周文俊,鄭 立,韓笑天

(1.國(guó)家海洋局 第一海洋研究所 海洋生態(tài)研究中心,山東 青島,266061;2.中國(guó)科學(xué)院海洋研究所 海洋生態(tài)與環(huán)境科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,山東 青島 266071)

微藻因其富含脂類、蛋白質(zhì)和多糖,且具有光合作用效率高、生長(zhǎng)周期短、可再生等突出特點(diǎn),在食品、醫(yī)藥、保健品及生物能源領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用[1-2]。但是,如何通過(guò)人工大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)高效率地獲得微藻生物量是微藻資源開發(fā)利用的關(guān)鍵。現(xiàn)在的微藻培養(yǎng)技術(shù)多集中于光自養(yǎng)體系,包括戶外開放式養(yǎng)殖和各種光生物反應(yīng)器。然而,戶外的開放式養(yǎng)殖生產(chǎn)效率低、占地面積大且易染菌;光生物反應(yīng)器雖然具有無(wú)污染、培養(yǎng)條件可控、密度高、易收獲等優(yōu)點(diǎn)[3],但其又有建設(shè)費(fèi)用高、培養(yǎng)后期光合效率低[4]、生長(zhǎng)速度不夠快等不足之處。近年來(lái),針對(duì)目標(biāo)產(chǎn)物,逐漸興起了利用異養(yǎng)化技術(shù)進(jìn)行微藻的高細(xì)胞密度培養(yǎng)技術(shù),該技術(shù)可以克服戶外開放式養(yǎng)殖和光生物反應(yīng)器培養(yǎng)的諸多缺陷,具有生長(zhǎng)速度更快、能實(shí)現(xiàn)純種培養(yǎng)、單位體積產(chǎn)率高、便于自動(dòng)化控制等優(yōu)勢(shì)。因此,異養(yǎng)化培養(yǎng)技術(shù)成為近年來(lái)微藻培養(yǎng)研究的熱點(diǎn)。然而,微藻異養(yǎng)化也存在諸如目標(biāo)產(chǎn)物含量低、產(chǎn)出成本高、大規(guī)模培養(yǎng)下如何控制雜菌污染等技術(shù)瓶頸尚待突破,針對(duì)這些問(wèn)題,作者對(duì)微藻異養(yǎng)化過(guò)程中的影響因素及關(guān)鍵技術(shù)的研究進(jìn)展進(jìn)行介紹和總結(jié),并就如何突破瓶頸提出了可能的方法。

1 微藻異養(yǎng)化技術(shù)的應(yīng)用現(xiàn)狀

微藻異養(yǎng)化培養(yǎng)一般是指在培養(yǎng)設(shè)備中讓微藻利用添加在培養(yǎng)基中的有機(jī)碳源和(或)有機(jī)氮源而不依賴于光照進(jìn)行生長(zhǎng)增殖的過(guò)程 ,以達(dá)到較高的細(xì)胞密度和較大的生物量。當(dāng)前,微藻異養(yǎng)化培養(yǎng)已經(jīng)進(jìn)入了一個(gè)從單純的實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)研究到大批量產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)應(yīng)用的過(guò)渡階段。據(jù)國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道[5-6]已有涉及藍(lán)藻門、隱藻門、甲藻門、金藻門、黃藻門、硅藻門、裸藻門和綠藻門等8門60多屬的近百種微藻可以進(jìn)行異養(yǎng)生長(zhǎng), 其中某些微藻經(jīng)過(guò)優(yōu)化培養(yǎng)后,其生物量或有用生化產(chǎn)物得到了較大的提高,如普通小球藻(Chlorella vulgaris)批量異養(yǎng)發(fā)酵后的平均生物量可達(dá) 46.8 g/L[7],清華大學(xué)的吳慶余等[8]通過(guò)葡萄糖的批式流加培養(yǎng)的異養(yǎng)原始小球藻(C.protothecoides),生物量超過(guò)了100 g/L。這些異養(yǎng)微藻很多都已用于產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn),其應(yīng)用價(jià)值主要表現(xiàn)在兩個(gè)方面：作為水產(chǎn)餌料和提取生化產(chǎn)物,其中尤以后者備受關(guān)注,如用于生產(chǎn)多不飽和脂肪酸(PUFAs)、生物色素以及微藻多糖等。二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA)是異養(yǎng)微藻PUFAs中的主要成分,它們具有獨(dú)特的生理功能,可預(yù)防心血管疾病、提高人體免疫機(jī)能,利用異養(yǎng)微藻來(lái)提取生產(chǎn)EPA和 DHA可以克服傳統(tǒng)從深海魚油中提取在原料來(lái)源、生產(chǎn)成本以及季節(jié)限制等方面的不足。如美國(guó)Martek公司利用大規(guī)模的工業(yè)化發(fā)酵異養(yǎng)培養(yǎng)微藻來(lái)生產(chǎn) DHA成品,成為該行業(yè)的佼佼者[9]。微藻生物色素和微藻多糖等在醫(yī)療、食品以及保健等方面也已經(jīng)形成了產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn),如具有抗衰老、抗突變能力的 β-胡蘿卜素,具有強(qiáng)抗氧化能力的蝦青素等[10]。另一方面,異養(yǎng)微藻所富含的脂肪酸也是生產(chǎn)環(huán)保型能源生物柴油的重要來(lái)源,如何提高藻細(xì)胞的產(chǎn)油率以及通過(guò)何種工藝更有效地將其轉(zhuǎn)化為廉價(jià)的生物柴油成為近年來(lái)研究的熱點(diǎn)[11-13]?？姇粤岬葟漠愷B(yǎng)小球藻中提取大量油脂,經(jīng)酯交換反應(yīng)后獲得生物柴油,其各項(xiàng)指標(biāo)特征與傳統(tǒng)柴油相當(dāng),具有很高的應(yīng)用價(jià)值[14]。

2 微藻異養(yǎng)化的影響因素

2.1 微藻自身因素

微藻能否異養(yǎng),最主要的因素是該株藻是否具備完善的吸收利用胞外有機(jī)碳和有機(jī)氮的機(jī)制。吳耀庭等[10]根據(jù)Gladue的理論以及近年來(lái)的研究結(jié)果,總結(jié)完善了三條假說(shuō)：(1)通透性障礙。有些微藻因?yàn)橛袡C(jī)物難以透過(guò)細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞或者缺乏濃縮有機(jī)物的能力而不能被異養(yǎng);(2)相關(guān)酶的缺乏。有機(jī)物在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行代謝所需的酶系統(tǒng)不完善,有機(jī)物不能被有效利用,造成某些微藻難以異養(yǎng);(3)限制性的呼吸能力。在異養(yǎng)條件下,某些微藻因呼吸作用所提供的能量不足以維持其生長(zhǎng)而不能異養(yǎng)。

目前,關(guān)于微藻異養(yǎng)這一相當(dāng)復(fù)雜的過(guò)程,其機(jī)理尚未得到系統(tǒng)而確切的解析。僅以一株圓心目硅藻(Melosira nummuloides)對(duì)有機(jī)氮源氨基酸的攝取為例,已經(jīng)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞中至少有堿性、酸性和中性氨基酸的三種不同轉(zhuǎn)運(yùn)體系,而其中涉及中性氨基酸吸收的載體也遠(yuǎn)不止一個(gè)[15]。所以,一株可異養(yǎng)微藻,其藻細(xì)胞濃縮有機(jī)物能力的大小、酶的工作效率以及呼吸作用的強(qiáng)度等這些復(fù)雜的因素都對(duì)該株藻的異養(yǎng)效率有直接影響。

2.2 生物因素

影響微藻異養(yǎng)的生物因素主要指存在于藻液中的細(xì)菌和真菌。在光照自養(yǎng)條件下,由于藻液中缺乏充分的有機(jī)營(yíng)養(yǎng)源,所以真菌和細(xì)菌不會(huì)大量繁殖和生長(zhǎng),它們只能通過(guò)利用微藻代謝或死亡所產(chǎn)生的微量有機(jī)物和有機(jī)碎屑而與微藻形成一種共生關(guān)系。但在異養(yǎng)條件下,與微藻共生的細(xì)菌或真菌將利用人為添加的有機(jī)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)行大量繁殖,一方面,它們與微藻形成營(yíng)養(yǎng)競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系,另一方面,它們的代謝產(chǎn)物可能對(duì)微藻具有抑制或殺傷作用[16],從而影響微藻的異養(yǎng)效率,甚至致使其不能生長(zhǎng)繁殖。所以,在對(duì)微藻進(jìn)行異養(yǎng)之前首先要除去微藻中的細(xì)菌和真菌,以防止它們對(duì)微藻異養(yǎng)化生長(zhǎng)的影響。

2.3 營(yíng)養(yǎng)因素

2.3.1 碳源

微藻的異養(yǎng)生長(zhǎng)需要從外界攝取大量有機(jī)碳。有機(jī)碳的種類繁多,但可以作為微藻異養(yǎng)化的碳源卻不多,它們主要是糖類、醋酸鹽以及有機(jī)酸等,其中以糖類居多。de Swaaf等[17]人用葡萄糖作為碳源成功異養(yǎng)了寇氏隱甲藻(Crypthecodinium cohnii),并使異養(yǎng)生物量的最大值高達(dá)83g/L,遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其光合自養(yǎng)時(shí)的生物量。平滑菱形藻(Nitzschia laevis)、綠球藻(Chlorococcumsp)．以及亞心形扁藻(Platymonas subcordiformis)等都可以利用葡萄糖作為碳源進(jìn)行異養(yǎng)生長(zhǎng),并且均可達(dá)到較高的生物量[18-20]。尹建云等[7]利用玉米淀粉經(jīng)過(guò)高溫淀粉酶和糖化酶雙酶解后所產(chǎn)生的酶解糖來(lái)替代葡萄糖作為碳源,實(shí)現(xiàn)了普通小球藻Chlorella vulgaris高密度大批量的試驗(yàn)性異養(yǎng)生產(chǎn)。除了使用單一碳源的方式外,研究人員也通過(guò)添加復(fù)合碳源來(lái)異養(yǎng)培養(yǎng)微藻?？姇粤岬萚21]在異養(yǎng)培養(yǎng)原始小球藻(C.Protothecoides) 時(shí)以葡萄糖、淀粉、有機(jī)廢水和二氧化碳等作為復(fù)合碳源,既實(shí)現(xiàn)了微藻的高密度培養(yǎng),又節(jié)省了異養(yǎng)成本,同時(shí),對(duì)廢物的再利用也減輕了對(duì)環(huán)境的壓力。

選用何種有機(jī)碳源進(jìn)行微藻異養(yǎng)化取決于微藻的種類、異養(yǎng)化生產(chǎn)的終產(chǎn)物以及碳源成本等。例如在異養(yǎng)寇氏隱甲藻時(shí),葡萄糖和醋酸均可作為碳源,但為了提高不飽和脂肪酸 DHA的產(chǎn)率,以醋酸作為碳源則更合適,其DHA的產(chǎn)率可以達(dá)到1.152 g/(L·d),高于葡萄糖作為碳源時(shí)的產(chǎn)率[22]。

2.3.2 氮源

氮素是微藻生長(zhǎng)所必須的基本元素之一,也是藻體內(nèi)合成蛋白質(zhì)、核酸以及葉綠素等的主要成分。可作為微藻異養(yǎng)化的氮源較多,包括氨氮、銨態(tài)氮、硝態(tài)氮等無(wú)機(jī)氮源和尿素、酵母浸出粉、胰蛋白胨以及氨基酸等有機(jī)氮源。不同藻種對(duì)不同種類和形態(tài)的氮源的吸收利用各異,并直接影響微藻的生長(zhǎng)狀況、細(xì)胞內(nèi)飽和脂肪酸與不飽和脂肪酸的含量與比例以及胞外代謝產(chǎn)物的形成等[23,24]。在使用單一氮源時(shí),有人比較了硝酸鹽、銨鹽和尿素對(duì)異養(yǎng)原始小球藻Chlorella protothecoides的生物量和葉黃素含量的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn),當(dāng)三者氮質(zhì)量濃度為0.85～1.7g/L時(shí),它們對(duì)微藻生長(zhǎng)的影響沒(méi)有顯著差異,氮質(zhì)量濃度為1.7 g/L時(shí)可分別獲得最大生物量為18.4、18.9、19.6 g/L細(xì)胞干質(zhì)量[25]。在使用復(fù)合氮源異養(yǎng)培養(yǎng)平滑菱形藻時(shí),硝酸鹽、胰蛋白胨和酵母浸出粉的混合物可作為最佳氮源,當(dāng)質(zhì)量濃度分別為0.62、1.6、0.8 g/L時(shí),微藻的生物量、EPA含量及其產(chǎn)量分別可達(dá)到 6.48 g/L、2.74%和 175 mg/L[26]。

一般而言,氮源濃度的增加提高了蛋白質(zhì)的含量,但降低了脂類和碳水化合物的含量[27]。因此,為了既使微藻能夠有充足的碳源來(lái)吸收合成生長(zhǎng)代謝所需的糖類物質(zhì)和儲(chǔ)存能量的脂類物質(zhì),又不至于因?yàn)榈吹膮T乏或過(guò)量而影響蛋白的合成,在高細(xì)胞密度、高目標(biāo)產(chǎn)物產(chǎn)率的異養(yǎng)培養(yǎng)中很有必要考察培養(yǎng)基中初始的C/N比。Chen等[29]研究了C/N比對(duì)異養(yǎng)群孢小球藻(Chlorella sorokiniana) 生長(zhǎng)和生化產(chǎn)物含量的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn)C/N比值為20時(shí)是其從受碳限制向氮限制轉(zhuǎn)變的一個(gè)拐點(diǎn),此時(shí)細(xì)胞的脂質(zhì)含量最低。當(dāng) C/N比增大或者減小都會(huì)使細(xì)胞脂質(zhì)含量增加,較低的 C/N比有利于提高三烯脂肪酸的含量[28]。張麗君等在對(duì)普通小球藻的異養(yǎng)培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化時(shí)則發(fā)現(xiàn)C/N比在4：1～5：1時(shí)可以獲得最大的生物量。

2.3.3 磷源

磷是細(xì)胞中基因結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ),并在生命活動(dòng)中以ATP和ADP的形式對(duì)能量的產(chǎn)生、轉(zhuǎn)換和儲(chǔ)藏起到關(guān)鍵作用。磷脂是細(xì)胞中多不飽和脂肪酸的主要存在形式,因此培養(yǎng)基中磷素的水平將顯著影響微藻細(xì)胞內(nèi)多不飽和脂肪酸的含量,如0.3～30 mmol/L的磷有利于紫球藻(Porphyridium purpureum) 的生長(zhǎng)及其 EPA的積累[30],但這僅限于自養(yǎng),微藻異養(yǎng)常用磷酸鹽為磷源,但目前國(guó)內(nèi)外尚沒(méi)有關(guān)于不同磷濃度對(duì)異養(yǎng)微藻的生長(zhǎng)和生化成分的影響的研究報(bào)道。

2.4 環(huán)境因素

2.4.1 溫度

微藻異養(yǎng)過(guò)程中,溫度過(guò)高或過(guò)低都將影響與生長(zhǎng)、合成以及代謝相關(guān)酶的活性,從而降低完成該過(guò)程的效率。對(duì)于異養(yǎng)普通小球藻,其適宜溫度范圍較大,在一定范圍內(nèi)升高溫度可以提高藻細(xì)胞的比生長(zhǎng)速率,并獲得較高的生物量[31]。而低溫則有利于微藻細(xì)胞多不飽和脂肪酸(PUFAs)的積累,如Stephen等[32]發(fā)現(xiàn)雖然溫度對(duì)于異養(yǎng)隱匿小環(huán)藻(Cyclotella cryptica)的總脂含量沒(méi)有明顯的影響,但隨著溫度的降低,不飽和脂肪酸和飽和脂肪酸的比值卻在增大。同樣,異養(yǎng)寇氏隱甲藻在低溫時(shí)雖然生長(zhǎng)較慢,但其DHA含量卻比高溫時(shí)要高[33]。在生產(chǎn)過(guò)程中為了獲得較高的 PUFAs產(chǎn)量,可以在最適生長(zhǎng)溫度下培養(yǎng)一定時(shí)間以獲得較高的生物量,然后在合適的低溫下繼續(xù)培養(yǎng)以積累較高的PUFAs[34]。

2.4.2 pH

pH的變化將影響微藻細(xì)胞內(nèi)外的酸堿環(huán)境、離子的平衡以及膜結(jié)構(gòu)的滲透性等,pH過(guò)高或過(guò)低都將抑制微藻的生長(zhǎng)。由于微藻在生長(zhǎng)的過(guò)程中可能會(huì)產(chǎn)生一些代謝產(chǎn)物或者是由于攝取了培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)成分而使培養(yǎng)基的pH發(fā)生改變,所以需要不斷補(bǔ)料調(diào)整 pH使其處于一個(gè)穩(wěn)定的適宜微藻生長(zhǎng)的狀態(tài)。異養(yǎng)普通小球藻可以通過(guò)自身的吸收或代謝,在一段時(shí)間內(nèi)將pH調(diào)整到最適值8.5左右,為了消除堿性培養(yǎng)基滅菌后顏色加深對(duì)觀察帶來(lái)的影響,初始pH最好選擇在6～7之間[29]。此外,pH的變化也會(huì)影響微藻細(xì)胞的脂肪酸含量及其組成。有人在研究異養(yǎng)寇氏隱甲藻時(shí)發(fā)現(xiàn),當(dāng)培養(yǎng)基的pH為7.2時(shí)細(xì)胞增長(zhǎng)率最高,并可獲得最大的脂肪酸不飽和度和最高的DHA含量,當(dāng)初始pH分別為4和10時(shí)細(xì)胞增長(zhǎng)相當(dāng)緩慢,脂肪酸不飽和度也隨之降低[35]。

2.4.3 溶氧量

微藻在異養(yǎng)培養(yǎng)的過(guò)程中需要攝取大量的氧進(jìn)行呼吸作用產(chǎn)生能量,以維持細(xì)胞內(nèi)正常的生命活動(dòng),如果培養(yǎng)基中溶氧不足將會(huì)影響微藻的生長(zhǎng)和繁殖。通氣量大小應(yīng)與藻密度保持一致,如尹建云等在異養(yǎng)發(fā)酵普通小球藻時(shí)藻細(xì)胞生物量隨著通氣量的增加而增加,通過(guò)階段性的增大通氣量可獲得最大生物量[7]。此外,溶氧量還會(huì)影響藻細(xì)胞中脂類的含量及組成。Chen等[28]研究發(fā)現(xiàn),當(dāng)通氣量加大時(shí)會(huì)促進(jìn)異養(yǎng)群孢小球藻的生長(zhǎng),并有利于不飽和脂肪酸的合成,但脂類的總量將會(huì)下降。這可能是因?yàn)樵诘腿苎趿康臈l件下細(xì)胞內(nèi)脂類代謝較慢,所以其積累量較多,但由于缺乏氧分子參與脂肪酸脫氫酶的作用,使得脂肪酸的不飽和度較低;而增加溶氧量可使脂類代謝加快、積累量降低,但有利于不飽和脂肪酸的合成,所以脂肪酸的不飽和程度明顯增高。

2.4.4 鹽度

鹽度對(duì)微藻的異養(yǎng)生長(zhǎng)和細(xì)胞生化成分也具有一定的影響,如異養(yǎng)培養(yǎng)平滑菱形藻時(shí),氯化鈉質(zhì)量濃度為14 g/L時(shí)最適其EPA的生成,氯化鈉質(zhì)量濃度為8 g/L時(shí)則最適其生長(zhǎng)[36]。目前,關(guān)于鹽度對(duì)微藻異養(yǎng)的影響,尚沒(méi)有深入而全面的研究,這主要是因?yàn)楝F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)的可異養(yǎng)藻株多為淡水種,在以提高生物量和有用生化成分為目的的研究中并未將鹽度這一脅迫因素考慮在內(nèi),但在以后研究海洋異養(yǎng)藻株時(shí)應(yīng)充分考慮此因素的作用。

3 微藻異養(yǎng)化關(guān)鍵技術(shù)

3.1 微藻無(wú)菌化處理

在對(duì)微藻進(jìn)行異養(yǎng)培養(yǎng)前必須先獲得無(wú)菌藻株。傳統(tǒng)的物理方法如離心洗滌法、毛細(xì)吸管法和稀釋涂布法等都難以獲得完全無(wú)菌的藻株[37]。射線輻照法,即利用微藻和雜菌對(duì)紫外等射線抗性的差異而選用合適的輻照對(duì)藻液進(jìn)行處理雖可除去雜菌,但由于輻照對(duì)微藻的生理特性具有很明顯的影響[38],所以該法只適用于一些抗輻照能力較強(qiáng)的具膠質(zhì)鞘微藻。

目前,微藻的無(wú)菌藻株一般是通過(guò)化學(xué)方法獲得的?；瘜W(xué)方法主要是指抗生素法,即利用抗生素的抑菌或殺菌作用將藻液中的雜菌除去。但抗生素也會(huì)對(duì)微藻的細(xì)胞形態(tài)、生理特性以及生化成分造成影響,所以用于除菌的抗生素應(yīng)具備兩個(gè)特點(diǎn)：較強(qiáng)的抑菌或殺菌能力和對(duì)微藻較小的傷害性[39]。不同的微藻種類其雜菌群落不同,所以選擇的抗生素種類和給藥濃度也不同。常用的抗生素有青霉素、卡那霉素、鏈霉素、慶大霉素以及氯霉素等。單種抗生素給藥往往難以完全除菌,所以通常將若干種抗生素聯(lián)合使用以達(dá)到更好的除菌效果。林偉用青霉素等五種抗生素對(duì)若干種微藻進(jìn)行無(wú)菌化處理,抗生素濃度從50 IU/mL到1000 IU/mL,單獨(dú)或混合給藥,最終獲得了中肋骨條藻(Skeletonema costatum) 、微小原甲藻(Prorocentrum minimum)、錐狀斯克利普藻(Scrippsiella trochoidea)、前溝藻(Amphidiniumsp．)和扁藻(Platymonassp.)的無(wú)菌藻株[40]。由于上面這些抗生素都是針對(duì)細(xì)菌的,而藻液中往往存在一些真菌或其孢子,使用兩性霉素 B可有效地除去[41]。作者在無(wú)菌化處理球等鞭金藻(Isochrysis galbana)時(shí)發(fā)現(xiàn)用鏈霉素、青霉素以及卡那霉素聯(lián)合處理后雖可除去藻液中的細(xì)菌,但仍有真菌存在,在使用兩性霉素 B進(jìn)行后繼處理之后最終獲得無(wú)菌藻株。另外,還可使用某些化學(xué)消毒劑(如次氯酸鈉等)殺滅細(xì)菌,但由于這些化學(xué)消毒劑對(duì)微藻細(xì)胞傷害很大[37],所以一般很少使用。

物理方法對(duì)藻細(xì)胞傷害小但除菌效果不理想,化學(xué)方法除菌較為理想但對(duì)藻細(xì)胞有影響,所以可以將物理方法和化學(xué)方法適當(dāng)?shù)慕Y(jié)合起來(lái)以減小對(duì)藻株的影響。經(jīng)過(guò)無(wú)菌化處理的藻株,可以采用培養(yǎng)檢測(cè)法和熒光染色鏡檢法來(lái)進(jìn)行檢測(cè)[40],確定是否達(dá)到除菌目的。

3.2 微藻異養(yǎng)化改造

3.2.1 通過(guò)異養(yǎng)培養(yǎng)條件進(jìn)行微藻的篩選

雖然有文獻(xiàn)報(bào)道在富營(yíng)養(yǎng)化廢水中篩選到可異養(yǎng)的小球藻[42],但異養(yǎng)型微藻藻株主要是通過(guò)對(duì)大量藻種于異養(yǎng)條件下進(jìn)行篩選而獲得的。Gladue等[5]用添加了適量葡萄糖的異養(yǎng)培養(yǎng)基在黑暗條件下培養(yǎng)微藻,最終從大量藻株中篩選出57株具有異養(yǎng)能力的微藻。但那些未篩選出來(lái)的藻株未必一定不能異養(yǎng),因?yàn)楹茈y確定它們是否能利用除實(shí)驗(yàn)中所添加的葡萄糖之外的其他有機(jī)碳源進(jìn)行生長(zhǎng)。Gladue給出了3個(gè)微藻異養(yǎng)培養(yǎng)基配方(表1),被認(rèn)為是目前用于異養(yǎng)培養(yǎng)的較好配方。但由于藻種的差異,在具體操作時(shí)研究者可以再做優(yōu)化,如有機(jī)碳源的種類和添加量。筆者在培育異養(yǎng)化的海洋小球藻時(shí)發(fā)現(xiàn)一次添加的有機(jī)碳源如果過(guò)多(＞15g/L)則會(huì)抑制微藻的生長(zhǎng),可少量多次(每次 5g/L)添加以提高微藻對(duì)有機(jī)碳源的利用率。

3.2.2 利用生物工程手段進(jìn)行異養(yǎng)化改造

除了通過(guò)異養(yǎng)化條件篩選異養(yǎng)藻株外,近年來(lái)國(guó)內(nèi)外的研究人員都在嘗試通過(guò)生物工程手段來(lái)改造微藻,以期獲得更為理想的異養(yǎng)型藻株。

異養(yǎng)化改造的原因是原微藻雖然目標(biāo)產(chǎn)物含量很高,但不可異養(yǎng)或異養(yǎng)效率不高,難以達(dá)到高密度培養(yǎng)。對(duì)于這種情況,有報(bào)道利用細(xì)胞融合技術(shù)將光合自養(yǎng)微藻和某種細(xì)菌或其他可異養(yǎng)微藻進(jìn)行細(xì)胞融合,以得到一種新的可異養(yǎng)的藻株。沈繼紅等[43]將富含EPA和 DHA的自養(yǎng)微藻綠色巴夫藻和生長(zhǎng)迅速的異養(yǎng)微藻四鞭藻相融合,篩選出了可異養(yǎng)的融合藻株,融合藻株的總脂、EPA和DHA均比異養(yǎng)親本四鞭藻有較大的提高。此外,還可以根據(jù)限制微藻異養(yǎng)的遺傳因素來(lái)改造微藻基因,如 Zaslavskaia等[44]將編碼葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體的基因?qū)胍恢暝静荒苓M(jìn)行異養(yǎng)生長(zhǎng)的三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutum)的細(xì)胞中,便可使其在黑暗條件下利用外源葡萄糖進(jìn)行異養(yǎng)生長(zhǎng)。陳濤等[45]從人胎盤組織中克隆出人紅細(xì)胞葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)基因(Glut1),并分別構(gòu)建了鹽藻誘導(dǎo)型異養(yǎng)表達(dá)載體pMDDGN-Bar和組成型異養(yǎng)表達(dá)載體 G5Glut1-Bar,通過(guò)電擊轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化鹽藻,最終使Glut1得到表達(dá),這為鹽藻的進(jìn)一步異養(yǎng)化培養(yǎng)打下了基礎(chǔ)。

表1 微藻異養(yǎng)培養(yǎng)基[5]

3.3 微藻異養(yǎng)化培養(yǎng)形式

對(duì)異養(yǎng)微藻進(jìn)行高密度培養(yǎng)主要有兩種形式,一是利用改進(jìn)的密閉式光生物反應(yīng)器進(jìn)行兼養(yǎng),二是直接利用微生物發(fā)酵罐進(jìn)行無(wú)光異養(yǎng)。所謂兼養(yǎng)是指微藻在有光照的條件下既可以利用培養(yǎng)基中的有機(jī)碳源進(jìn)行異養(yǎng)生長(zhǎng),又可以利用光照進(jìn)行光合作用,一般而言,可異養(yǎng)微藻都可兼養(yǎng)生長(zhǎng)。某些微藻種類在兼養(yǎng)時(shí)其生物量遠(yuǎn)大于自養(yǎng)和無(wú)光異養(yǎng)時(shí)的生物量,如卡德藻(Tetraselrnissp.)在兼養(yǎng)時(shí)的最大細(xì)胞密度可以達(dá)到自養(yǎng)時(shí)的3.2倍,大于自養(yǎng)和無(wú)光異養(yǎng)最大細(xì)胞密度之和[46]。密閉式光生物反應(yīng)器主要有管式、平板式以及柱狀氣升式等幾種形式,目前尚處于發(fā)展階段,在材料、設(shè)計(jì)以及條件控制方面還存在技術(shù)上的難題。相對(duì)而言,利用微生物發(fā)酵罐技術(shù)進(jìn)行無(wú)光異養(yǎng)則較為成熟,發(fā)酵體積可達(dá)數(shù)十噸,容易使異養(yǎng)微藻形成產(chǎn)業(yè)化大批量生產(chǎn),如國(guó)內(nèi)的尹建云等[7]、吳慶余等[7]將發(fā)酵罐培養(yǎng)技術(shù)應(yīng)用于異養(yǎng)微藻的培養(yǎng),達(dá)到了較高的藻密度,美國(guó)的Martek公司也使用發(fā)酵罐培養(yǎng)異養(yǎng)微藻實(shí)現(xiàn)了DHA成品的生產(chǎn)[9]。

4 微藻異養(yǎng)化發(fā)展的限制因素及幾點(diǎn)建議

經(jīng)過(guò)科研人員的不懈努力,微藻異養(yǎng)化已從單純的實(shí)驗(yàn)室研究逐步向產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)轉(zhuǎn)化,并已在相關(guān)領(lǐng)域取得了顯著的成果,但要實(shí)現(xiàn)微藻異養(yǎng)的產(chǎn)業(yè)化,仍然存在以下的瓶頸：(1) 可異養(yǎng)化或異養(yǎng)效果好的藻種依然很有限。已記載的可異養(yǎng)的微藻已達(dá)近百種,但真正能高效異養(yǎng)的卻僅限于綠藻門的小球藻屬、硅藻門的小環(huán)藻屬以及甲藻門隱甲藻屬等少數(shù)幾種藻類;(2) 異養(yǎng)化培養(yǎng)周期長(zhǎng),耗時(shí)耗力。當(dāng)前異養(yǎng)微藻發(fā)酵培養(yǎng)的一個(gè)培養(yǎng)周期為 5天左右,僅比自養(yǎng)培養(yǎng)周期縮短了一半,而一般的異養(yǎng)微生物培養(yǎng)周期只有1到2天,所以異養(yǎng)微藻培養(yǎng)周期還有待縮短;(3) 異養(yǎng)化微藻密度不夠大。異養(yǎng)發(fā)酵時(shí)藻生物量的理論最大值為150～200 g/L[10],但目前發(fā)表的文獻(xiàn)中最大值也只有 108 g/L[8],所以異養(yǎng)微藻的生物量還有待提高;(4) 高密度異養(yǎng)對(duì)氧的需求往往成為發(fā)酵過(guò)程能否成功的關(guān)鍵因素。在高密度下培養(yǎng)基黏度很大,溶氧很困難,能耗很高;(5) 異養(yǎng)化生產(chǎn)成本高,主要是異養(yǎng)碳源價(jià)格較高,使得異養(yǎng)化生產(chǎn)的目的只能針對(duì)高附加值產(chǎn)品。另外,在目前的研究中只重視碳源的最佳濃度,而對(duì)其利用率缺少考察,碳源的過(guò)度添加將造成物料的浪費(fèi)和成本的增加。

針對(duì)以上限制因素,作者提出下面幾點(diǎn)建議：

(1) 利用當(dāng)前先進(jìn)的基因工程和原生質(zhì)融合手段開發(fā)異養(yǎng)型工程微藻;(2) 設(shè)計(jì)更有效的異養(yǎng)微藻生物反應(yīng)器,采用合理的培養(yǎng)形式,以提高生產(chǎn)效率;(3) 優(yōu)化培養(yǎng)條件,探實(shí)合適生長(zhǎng)的理化因子,深入研究生化產(chǎn)物的積累特點(diǎn),提高目標(biāo)產(chǎn)物的含量;(4) 為解決高密度培養(yǎng)時(shí)溶氧難的問(wèn)題,需研究開發(fā)低能耗的氣液混合強(qiáng)化器,并將其應(yīng)用于生物反應(yīng)器中;(5) 使用替代碳源,如玉米淀粉、甘蔗、秸稈以及工業(yè)廢水等,以降低異養(yǎng)成本。

相信隨著現(xiàn)代科技的突飛猛進(jìn),微藻異養(yǎng)化的研究也將步上一個(gè)新的臺(tái)階,并以其強(qiáng)大的應(yīng)用潛力惠及人類,造福社會(huì)。

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