橘紅心大白菜形態(tài)標(biāo)記的遺傳及穩(wěn)定性研究

耿新翠 沈向群 侯 華 洪雅婷 馬士芳

（沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，遼寧沈陽(yáng) 110866）

形態(tài)標(biāo)記指作物特定的、肉眼可見(jiàn)的、簡(jiǎn)單直觀的外部特征，或借助簡(jiǎn)單測(cè)試即可識(shí)別的某些性狀，主要包括植物學(xué)性狀、農(nóng)藝性狀、工藝性狀和抗性等。此種標(biāo)記具有簡(jiǎn)單直觀的特點(diǎn)，是遺傳研究和雜種鑒定常用的傳統(tǒng)方法（鐘淮欽 等，2005）。在作物育種中利用形態(tài)標(biāo)記可以提高種子純度和選育效率（吳新杰 等，2005）。在雜種優(yōu)勢(shì)利用逐漸發(fā)展的今天，形態(tài)標(biāo)記應(yīng)用于雜種鑒別、純度鑒定和品種權(quán)益保護(hù)具有重要意義（涂金星和傅廷棟，2001）。

球心葉為橘紅色是大白菜〔Brassica campestrisL.ssp.pekinensis（Lour）Olsson〕中的稀有顏色。橘紅心大白菜的球心色由1 對(duì)隱性等位基因控制，其花色與球心色的遺傳關(guān)系是連鎖遺傳或一因多效，在轉(zhuǎn)育過(guò)程中根據(jù)花色就能篩選到橘紅心材料（余陽(yáng)俊 等，1993；張德雙 等，2003；馮輝 等，2009）。筆者在轉(zhuǎn)育抗根腫病橘紅心大白菜核基因雄性不育系研究過(guò)程中，通過(guò)種子低溫處理后發(fā)現(xiàn)橘紅心大白菜的子葉顏色與普通心大白菜的子葉顏色明顯不同，表現(xiàn)為橘紅色，而普通心大白菜的子葉顏色為黃色。本試驗(yàn)以橘紅心大白菜和普通心大白菜為親本，探討了橘紅心大白菜子葉顏色的遺傳規(guī)律及其作為形態(tài)標(biāo)記的穩(wěn)定性，解決了橘紅心大白菜轉(zhuǎn)育過(guò)程中如何在早期得到橘紅心性狀、淘汰普通心的問(wèn)題，減少了工作量。

1 材料與方法

1.1 材料

橘紅心大白菜自交系（LH）由黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供，普通心大白菜自交系（91-12）由沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院提供，LH 和91-12 剛剖開(kāi)后的球心色見(jiàn)彩版Ⅰ和彩版Ⅱ。

1.2 方法

試驗(yàn)于2009年2月～2010年11月在沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)蔬菜基地進(jìn)行。橘紅心大白菜與普通心大白菜分別進(jìn)行正反交，得到F1、F1′，F(xiàn)1自交得到F2，回交得到BC1F1。然后把得到的橘紅心、普通心、F1、F1′、F2和BC1F1的種子分別按以下方法進(jìn)行處理。

方法一：第1 組選擇普通心（P1）、橘紅心（P2）、F1、F1′、F2和BC1F1籽粒飽滿的種子浸種催芽后，低溫春化（0～3 ℃）處理，30 d 后放在陽(yáng)光下2 h，統(tǒng)計(jì)橘紅色子葉和黃色子葉，根據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果分析橘紅心大白菜子葉顏色的遺傳規(guī)律。第2 組選擇普通心（P1）、橘紅心（P2）、F1、F2和BC1F1籽粒飽滿的種子浸種催芽后常溫遮光處理，子葉展開(kāi)后放在陽(yáng)光下2 h，統(tǒng)計(jì)橘紅色子葉和黃色子葉；然后分別栽到不同的穴盤(pán)里，待幼苗4～5 片真葉時(shí)移栽到大地里，10月下旬收獲，調(diào)查心色；根據(jù)調(diào)查結(jié)果對(duì)橘紅心大白菜子葉顏色與球心色的遺傳關(guān)系進(jìn)行分析。第3組選擇普通心（P1）、橘紅心（P2）、F1、F2和BC1F1籽粒飽滿的種子浸種催芽后，低溫春化（0～3 ℃）處理，30 d 后放在陽(yáng)光下2 h，統(tǒng)計(jì)橘紅色子葉和黃色子葉，然后分別栽到不同穴盤(pán)中，開(kāi)花后調(diào)查花色，分析橘紅心大白菜子葉顏色與花色的遺傳關(guān)系。

方法二：選擇普通心（P1）、橘紅心（P2）、F1、F2和BC1F1籽粒飽滿的種子浸種催芽后，第1 組在室溫（20～25 ℃）條件下采用室內(nèi)自然光和暗箱培養(yǎng)，子葉展開(kāi)后放在陽(yáng)光下2 h，調(diào)查子葉顏色。第2 組在春化條件（0～3 ℃）下采用光照（光照強(qiáng)度200 lx）和暗箱兩種方法培養(yǎng)，30 d 后結(jié)束春化，放在陽(yáng)光下2 h 后調(diào)查子葉顏色。

方法三：第1 組把普通心（P1）、橘紅心（P2）、F1、F2和BC1F1籽粒飽滿的種子浸種催芽24 h，胚根露出后在春化條件下暗箱培養(yǎng)；第2 組浸種催芽48 h，子葉基本展開(kāi)后在春化條件下暗箱培養(yǎng)。30 d 后結(jié)束，放在陽(yáng)光下2 h 后調(diào)查子葉顏色。

1.3 數(shù)據(jù)處理

樣本容量按公式（1）計(jì)算，適合性檢驗(yàn)按公式（2）計(jì)算。

（1）式中n為樣本容量，P為目標(biāo)基因發(fā)生概率；（2）式中X2為卡平方，A和a分別為顯性組和隱性組的實(shí)際觀察次數(shù)，n=A+a即總次數(shù)，r為理論分離比率，當(dāng)α=0.05 時(shí)，X2=3.841。

2 結(jié)果與分析

2.1 橘紅心大白菜子葉顏色的遺傳特征

2.1.1 子葉顏色的分離規(guī)律 方法一第1 組子葉顏色調(diào)查結(jié)果顯示（表1），91-12 大白菜的子葉顏色全部為黃色，橘紅心大白菜子葉顏色全部為橘紅色。以這兩個(gè)親本子葉顏色作為對(duì)照，正交后代（F1）子葉顏色為黃色，說(shuō)明子葉的橘紅色對(duì)黃色表現(xiàn)為隱性（見(jiàn)彩版Ⅲ）；反交后代（F1′）子葉顏色為黃色，說(shuō)明子葉橘紅色的遺傳不受細(xì)胞質(zhì)影響。F2和BC1F1子葉顏色出現(xiàn)分離，經(jīng)卡平方檢驗(yàn)，F(xiàn)2群體中子葉黃色和橘紅色的分離比為3∶1（見(jiàn)彩版Ⅳ）；BC1F1群體中子葉黃色和橘紅色的分離比為1∶1（見(jiàn)彩版Ⅴ）。這說(shuō)明，橘紅心大白菜子葉的橘紅色受1 對(duì)隱性核基因控制，屬于質(zhì)量性狀遺傳。

2.1.2 子葉顏色與球心色和花色的遺傳關(guān)系 從橘紅心大白菜子葉顏色和球心色遺傳關(guān)系的調(diào)查結(jié)果可以看出（表2）：F1子葉全部表現(xiàn)為黃色，球心色也全部表現(xiàn)為普通心色；F2黃色子葉和橘紅子葉的分離比是3∶1，普通心色和橘紅心色的分離比也是3∶1；BC1F1子葉顏色的分離比與球心色的分離比一樣，都是1∶1。而且子葉顏色與球心色一一對(duì)應(yīng)，即橘紅子葉的植株球心色也是橘紅色，黃色子葉的植株球心色是普通心色。這說(shuō)明橘紅子葉顏色和橘紅心色的遺傳由同1 對(duì)基因控制，二者只是表現(xiàn)時(shí)間不同。

表1 P1、P2、F1、F1′、F2和BC1F1子葉顏色調(diào)查結(jié)果

表2 橘紅心大白菜子葉顏色與球心色的遺傳關(guān)系

子葉顏色與花色的遺傳關(guān)系見(jiàn)表3，F(xiàn)1子葉全部為黃色，花色也全部表現(xiàn)為黃色，F(xiàn)2黃色子葉和橘紅子葉的分離比與黃花和橘紅花的分離比都是3∶1，BC1F1子葉顏色的分離比與花色的分離比也一樣，都是1∶1，并且子葉顏色與花色的遺傳一致，橘紅子葉的植株花色是橘紅色的。有研究指出橘紅心大白菜花色與球心色是連鎖遺傳或一因多效（張德雙 等，2003；馮輝 等，2009），球心色是橘紅色，花色也是橘紅色，反之也是如此。本試驗(yàn)獲得相同的研究結(jié)果。由以上可知，橘紅子葉、橘紅心和橘紅花三者表現(xiàn)為由同1 對(duì)隱性基因控制的遺傳，屬于一因多效。在大白菜試驗(yàn)周期中，橘紅色出現(xiàn)的先后順序?yàn)殚偌t子葉→橘紅心→橘紅花，橘紅子葉出現(xiàn)的最早。

表3 橘紅心大白菜子葉顏色與花色的遺傳關(guān)系

2.2 橘紅心大白菜子葉顏色在不同環(huán)境條件下的穩(wěn)定性

室溫條件下，光照處理與遮光處理大白菜幼苗子葉顏色差異明顯（表4）。光照處理下，P1、P2、F1、F2和BC1F1幼苗子葉顏色相同，都表現(xiàn)為綠色。這是由于光是植物葉綠素合成的一個(gè)主要條件，光照條件下子葉合成的葉綠素的量大于類胡蘿卜素的量，所以子葉都表現(xiàn)為綠色。遮光處理時(shí)子葉葉綠素合成受阻，P1、P2、F1、F2和BC1F1的子葉均表現(xiàn)為黃色。光照2 h 后，P1、F1子葉顏色依然是黃色，P2表現(xiàn)為橘紅色，F(xiàn)2和BC1F1子葉顏色表現(xiàn)為黃色和橘紅色的分離現(xiàn)象，分離比與橘紅心子葉顏色的遺傳規(guī)律相符合。

表4 光照2 h 后室溫光照和室溫遮光處理對(duì)大白菜子葉顏色的影響

低溫條件下，遮光和光照處理結(jié)束時(shí)幼苗子葉顏色均表現(xiàn)為黃色，經(jīng)過(guò)2 h 光照后，普通心P1和F1子葉仍然表現(xiàn)為黃色，橘紅心P2子葉表現(xiàn)為橘紅色，F(xiàn)2和BC1F1子葉顏色分別表現(xiàn)黃色∶橘紅色為3∶1 和1∶1 的分離比例（表5）。低溫遮光處理下橘紅子葉顏色比低溫光照處理下的橘紅子葉稍深，低溫光照處理的子葉橘紅色與常溫遮光處理的顏色相似。

另外，大白菜種子無(wú)論催芽24 h 還是催芽48 h 后進(jìn)行低溫遮光處理，處理結(jié)束后光照2 h，子葉顏色的分離表現(xiàn)一致（表 6），這說(shuō)明催芽時(shí)間不同對(duì)橘紅心大白菜子葉顏色的表現(xiàn)沒(méi)有影響。

由以上可知，橘紅心大白菜子葉顏色（橘紅色）雖然在不同條件下表現(xiàn)出一定的深淺差異，但是和普通心大白菜子葉顏色（黃色）差異明顯，可以很容易地區(qū)分出來(lái)。因此橘紅心大白菜子葉顏色可以像其花色一樣，作為一種理想形態(tài)標(biāo)記來(lái)使用，特別是在轉(zhuǎn)育復(fù)等位基因雄性不育系時(shí)可以減少大量的調(diào)查群體。在以橘紅色子葉作為橘紅心大白菜的形態(tài)標(biāo)記時(shí)，以催芽48 h、低溫、遮光條件下效果最為顯著。

表5 光照2 h 后低溫光照和低溫遮光處理對(duì)大白菜子葉顏色的影響

表6 低溫遮光條件下不同催芽時(shí)間對(duì)大白菜子葉顏色的影響

3 結(jié)論與討論

在苗期通過(guò)觀察標(biāo)記性狀的存在與否保留理想植株，直觀準(zhǔn)確，簡(jiǎn)便快速，具有DNA 分子標(biāo)記鑒定技術(shù)無(wú)法比擬的優(yōu)越性，非常適合在我國(guó)相對(duì)落后的農(nóng)業(yè)技術(shù)水平下推廣（馬雙武，2011）。分子標(biāo)記技術(shù)準(zhǔn)確性高，不受環(huán)境的影響，無(wú)器官發(fā)育時(shí)期的特異性，利用橘紅心大白菜SCAR 標(biāo)記可以鑒定種子純度（王國(guó)臣 等，2007）。然而，分子標(biāo)記輔助選擇需要建立飽和的分子標(biāo)記圖譜，建立分子標(biāo)記與目標(biāo)基因的連鎖關(guān)系和檢測(cè)方法的自動(dòng)化（王琦，2006）。目前大白菜球色育種上分子標(biāo)記的應(yīng)用尚處于探索階段（張立志和張魯剛，2011）。

在本試驗(yàn)中，遮光處理結(jié)束后所有材料子葉顏色均為黃色，光照2 h 后，橘紅心大白菜和普通心大白菜子葉顏色表現(xiàn)出明顯差異。這可能是因?yàn)楣庹諘r(shí)間較短，普通心大白菜子葉葉綠素還沒(méi)有來(lái)得及合成或合成量很少（孟繁靜 等，1995），所以表現(xiàn)為黃色。但是光對(duì)類胡蘿卜素合成的調(diào)節(jié)機(jī)制非常復(fù)雜，例如番茄幼苗脫黃化的過(guò)程中，體內(nèi)的類胡蘿卜素含量可增長(zhǎng)幾倍（惠伯棣，2005），橘紅心大白菜子葉顏色在光照2 h 后由黃色轉(zhuǎn)變?yōu)殚偌t色可能是由于體內(nèi)葉綠素還沒(méi)有合成、而類胡蘿卜素含量迅速增加的緣故。而室溫光照處理結(jié)束時(shí)橘紅心大白菜子葉顏色為綠色、低溫光照處理結(jié)束時(shí)橘紅心大白菜子葉顏色為黃色可能是低溫光照處理的溫度低、光強(qiáng)弱，葉綠素難以合成的緣故。

本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)橘紅心大白菜自交系和普通心大白菜自交系的雜交、自交和回交后代子葉顏色遺傳規(guī)律和穩(wěn)定性的研究得出如下結(jié)論。

①橘紅心大白菜子葉顏色橘紅色對(duì)普通心大白菜子葉顏色黃色表現(xiàn)為1 對(duì)基因控制的遺傳，橘紅色對(duì)黃色表現(xiàn)為隱性，并且子葉顏色與球心色和花色相對(duì)應(yīng)，三者的遺傳屬于一因多效。

②自然光照處理下，子葉葉綠素合成量多于類胡蘿卜素合成量，橘紅心大白菜子葉顏色與普通心大白菜子葉顏色相同，均為綠色。在弱光（200 lx）處理后光照2 h，葉綠素還沒(méi)有合成或含量很低，普通心大白菜子葉表現(xiàn)為黃色，橘紅心大白菜子葉表現(xiàn)為橘紅色。

③無(wú)論常溫還是低溫，遮光處理結(jié)束后光照2 h，橘紅心大白菜子葉表現(xiàn)為橘紅色，普通心大白菜子葉表現(xiàn)為黃色，橘紅色與黃色差異明顯，容易區(qū)分。

④在常溫遮光條件下橘紅心大白菜子葉顏色表現(xiàn)穩(wěn)定，低溫遮光條件下橘紅心大白菜子葉的橘紅色更加明顯，催芽時(shí)間不同不影響橘紅心大白菜子葉顏色的表現(xiàn)。不僅如此，橘紅子葉在子葉期就可以觀察到，即在幼苗初期就可以鑒定，轉(zhuǎn)育復(fù)等位基因雄性不育系時(shí)可以大量減少后期的調(diào)查群體。因此可以說(shuō)，橘紅心大白菜子葉顏色是球心色的一個(gè)理想的形態(tài)標(biāo)記性狀，利用這一性狀在育種過(guò)程中可以進(jìn)行早期篩選，加快育種進(jìn)程。

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