(山東省海水養(yǎng)殖研究所,山東 青島,266071)

抗生素的發(fā)現(xiàn)促進(jìn)了人類醫(yī)學(xué)的巨大進(jìn)步,大量的抗生素的廣泛應(yīng)用,使動(dòng)物養(yǎng)殖業(yè),尤其是水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)不斷受益。從生產(chǎn)實(shí)踐來(lái)看,使用傳統(tǒng)的消毒劑和抗生素并不能有效地防止疾病的發(fā)生[1],而且還可能導(dǎo)致抗藥性菌株的出現(xiàn)[2],其抗藥性基因還可轉(zhuǎn)移給從未暴露于抗生素的其他菌株,因此迫切需要減少抗微生物藥物的使用[3-4]。

益生菌是一種活的微生物,能維持腸道平衡而有效地影響宿主動(dòng)物,目前也稱為微生態(tài)調(diào)節(jié)劑(Microecological modulator)、EM 菌制劑(Efficient microbe agent)等[5],現(xiàn)代的定義傾向?yàn)?在微生態(tài)理論指導(dǎo)下,調(diào)整微生態(tài)失調(diào),保持微生態(tài)平衡,增強(qiáng)新陳代謝,促進(jìn)生長(zhǎng)發(fā)育,從而提高宿主的健康水平或增進(jìn)健康狀態(tài)的微生物及其代謝產(chǎn)物和生長(zhǎng)促進(jìn)物質(zhì)[6]。益生菌菌種主要有芽孢桿菌屬(Bacillusspp.)、乳酸菌屬(Lactobacillusspp.)、弧菌屬(Vibriospp.)、和酵母(Saccharomycesspp.)等。

Kozasa首次將微生態(tài)制劑應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖,采用1株從土壤中分離的芽孢桿菌(Bacillus toyoi)處理日本鰻鱺(Anguilla japonica),降低了由愛(ài)得華氏菌引起的死亡,之后微生態(tài)制劑的研究便得到迅速發(fā)展[7];Gatesoupe[8]加乳酸細(xì)菌于輪蟲(chóng)的培養(yǎng)基中,并用該輪蟲(chóng)作為大菱鲆仔魚(yú)的餌料,當(dāng)仔魚(yú)被病原弧菌感染時(shí),能有效降低其死亡率; Moriarty[9]在印度尼西亞蝦場(chǎng)的研究表明,在沒(méi)有使用芽孢桿菌的蝦池中,80 d之內(nèi)蝦因發(fā)光弧菌病而死亡,而使用幾株芽孢桿菌培養(yǎng)物的蝦池,160 d之后蝦沒(méi)有任何問(wèn)題;Rengpipat等[10]以添加芽孢桿菌S11的餌料飼育斑節(jié)對(duì)蝦后期幼體100 d之后,以病原菌哈氏弧菌(Vibrio harveyi)浸浴感染,10 d之后所有芽孢桿菌S11 處理組的對(duì)蝦100 %存活,而對(duì)照組的成活率只有 26%。Gildberg[11]等從大西洋鱈(Gauds morhua)腸道中分離到的一株乳酸桿菌并制成凍干粉添加到該鱈魚(yú)的飼料中喂食魚(yú)苗,結(jié)果發(fā)現(xiàn)乳酸桿菌可以提高對(duì)鰻弧菌產(chǎn)生疾病的抵抗力。

作者以大菱鲆(Scophthalmus maximus)幼魚(yú)為研究對(duì)象,旨在探討大菱鲆苗種培育養(yǎng)殖生產(chǎn)實(shí)踐中,在飼料中直接添加單一及復(fù)合種類的常見(jiàn)益生菌對(duì)大菱鲆幼魚(yú)消化道酶活力和腸道菌群的變化,從而為益生菌在大菱鲆養(yǎng)殖中的直接應(yīng)用提供理論依據(jù)。本次實(shí)驗(yàn)選用的芽孢桿菌種類為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)和地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis),選用的乳酸菌種類為嗜酸乳酸菌(Lactobacillus acidophilus)和雙歧桿菌(Bifidobacterium inopinatum)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)用魚(yú)及分組

實(shí)驗(yàn)于2008年4月15日～6月15日在山東省海水養(yǎng)殖研究所中試基地實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行,實(shí)驗(yàn)用大菱鲆體質(zhì)健康,體長(zhǎng) 5～6cm。在海水良種繁育中心實(shí)驗(yàn)室暫養(yǎng)一周后隨機(jī)分為8組:對(duì)照組、枯草芽孢桿菌組、地衣芽孢桿菌組、地衣芽孢桿菌+枯草芽孢桿菌(質(zhì)量比為1∶1)、嗜酸乳酸菌組、雙歧桿菌組、嗜酸乳酸菌+雙歧桿菌(質(zhì)量比為1∶1)組、地衣芽孢桿菌+枯草芽孢桿菌+嗜酸乳酸菌+雙歧桿菌(質(zhì)量比為1∶1∶1∶1)組。每組3個(gè)重復(fù),每個(gè)重復(fù)100尾魚(yú),養(yǎng)殖在容積1 m3循環(huán)水水族箱中,養(yǎng)殖密度100 尾/ m3。

1.2 實(shí)驗(yàn)用飼料

基礎(chǔ)飼料以魚(yú)粉、豆粕為主要原料配制飼料,飼料原料經(jīng)粉碎過(guò)60 目篩,用雙螺桿壓條機(jī)擠壓出直徑分別為2 mm和3 mm兩種粒徑的飼料,在90℃熟化30 min后,于陰涼處晾干,剪切成3 mm長(zhǎng)的顆粒貯存于-20℃的冰柜中待用。

8組實(shí)驗(yàn)組除分別添加了不同菌種及比例的菌液外,各種營(yíng)養(yǎng)成分均相同(實(shí)驗(yàn)中枯草芽孢桿菌及地衣芽孢桿菌單菌菌液購(gòu)自山東濟(jì)南大吉飼料有限公司,菌含量不小于 1010CFU/mL;嗜酸乳酸桿菌及雙歧桿菌干粉購(gòu)自江蘇沃爾德實(shí)業(yè)有限公司,菌含量不小于1010CFU/g)。芽孢桿菌屬能耐高溫高壓[12],而乳酸菌屬在 50℃可以保持 100%的存活率[13],所以實(shí)驗(yàn)組采用攪拌法,把菌液直接加入飼料中,制成濕顆粒,于 40℃烘至半干,然后在-20℃冰箱保存,以備投喂。每克飼料約含菌 3.0×109個(gè)/g干質(zhì)量。

日投喂量為體質(zhì)量的5%～10%,分2次投喂。

1.3 飼養(yǎng)管理

分組后的實(shí)驗(yàn)用魚(yú)養(yǎng)殖在循環(huán)水水族箱中,每天換水 2次,每次換水 1/2。每天投餌兩次,分別為7:30～8:30,16:30～17:30,投喂量以飽食為標(biāo)準(zhǔn)。每箱魚(yú)投喂的飼料于投喂前和投喂后稱質(zhì)量。每次投喂前先吸取糞便,投喂后吸取殘餌,將殘餌過(guò)濾烘干保存,以備計(jì)算攝食量。飼養(yǎng)條件恒定(水溫17℃±1℃,鹽度32±0.2),實(shí)驗(yàn)共進(jìn)行60 d。

1.4 腸道菌群檢測(cè)

養(yǎng)殖中期(第30天)和后期(第60天)測(cè)定對(duì)大菱鲆腸道弧菌及細(xì)菌總數(shù)。測(cè)定方法參考李繼秋[14]的方法,從每水族箱中隨機(jī)取10尾大菱鲆,用1/10000 的MS222 麻醉后,無(wú)菌操作將大菱鲆解剖,去除腸道糞便,置于滅菌的玻璃勻漿器中,加入10 mL無(wú)菌生理鹽水勻漿。再依次以10倍系列稀釋,選擇合適的稀釋度測(cè)弧菌以及細(xì)菌總數(shù)。養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)后期,收集魚(yú)糞便測(cè)弧菌以及細(xì)菌總數(shù),測(cè)定方法同腸道細(xì)菌測(cè)定。細(xì)菌總數(shù)和弧菌數(shù)分別通過(guò)涂布2216E和 TCBS培養(yǎng)基測(cè)定,用N表示,單位為cfu/ind腸道,并用lgN處理。

1.5 血液免疫指標(biāo)測(cè)定

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后饑餓24 h。用1 mL無(wú)菌注射器,按照血淋巴與抗凝劑(10 mmol/L EDTA·Na2,450 mmol/L NaCl,10 mmol/L KCl,10 mmol/L HEPES,pH7.3,850 mOsm/kg)體積比為 1∶2的比例,每個(gè)養(yǎng)殖箱隨機(jī)取 3尾魚(yú),從心臟部位進(jìn)行取血,進(jìn)行血細(xì)胞總數(shù)計(jì)數(shù)。

用于其余血液指標(biāo)測(cè)定的采樣方法為:用 1mL的無(wú)菌注射器自對(duì)魚(yú)心臟抽取血液,每個(gè)養(yǎng)殖箱隨機(jī)取20尾魚(yú)血液合并置于無(wú)菌離心管中4℃靜置過(guò)夜后,3 000 r/min離心 10 min,取上層血清置于-80℃超低溫冰箱保存待測(cè)。

酚氧化酶活性測(cè)定:采用Hernández-López等[15]的方法。以實(shí)驗(yàn)條件下,每 mL血清每 min 吸光值增加0.001,定義為1個(gè)酶活性單位(U)。

血清溶菌酶活性通過(guò)濁度比色法測(cè)定。以實(shí)驗(yàn)條件下,每mL血清每min吸光值減少0.001為1個(gè)酶活性單位(U)。

血清蛋白濃度、SOD和總抗氧化力使用南京建成試劑盒測(cè)定。血清中 SOD酶活性單位定義為每mL血清中SOD 抑制率達(dá)到50% 所對(duì)應(yīng)的SOD量為1個(gè)酶活性單位。總抗氧化活性單位定義為37℃時(shí),每mL血清每分鐘吸光度增加0.001為1個(gè)酶活性單位。

1.6 數(shù)據(jù)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS12.0軟件進(jìn)行單因素方差分析。當(dāng)差異顯著時(shí),用Duncan檢驗(yàn)法進(jìn)行多重比較,差異顯著度P為0.05。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 腸道內(nèi)細(xì)菌總數(shù)和弧菌總數(shù)

各實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照級(jí)養(yǎng)殖中期(30 d)和養(yǎng)殖后期(60 d)腸道細(xì)菌總數(shù)和弧菌總數(shù)見(jiàn)表1。

表1 大菱鲆養(yǎng)殖中期和后期腸道細(xì)菌總數(shù)和弧菌總數(shù)Tab.1 Effects of different dietary probiotics on total bacterium counts (TBC) and Vibrios bacterium counts (VBC) in intestine tract of Scophthal musmaximus n=3;X ±SE;lgCFU/ind

與對(duì)照組相比,整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中,添加了益生菌的各實(shí)驗(yàn)組對(duì)大菱鲆幼魚(yú)腸道中的總菌數(shù)均無(wú)顯著影響(P＞0.05),但在中期和后期均顯著降低了大菱鲆幼魚(yú)腸道弧菌數(shù)(P<0.05);但實(shí)驗(yàn)后期大菱鲆幼魚(yú)腸道弧菌數(shù)與中期相比沒(méi)有顯著變化(P<0.05)。

2.2 對(duì)大菱鲆幼魚(yú)免疫力的影響

免疫指標(biāo)與對(duì)照組相比,添加益生菌能不同程度提高大菱鲆幼魚(yú)的血細(xì)胞數(shù)、血清蛋白濃度、酚氧化酶活力(表2)及溶菌酶、超氧化物歧化酶及總抗氧化力(表3)。

表2 飼料中益生菌對(duì)大菱鲆免疫功能的影響ITab.2 Effects of different dietary probiotics on immunity of Scophthal musmaximus n=3;X ±SE

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明,添加益生菌的實(shí)驗(yàn)組均能使大菱鲆幼魚(yú)的血細(xì)胞數(shù)顯著增加(P＜0.05)。復(fù)合益生菌能使大菱鲆幼魚(yú)的血清蛋白濃度顯著提高(P＜0.05),其中,添加單一及復(fù)合乳酸菌的3個(gè)實(shí)驗(yàn)組和添加地衣芽孢桿菌+枯草芽孢桿菌+嗜酸乳酸菌+雙歧桿菌的實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比血清蛋白濃度顯著提高(P＜0.05),添加單一及復(fù)合芽孢桿菌的 3個(gè)實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相血清蛋白濃度略有提高,但差異不顯著(P＞0.05),說(shuō)明單一及復(fù)合乳酸菌在提高大菱鲆幼魚(yú)血清蛋白濃度方面起主要作用。

各實(shí)驗(yàn)組均能顯著提高大菱鲆血清中酚氧化酶活力(P＜0.05),其中添加單一及復(fù)合乳酸菌的 3個(gè)實(shí)驗(yàn)組和添加地衣芽孢桿菌+枯草芽孢桿菌+嗜酸乳酸菌+雙歧桿菌的實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比,差異更為明顯。

各實(shí)驗(yàn)組均能顯著提高大菱鲆幼魚(yú)血清中溶菌酶活力(P＜0.05),其中添加復(fù)合芽孢桿菌和復(fù)合乳酸菌的實(shí)驗(yàn)組在提高大菱鲆幼魚(yú)血清中溶菌酶活力方面比添加單一菌種效果更為明顯,添加地衣芽孢桿菌+枯草芽孢桿菌+嗜酸乳酸菌+雙歧桿菌復(fù)合益生菌的實(shí)驗(yàn)組,效果非常顯著,比對(duì)照組提高了126.7%。

添加了嗜酸乳酸菌+雙歧桿菌的實(shí)驗(yàn)組和添加了地衣芽孢桿菌+枯草芽孢桿菌+嗜酸乳酸菌+雙歧桿菌復(fù)合益生菌的實(shí)驗(yàn)在提高大菱鲆幼魚(yú)血清中超氧化物歧化酶活力方面與對(duì)照組相比差異更為顯著(P＜0.05)。

各實(shí)驗(yàn)組均能顯著提高大菱鲆幼魚(yú)血清的總抗氧化力(P＜0.05),各實(shí)驗(yàn)組之間差異不顯著(P＞0.05)。

表3 飼料中益生菌對(duì)大菱鲆免疫功能的影響IITab.3 Effects of different dietary probiotics on immunity of Scophthal musmaximus n=3;X ±SE

3 討論

本實(shí)驗(yàn)中選用的芽孢桿菌菌種為枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌。芽孢桿菌可用作飼料添加劑,是一種需氧的非致病菌,以內(nèi)孢子的形式存在于腸道微生物群落中,能使腸內(nèi)的 pH下降,氨濃度降低,促進(jìn)淀粉、纖維素等分解。芽孢桿菌耐酸、耐鹽、耐高溫(100℃)和擠壓,是一種比較穩(wěn)定的益生菌。本實(shí)驗(yàn)中選取中的乳酸菌菌種為嗜酸乳酸菌和雙歧桿菌。乳酸菌能分解糖類產(chǎn)生乳酸,通過(guò)酸化作用提高動(dòng)物對(duì)飼料的消化效果,厭氧或兼性厭氧,不能形成芽孢,穩(wěn)定性較低。雙歧桿菌制劑可抑制革蘭氏陰性菌,減少腸桿菌細(xì)胞壁內(nèi)毒素進(jìn)入魚(yú)體,保護(hù)肝臟。

本實(shí)驗(yàn)中,與對(duì)照組相比,添加了益生菌的各實(shí)驗(yàn)組對(duì)大菱鲆幼魚(yú)腸道中的總菌數(shù)均無(wú)顯著影響,但都顯著降低了大菱鲆幼魚(yú)腸道中的弧菌總數(shù)。分析其作用機(jī)制,益生菌可以通過(guò)與有害微生物競(jìng)爭(zhēng)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)及生存和繁殖空間,抑制有害微生物生長(zhǎng),從而維持機(jī)體微生態(tài)平衡。郭志勛[16]等在飼料中添加芽孢桿菌能夠促進(jìn)凡納濱對(duì)蝦(Litopenaeus vannamei)的生長(zhǎng)及免疫力,這些研究結(jié)果均與本研究結(jié)果相似。

劉克林等[17]采用有益芽孢桿菌制成的微生態(tài)添加劑飼喂鯉魚(yú)苗 100 d后發(fā)現(xiàn),實(shí)驗(yàn)組免疫器官胸腺、脾臟生長(zhǎng)發(fā)育較對(duì)照組迅速、成熟快,電鏡觀察免疫器官內(nèi)T、B淋巴細(xì)胞較對(duì)照組成熟快、數(shù)量增多,產(chǎn)生抗體增多,免疫功能增強(qiáng)。

在本實(shí)驗(yàn)中,益生菌對(duì)大菱鲆血細(xì)胞數(shù)、溶菌酶、血清蛋白濃度、血清酚氧化酶、血清超氧化歧化酶和血清總抗氧化力都有不同程度的提高。說(shuō)明飼料中添加益生菌可以提高大菱鲆非特異性免疫能力。

復(fù)合益生菌組有比單一益生菌組更高的血清蛋白濃度及溶菌酶活力,與 Salinas等[18]在烏頰魚(yú)(Sparus aurataL.) 中發(fā)現(xiàn)的芽孢桿菌和乳酸菌的復(fù)合菌比單一的芽孢桿菌和乳酸菌有更好的免疫效果相似。

可見(jiàn)益生菌可以作為良好的免疫激活劑,通過(guò)激發(fā)機(jī)體的體液免疫和細(xì)胞免疫來(lái)增強(qiáng)機(jī)體免疫機(jī)能。其作用機(jī)理可能是通過(guò)細(xì)菌本身或細(xì)胞壁成分刺激非特異性免疫系統(tǒng)使其發(fā)揮作用,從而提高動(dòng)物免疫力[19]。多種來(lái)自細(xì)菌細(xì)胞壁的成分可作為免疫增強(qiáng)劑已在甲殼動(dòng)物中得到證實(shí)[20-22]

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)添加單一及復(fù)合乳酸菌的3個(gè)實(shí)驗(yàn)組和添加地衣芽孢桿菌+枯草芽孢桿菌+嗜酸乳酸菌+雙歧桿菌的實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比血清蛋白濃度顯著提高(P＜0.05),添加單一及復(fù)合芽孢桿菌的 3個(gè)實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相血清蛋白濃度略有提高,但差異不顯著(P＞0.05),說(shuō)明飼料中添加乳酸菌在提高大菱鲆幼魚(yú)血清蛋白濃度方面起主要作用。具體作用機(jī)理有待于進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究。

4 結(jié)論

在本實(shí)驗(yàn)條件下,飼料中添加益生菌,可通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)作用機(jī)制,維持大菱鲆幼魚(yú)腸道細(xì)菌平衡,顯著降低大菱鲆幼魚(yú)腸道中的弧菌總數(shù);飼料中添加了益生菌的實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比,各項(xiàng)免疫指標(biāo)均顯著提高,且復(fù)合益生菌的添加效果好于單一益生菌。這對(duì)于大菱鲆飼料中益生菌的添加有重要的指導(dǎo)作用。對(duì)于不同養(yǎng)殖條件下,益生菌的添加比例及效果還有待進(jìn)一步研究。

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