高效液相色譜法同時(shí)檢測(cè)生物樣品中利多卡因和MEGX

李江濤，嚴(yán) 鵬，尉志文，贠克明

利多卡因（Lidocaine）是椎管內(nèi)麻醉常用的酰胺類(lèi)藥物，由于椎管內(nèi)結(jié)構(gòu)特殊等原因［1，2］，由利多卡因所引起麻醉意外等人身傷亡案例［3－5］時(shí)有發(fā)生。利多卡因入體后大部分經(jīng)肝藥酶（細(xì)胞色素P450）代謝為單乙基甘氨酰二甲苯胺（MEGX），MEGX影響著利多卡因的療效及毒性［6，7］，同時(shí)檢測(cè)利多卡因和MEGX含量對(duì)多卡因麻醉意外的法醫(yī)學(xué)鑒定意義重大。本實(shí)驗(yàn)建立生物檢材中利多卡因和MEGXA的高效液相色譜法（HPLC）檢測(cè)方法，并應(yīng)用于利多卡因麻醉意外法醫(yī)毒物動(dòng)力學(xué)研究。

1 材料與方法

1.1 試劑及儀器 鹽酸利多卡因注射液（2%，國(guó)藥準(zhǔn)字H31021071）購(gòu)于上海復(fù)星朝暉藥業(yè)有限公司，利多卡因標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自公安部物證鑒定中心（Lot：SW1083），MEGX標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自公安部物證鑒定中心（Lot：6938292），普魯卡因標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自公安部物證鑒定中心，甲醇為T(mén)EDIA公司生產(chǎn)。除甲醇為色譜純，其他均為分析純。

日本島津LC－20AT高效液相色譜儀，Dikma迪馬科技C18二代色譜柱，SPD－20A紫外檢測(cè)器，N3000色譜工作站。

1.2 儀器分析條件 Dikma C18柱（迪馬科技5μm；250 mm×4.6 mm）；柱溫25℃；流動(dòng)相：甲醇：磷酸緩沖液（15 mmol/L，p H＝3）＝30：70；檢測(cè)波長(zhǎng)229 nm；流速1 m L/min；進(jìn)樣量20μL；工作站：N3000色譜工作站。

1.3 給藥方案和樣品采集 健康本地犬9只，蛛網(wǎng)膜下腔注射組（6只）和對(duì)照組（3只）。蛛網(wǎng)膜下腔注射組：蛛網(wǎng)膜下腔穿刺后，于5 min內(nèi)向蛛網(wǎng)膜下腔注入LD50（15 mg/kg）劑量利多卡因；對(duì)照組：以等體積生理鹽水代替利多卡因，其余處理同蛛網(wǎng)膜下腔注射組。所有實(shí)驗(yàn)犬于死后即刻提取心血、肝臟待檢。1.4 心血和肝臟樣品處理與分析 待測(cè)固性樣品1 g或血液1 m L，加蒸餾水2 m L，固性樣品超聲勻漿3 min，加內(nèi)標(biāo)普魯卡因50μg，振蕩5 min；10%HCl調(diào)酸p H＝2～3，振蕩5 min，3000 r/min離心10 min，提取上清液；上清液用10%NaOH調(diào)堿p H＝11～12，震蕩2 min，加乙醚5 m L，振蕩15 min，3000 r/min離心10 min，取上層乙醚液；乙醚5 m L重復(fù)提取一次；合并乙醚液，40℃水浴揮干。殘?jiān)?00μL甲醇定容，通過(guò)針筒式濾膜過(guò)濾器（孔徑0.45μm）過(guò)膜后，按上述儀器條件進(jìn)樣20μL，液相色譜工作內(nèi)標(biāo)工作曲線法定量分析樣品中利多卡因及MEGX。

2 結(jié) 果

2.1 利多卡因、MEGX及內(nèi)標(biāo)普魯卡因液相色譜圖（見(jiàn)圖1～圖3）

圖1 利多卡因、MEGX、普魯卡因標(biāo)準(zhǔn)高效液相色譜圖

圖2 染毒血中高效液相色譜圖

圖3 染毒肝中高效液相色譜圖

2.2 工作曲線 分別取空白心血1 m L和空白肝臟1 g各14份，置于離心管中，每管分別添加利多卡因及 MEGX各0.01 μg、0.03μg、0.05μg、0.1μg、0.2μg、0.6μg、1.0μg、2.5μg、5 μg、10μg、30μg、50μg、100μg、150μg，配制成為標(biāo)準(zhǔn)系列，并依次加入內(nèi)標(biāo)液普魯卡因50μg，按1.4前述方法提取與檢測(cè)。以利多卡因或MEGX濃度（X）對(duì)利多卡因或MEGX與內(nèi)標(biāo)物峰面積比值（Y）作線性回歸，心血和肝臟中利多卡因液相色譜檢 測(cè)的回歸方程分別為Y＝0.217X＋0.019和Y＝0.214X＋0.113，相關(guān)系數(shù)分別為0.996和0.988，線性檢測(cè)范圍均為（0.2～100）μg/m L、最低檢出濃度分別為0.05μg/m L或μg/g；心血和肝臟中MEGX液相色譜檢測(cè)的回歸方程分別為Y＝0.514X＋0.033和Y＝0.440X＋0.292，相關(guān)系數(shù)分別為0.995和0.993，線性檢測(cè)范圍均為（0.2～20）μg/m L、最低檢出濃度分別為0.05μg/m L。

2.3 精密度和提取回收率 分別取含2μg、10μg、50μg的利多卡因標(biāo)準(zhǔn)甲醇溶液和含 MEGX 2μg、10μg、50μg的 MEGX標(biāo)準(zhǔn)甲醇溶液各20μL進(jìn)樣，每個(gè)樣品每日測(cè)定5次，連續(xù)測(cè)定3 d，其日內(nèi)、日間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差為1.5%～2.7%和2.0%～3.7%。

取空白檢材1 m L（1 g）/份，共9份，分別加入利多卡因和MEGX標(biāo)準(zhǔn)品10μg與2μg（3份）、30μg與5μg（3份）、50μg與10μg（3份），按1.4前述樣品處理方法處理并檢測(cè)，計(jì)算回收率。心血中利多卡因和MEGX的回收率為（99.3±5.0）%～（101.2±4.0）%，肝臟中利多卡因和 MEGX的回收率為（98.1±4.8）%～（104.2±4.4）%。

2.4 染毒死亡犬體內(nèi)利多卡因及MEGX含量 染毒死亡犬心血和肝臟經(jīng)提取后，以?xún)?nèi)標(biāo)工作曲線法計(jì)算樣品中

利多卡因及MEGX含量。心血利多卡因及MEGX含量分別為（14.50±1.64）μg/m L和（1.64±0.22）μg/m L，肝臟利多卡因及 MEGX含量分別為（14.90±1.19）μg/mg和（2.53±0.36）μg/mg。

3 討 論

據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，同時(shí)檢測(cè)利多卡因和MEGX常使用GC［8］和 HPLC［9］法。由于 MEGX的化學(xué)性質(zhì)，GC和 GC/MS在檢測(cè)MEGX時(shí)，必須先進(jìn)行衍生化處理，才能進(jìn)一步檢測(cè)；而所報(bào)道HPLC法多采用乙腈等高成本流動(dòng)相，并且檢材前處理發(fā)放繁瑣［10］。本實(shí)驗(yàn)建立同時(shí)檢測(cè)生物檢材中利多卡因和MEGX的HPLC方法，該方法在選定條件下利多卡因、MEGX、普魯卡因（內(nèi)標(biāo)）能夠與其他雜質(zhì)峰良好分離（普魯卡因Rt＝4.03min，MEGX Rt＝10.17 min，利多卡因Rt＝13.228 min，分離度Rs＞2），峰形對(duì)稱(chēng)，分離效果好，在較高濃度范圍內(nèi)有較好的線性關(guān)系，提取回收率及精密度均達(dá)到檢案要求，且重現(xiàn)性好，檢材前處理簡(jiǎn)單，靈敏度高，可用于生物檢材中利多卡因和MEGX的分析測(cè)定。

有關(guān)報(bào)道中提取利多卡因是在p H為9的堿性環(huán)境［11］，但本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)利多卡因和MEGX在提取環(huán)節(jié)中對(duì)p H非常敏感，利多卡因在p H為9時(shí)回收率較高，而MEGX在該p H下回收率卻比較低，通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)并考慮到實(shí)際案例，經(jīng)反復(fù)實(shí)驗(yàn)，最終選用p H在11～12范圍，可保證利多卡因和MEGX都具有較高回收率。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，各臟器中利多卡因含量較MEGX含量高，與文獻(xiàn)報(bào)道［12］利多卡因在蛛網(wǎng)膜下腔麻醉致死犬體內(nèi)的含量分布一致。

本實(shí)驗(yàn)所建立方法能夠快速準(zhǔn)確定性定量分析樣品中的利多卡因和MEGX，同時(shí)能夠應(yīng)用于臨床麻醉意外病人藥物濃度檢測(cè)，麻醉意外的法醫(yī)學(xué)鑒定，以及進(jìn)一步的毒（藥）物動(dòng)力學(xué)研究。

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