姜濤 姜峰奇 朱躍坤 朱安龍 樸大勛

（哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬一院結(jié)直腸外科 黑龍江哈爾濱 150001）

器官移植是針對(duì)于終末期器官功能衰竭的一種有效治療手段，許多新型免疫抑制劑的出現(xiàn)，大大減弱了移植排斥反應(yīng)，延長了移植物的存活時(shí)間及存活率。但存在長期服用抗排斥藥物帶來的副作用及排斥反應(yīng)的反復(fù)發(fā)作，最佳的處理方法是誘導(dǎo)一種持久穩(wěn)定、無需服用藥物的免疫耐受來解決這一難題。通過建立嵌合體誘導(dǎo)免疫耐受是目前解決器官移植的一種有效的嘗試。本實(shí)驗(yàn)在建立大鼠同種異體節(jié)段性小腸移植模型的基礎(chǔ)上，采用脾細(xì)胞輸注移植觀察移植大鼠的微嵌合體形成，探討微嵌合體形成與移植免疫耐受的關(guān)系。

1 資料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 供體為雄性SD大鼠；受體為雌性Wistar大鼠，均為SPF級(jí)，體重220～260g，哈爾濱醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。

1.2 脾細(xì)胞懸液的制備和移植 供體雄性SD大鼠采用1%戊巴比妥鈉溶液腹腔內(nèi)注射麻醉，無菌條件切取脾臟置于10%肝素鈉鹽水溶液中，將脾臟組織反復(fù)剪切后經(jīng)200目鋼網(wǎng)濾過，濾過液加入5m L淋巴細(xì)胞分離液，離心15min，吸取中層液體加入1640培養(yǎng)液5m L漂洗1次，再次加入1640培養(yǎng)液5m L，即為脾細(xì)胞懸液。

移植前4周將供體SD大鼠的脾細(xì)胞懸液1m L（細(xì)胞總數(shù)為1.5～2.0×107／m L；細(xì)胞活力≥95%）經(jīng)舌靜脈輸注到受體Wistar大鼠體內(nèi)。接受脾細(xì)胞移植的大鼠出現(xiàn)皮膚紅斑，脫毛，腹瀉，體重減輕時(shí)，判為移植物抗宿主反應(yīng)［1］。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組 實(shí)驗(yàn)組：供體為雄性SD大鼠12只，受體為接受相應(yīng)供體SD大鼠脾細(xì)胞輸注的雌性Wistar大鼠12只。對(duì)照組：供體為雄性SD大鼠12只，受體為未處理的雌性Wistar大鼠12只。

1.4 小腸移植 1%戊巴比妥鈉腹腔內(nèi)麻醉，清潔手術(shù)，在雙人雙目顯微鏡下由兩人完成。我們?cè)贛onchik和Russell手術(shù)方法的基礎(chǔ)上［2］，改進(jìn)了血管吻合方式，動(dòng)脈重建采用帶供體腹主動(dòng)脈袖片的腸系膜上動(dòng)脈和受體腹主動(dòng)脈端側(cè)縫合；靜脈重建采用供體門靜脈和受體左腎靜脈端端袖套吻合；共行大鼠同種異體節(jié)段性異位小腸移植24例。

1.5 PCR檢測(cè)嵌合體

1.5.1 外周血模板的制備 移植后5d，取受體外周血1m L，分離白細(xì)胞后離心去上清，加蛋白酶K及蛋白酶K－氯仿（1∶1）離心，棄上清，自然干燥，TE緩沖液懸浮沉淀，此液體即為提純的DNA模板。

1.5.2 皮膚組織模板的制備 移植后5d，無菌條件下切取受體大鼠背部皮膚，剪碎加生理鹽水離心，取細(xì)胞沉淀多少加入適量裂解液消化。上游引物5′-CGT GGA GAG CGC AAG TT-3′，下游引物5′－GTC GCT GTT TCT GCT GTA GTT A-3′。擴(kuò)增產(chǎn)物5μL與1μL上樣緩沖液混勻，在瓊脂糖凝膠內(nèi)電泳并染色，紫外燈下觀察在154bp處出現(xiàn)條帶即為Y染色體特異性DNA片段，判為微嵌合體陽性。

1.6 病理學(xué)判定 分別于移植術(shù)后5d、7d對(duì)移植腸管連續(xù)取材，石蠟包埋、切片，常規(guī)染色病理學(xué)檢查。排斥反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)判定參照文獻(xiàn)［1］：輕度：腸黏膜絨毛輕度畸形，間質(zhì)僅有少量的炎性細(xì)胞浸潤；中度：腸絨毛畸形更加明顯，黏膜上皮開始有脫落，細(xì)胞浸潤加重；重度：腸絨毛的結(jié)構(gòu)消失，上皮明顯脫落，腸壁變薄并伴有壞死，腸間質(zhì)有大量炎細(xì)胞浸潤，血管炎癥明顯。

2 結(jié) 果

2.1 大鼠接受小腸移植后的存活時(shí)間 對(duì)照組移植后平均存活時(shí)間為7.1±1.2d，顯著少于實(shí)驗(yàn)組的18.4±3.6d（P＜0.05），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.2 嵌合體檢測(cè)結(jié)果 對(duì)小腸移植術(shù)后存活5d的19只受體雌性大鼠外周血及皮膚應(yīng)用PCR技術(shù)檢測(cè)Y染色體特異性DNA片段。實(shí)驗(yàn)組陽性6例，對(duì)照組無陽性結(jié)果，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（見圖1）。

2.3 移植物病理檢查結(jié)果 術(shù)后第5d，對(duì)照組移植物腸黏膜明顯畸形，黏膜上皮明顯水腫，間質(zhì)淋巴細(xì)胞浸潤，表現(xiàn)為中度排斥反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)組移植物腸黏膜輕度倒覆，間質(zhì)少量淋巴細(xì)胞浸潤，表現(xiàn)為輕度排斥反應(yīng)。術(shù)后第7d，對(duì)照組移植物腸黏膜破壞明顯，絨毛出現(xiàn)脫落，腸壁變薄壞死，間質(zhì)大量淋巴細(xì)胞浸潤，表現(xiàn)為重度排斥反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)組移植物黏膜出現(xiàn)輕度倒覆，間質(zhì)少量淋巴細(xì)胞浸潤，表現(xiàn)為中度排斥反應(yīng)。

圖1 PCR電泳圖

3 討 論

由于腸道及其系膜含有大量淋巴組織，小腸移植后的免疫反應(yīng)為雙向反應(yīng)，不僅有器官移植所共有的排斥反應(yīng)，而且可能出現(xiàn)移植物抗宿主反應(yīng)（GVHD）。1993年Starzl提出了雙向移植排斥理論［2］，認(rèn)為供體過客細(xì)胞在宿主體內(nèi)長期存在，通過某種方式可誘導(dǎo)免疫耐受而使受體長期存活。臨床實(shí)踐發(fā)現(xiàn)肝臟移植排斥反應(yīng)較弱，因?yàn)楦闻K的過客細(xì)胞含量高，易于形成嵌合體獲得免疫耐受。心腎等實(shí)質(zhì)器官中過客細(xì)胞量少，不易形成嵌合體，因此排斥反應(yīng)較強(qiáng)，此外通過肝腎聯(lián)合移植增加過客細(xì)胞數(shù)量，可使排斥反應(yīng)發(fā)生率較單純腎移植患者減低。在此基礎(chǔ)上，Starzl等認(rèn)為移植物形成嵌合體能力的差異是移植物能否被接受及決定排斥反應(yīng)強(qiáng)弱的基礎(chǔ)，微嵌合狀態(tài)可導(dǎo)致受體對(duì)供體器官的移植耐受。國內(nèi)喬海泉等在胰腺移植的研究中發(fā)現(xiàn)胰腺和肝臟聯(lián)合移植時(shí)可減輕胰腺移植的排斥反應(yīng)，這種聯(lián)合臟器移植的互惠作用機(jī)制可能與微嵌合體形成有關(guān)［3］。

從我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看到經(jīng)過雄性供體脾細(xì)胞輸注的大鼠小腸移植的雌性受體出現(xiàn)了Y染色體特異性DNA片段，即形成了微嵌合體（6／9），其檢出率明顯高于未經(jīng)輸注的受體（0／10）。表明經(jīng)外周血脾細(xì)胞移植可誘導(dǎo)受體微嵌合體的形成。

目前在小腸移植排斥反應(yīng)的診斷方面，組織病理學(xué)切片檢查仍是 “金標(biāo)準(zhǔn)”［4］。我們?cè)诖笫笮∧c移植術(shù)后5、7d通過移植腸段取材進(jìn)行病理組織學(xué)觀察，發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組均出現(xiàn)了急性排斥反應(yīng)，但實(shí)驗(yàn)組排斥反應(yīng)程度較對(duì)照組輕；而微嵌合體陰性者受體的急性排斥反應(yīng)程度較微嵌合體形成的受體明顯加重，表明微嵌合體形成與受體移植免疫耐受密切相關(guān)。

本實(shí)驗(yàn)表明：在大鼠異位節(jié)段性小腸移植前預(yù)先經(jīng)外周血進(jìn)行脾細(xì)胞輸注移植確實(shí)可促進(jìn)大鼠小腸移植受體微嵌合體的形成，嵌合體形成減輕了急性排斥反應(yīng)，可誘導(dǎo)受體免疫耐受。我們推測(cè)其可能的機(jī)制與脾細(xì)胞中含有大量的未成熟樹突狀細(xì)胞（DC）有關(guān)。Qian S等認(rèn)為未成熟DC細(xì)胞表面協(xié)同刺激分子B7的表達(dá)存在缺陷，影響T細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)，從而導(dǎo)致同種反應(yīng)性T細(xì)胞無功能、清除或誘導(dǎo)凋亡，因而可促進(jìn)微嵌合體形成［5］。對(duì)于脾細(xì)胞移植誘導(dǎo)大鼠小腸移植微嵌合體形成和微嵌合體誘導(dǎo)特異性免疫耐受的確切機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

［1］ 吳波，周曉軍.小腸移植后急性排斥反應(yīng)的病理診斷標(biāo)準(zhǔn)［J］.腸外與腸內(nèi)營養(yǎng)，2005，12（6）：378-381.

［2］ Starzl TE，Demetris AJ，et al.Cell migration and chimerism after whole organ transplantation：the basis of graft acceptance［J］.Hepatology，1993，17：1127.

［3］ 喬海泉，朱預(yù)，姜洪池，等.胰腺和肝臟在聯(lián)合移植時(shí)互惠作用的觀察［J］.中華外科雜志，1997，35，（12）：749-752.

［4］ Asfar S，Zhong R，Grant D.Small bowel transplantation［J］.Surg Clin Noth Am，1994，74：1197-1200.

［5］ Qian S，Demetris AJ，Murase N，et al.The Murine liver allograft transplantation：tolerance and donor cell chimerism［J］.Hepatology，1994，19：916.