段POX幾乎無活性。

MEF能支持hESC傳代培養(yǎng)，hESC細胞化學(xué)染色結(jié)果，揭示了hESC細胞內(nèi)的化學(xué)組成特征，為鑒別、進一步研究hESC特性奠定了基礎(chǔ)。

［1］Thomson JA，Itskovitz Eldor J，Shapiro SS，et al.Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.Science，1998，282（5391）：1145-1147

［2］Reubinoff BE，Pera MF，F(xiàn)ong CY，et al.Embryonic stem cell lines from human blastocysts：somatic differentiation in vitro.Nat Biotechnol，2000，18（4）：399-404

［3］Biswas A，Hutchins R.Embryonic stem cells.Stem Cells Dev，2007，16（2）：213-222

［4］Srivastava AS，Malhotra R，Sharp J，et al.Potentials of ES cell therapy in neuro degenerative diseases.Curr Pharm Des，2008，14（36）：3873-3879

［5］Li Z，Han Z，Wu JC.Transplantation of human embryonic stem cell-derived endothelial cells for vascular diseases.J Cell Biochem，2009，106（2）：194-199

［6］Doss MX，Sachinidis A，Hescheler J.Human ES cell derived cardiomyocytes for cell replacement therapy：a current update.Chin J Physiol，2008，51（4）：226-229

［7］Best M，Carroll M，Hanley NA，etal.Embryonic stem cells to beta-cells by understanding pancreas development.Mol Cell Endocrinol，2008，288（1-2）：86-94

［8］Amit M，Itskovitz-Eldor J.Derivation and maintenance of human embryonic stem cells.Methods Mol Biol，2006，331：43-53

［9］Richards M，Bongso A.Propagation of human embryonic stem cells on human feeder cells.Methods Mol Biol，2006，331：23-41

［10］Chin AC，F(xiàn)ong WJ，Goh LT，et al.Identification of proteins from feeder conditioned medium that support human embryonic stem cells.J Biotechnol，2007，130（3）：320-328

［11］Eiselleova L，Peterkova I，Neradil J，et al.Comparative study of mouse and human feeder cells for human embryonic stem cells.Int J Dev Biol，2008，52（4）：353-363

［12］Li CL，Yang YY，Lu XW，et al.Efficient derivation of Chinese human embryonic stem cell lines from frozen embryos.In Vitro Cell Dev Biol-Animal，2010，46（3-4）：186-191

［13］胡嘉波，麻全慧，胡三強，等.人胚胎干細胞飼養(yǎng)層的制備及生物學(xué)活性.中國組織工程研究與臨床康復(fù)，2011，15（23）：4233-4236

［14］Du L，Lin G，Lu G.，et al.Generation and identifica-tion of pluripotent stem cells from human embryonic fibroblast cells by 4defined factors.Zhong Nan Da Xue Xue Bao（Yi Xue Ban），2009，34（12）：1157-1165

［15］Johkura K，Cui L，Asanuma K，et al.Cytochemical and ultrastructural characterization of growing colonies of human embryonic stem cells.J.Anat，2004，205（4）：247-255

圖 版 說 明

圖1 人胚胎干細胞形態(tài)A：倒置相差顯微鏡（×100）；B：倒置相差顯微鏡（×200）；C：Giemsa染色（×100）；D Giemsa染色（×200）

圖2 人胚胎干細胞及人胚胎干細胞自發(fā)分化克隆的細胞化學(xué)染色（×100）A、B、C、D：分別為人胚胎干細胞ALP、PAS、α-NAE、POX染色；E、F、G、H：分別為人胚胎干細胞自發(fā)分化克隆 ALP、PAS、α-NAE、POX染色

圖3 擬胚體細胞化學(xué)染色（×100）A：未染色；B：ALP；C：PAS；D：α-NAE；E：POX

EXPLANATION OF FIGURES

Fig.1Morphology of human embryonic stem cells A：inverted phase contrast microscope（×100）；B：inverted phase contrast microscope（×200）；Giemsa stain（×100）；D Giemsa stain（×200）

Fig.2Cytochemical stainning of human embryonic stem cells and spontaneously differentiated colonies of human embryonic stem cells（×100）A、B、C、D：ALP，PAS，α-NAE and POX cytochemical stain for human embryonic stem cells；E、F、G、H：ALP，PAS，α-NAE and POX cytochemical stain for spontaneously differentiated colonies of human embryonic stem cells

Fig.3cytochemical stain for embryoid body（×100）A ：unstained；B：ALP；C：PAS；D：α-NAE；E：POX