金潔 樊明文 李宇紅

（1.杭州口腔醫(yī)院 牙體牙髓病科，杭州310006；2.口腔生物醫(yī)學工程教育部重點實驗室，武漢大學，武漢430079）

變異鏈球菌是齲病的主要致病菌，其表面蛋白（Streptococcus mutans surface protein，PAc）參與介導細菌對牙面的黏附[1]。研究[2]表明：攜帶PAc主要免疫活性區(qū)A-P片段的DNA防齲疫苗pCIA-P可有效誘導實驗動物的特異性免疫應答。目前的研究[3-4]認為：以DNA疫苗pCIA-P進行初次免疫，再用蛋白質疫苗PAc加強的策略可在較大程度上提高防齲疫苗的免疫效力。在“DNA初次免疫—蛋白質加強”免疫策略的研究中，大量高純度的PAc的獲取是整個研究的基礎。由于變異鏈球菌表面蛋白的天然產量低，提取步驟煩瑣，難以滿足需要[5]，所以用基因工程的方法大量生產無疑是最佳選擇。筆者對已成功表達重組PAc（recombinant PAc，rPAc）的工程菌pET20b（+）-AP/BL21（DE3）plysS的表達條件進行優(yōu)化，并用純化后的rPAc蛋白免疫BALB/c小鼠，制備抗rPAc多克隆抗體，為深入研究“DNA初次免疫—蛋白質加強”免疫策略奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 rPAc表達條件的優(yōu)化

在pH值分別為6.4、6.6、6.8、7.0、7.2、7.4的Luria-Bertani（LB）培養(yǎng)基（含100 μg·mL-1羧芐青霉素和34 μg·mL-1氯霉素）上接種pET20b（+）-AP/BL21（DE3）plysS工程菌[4]，37 ℃條件下培養(yǎng)，檢測光密度（optical density，OD）值達0.6（檢測波長600 nm）時，加入終濃度為1.0 mmol·L-1的異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（isopropyl β-D-1-thigalactopyranoside，IPTG），繼續(xù)培養(yǎng)4 h，同時設定工程菌的未誘導表達對照組。培養(yǎng)結束后，4 ℃離心收集菌體，冰浴下超聲波破碎，離心后取上清液，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分析培養(yǎng)基pH值對rPAc可溶性表達的影響，確定培養(yǎng)基的最佳pH值。固定其他條件，按照與上述研究類似的方法，分別設置IPTG濃度梯度（0.1、0.4、0.8、1.0、2.0 mmol·L-1）、時間梯度（1、2、3、4、5 h）、溫度梯度（18、24、28、30、37 ℃）、菌體密度梯度（OD600nm分別為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0）。SDS-PAGE檢測rPAc可溶性表達的結果，凝膠成像分析系統(tǒng)（UVP公司，美國）掃描電泳圖片，進行半定量分析，確定最優(yōu)表達條件。

1.2 rPAc的純化和鑒定

pET20b（+）-AP/BL21（DE3）plysS工程菌根據上述優(yōu)化條件進行大量誘導表達，結束后集菌，超聲波破碎，離心取上清液，經0.45 μm濾器過濾，上樣于Ni2+-NTA層析柱純化（按荷蘭Qiagen公司提供的Ni2+-NTA使用說明書進行），SDS-PAGE分析純化結果。UVP凝膠成像分析系統(tǒng)分析蛋白純度。rPAc純化產物的Western blot鑒定參照《分子克隆實驗指南》[6]進行，一抗為抗His-tag單克隆抗體，二抗為辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標記的羊抗鼠IgG。將鑒定正確的rPAc純化產物轉入超濾管中進行濃縮及除鹽，以牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）為標準蛋白，用Bradford法定量后冷凍干燥，分裝保存。

1.3 抗rPAc多克隆抗體的制備與鑒定

用約50 μg rPAc蛋白免疫BALB/c小鼠，免疫周期為0、14、28、42 d。第1次用弗氏完全佐劑，其余3次用弗氏不完全佐劑。第4次免疫1周后摘取眼球取血，離心分離血清，分裝后-80 ℃凍存?zhèn)溆?。將純化的rPAc交聯(lián)至Sepharose 4B（Pharmacia Biotech公司，美國），其操作步驟參見產品說明。然后將多抗血清用PBS稀釋后與交聯(lián)rPAc介質進行孵育，再用PBS洗脫未結合的蛋白，用甘氨酸-鹽酸緩沖液（pH為2.7）洗脫結合的抗體，并用Tris-HCl緩沖液（pH為9.0）將洗脫液中和至pH為7.3左右。酶聯(lián)免疫吸附測定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）法測定抗體效價。將純化后的rPAc行SDS-PAGE后轉移至硝酸纖維素膜上，分別用純化rPAc的多抗血清或抗His-tag單克隆抗體作為一抗，以HRP標記的羊抗鼠IgG為二抗，進行Western blot分析，方法同1.2。以免疫前的小鼠血清為陰性對照。

2 結果

2.1 rPAc表達條件的優(yōu)化

利用SDS-PAGE分析不同誘導表達條件下細菌裂解上清液中可溶性rPAc蛋白含量的變化，結果顯示：隨著IPTG濃度的增加，rPAc可溶性表達量逐漸加大，當IPTG濃度達1.0 mmol·L-1時達到峰值，此后不再明顯升高（圖1）。隨著誘導溫度、誘導時間、菌體密度及培養(yǎng)基pH值的增加，可溶性rPAc表達量呈現(xiàn)先升后降的趨勢，分別在誘導溫度30 ℃、誘導時間4 h、菌體密度OD600nm=0.6、pH=7.2時，rPAc的可溶性表達量達到最大（圖2～5）。

圖1 rPAc在不同IPTG濃度下的可溶性表達相對含量分析Fig 1 The soluble expression of rPAc under different concentrations of IPTG

圖2 rPAc在不同誘導溫度下的可溶性表達相對含量分析Fig 2 The soluble expression of rPAc under different inducing temperature

圖3 rPAc在不同誘導時間下的可溶性表達相對含量分析Fig 3 The soluble expression of rPAc under different inducing time

圖4 rPAc在不同菌體密度下的可溶性表達相對含量分析Fig 4 The soluble expression of rPAc under different growth density

圖5 rPAc在不同培養(yǎng)基pH值下的可溶性表達相對含量分析Fig 5 The soluble expression of rPAc under different medium pH

2.2 rPAc的純化和鑒定

SDS-PAGE分析顯示：純化后的rPAc在相對分子質量為8.5×104處呈單一條帶（圖6），和預期大小相符。經UVP凝膠成像分析系統(tǒng)掃描分析，其純度約為95%。采用Bradford法測定純化蛋白的質量濃度為0.1 mg·mL-1。Western blot結果顯示：純化后的rPAc在相對分子質量為8.5×104處出現(xiàn)陽性反應條帶，條帶清晰，無其他雜帶出現(xiàn)，特異性良好（圖7）。對照組無反應條帶出現(xiàn)。

2.3 抗rPAc多克隆抗體的制備與鑒定

免疫小鼠的多抗血清經ELISA分析，抗體效價為1∶6 000。Western blot分析結果見圖8?？箁PAc多克隆抗體和抗His-tag單克隆抗體在相對分子質量8.5×104大小處均出現(xiàn)特異性的單一陽性條帶，無其他可見雜帶出現(xiàn)；陰性對照無任何特異性反應條帶：說明免疫小鼠的血清經純化后制備的多克隆抗體可以與rPAc純蛋白結合并且特異性較好。

圖6 rPAc純化的SDS-PAGE分析Fig 6 The purified rPAc identification by SDS-PAGE

圖7 rPAc純化的Western blot分析Fig 7 The purified rPAc identification by Western blot

圖8 抗rPAc多克隆抗體的Western blot分析結果Fig 8 Western blot results of the anti-rPAc polyclonal antibody

3 討論

為了獲取大量高純度PAc，最大限度地提高rPAc可溶性表達量已經成為關注的重點?？扇苄员磉_的優(yōu)點為純化步驟簡單，蛋白獲得率較高，對蛋白活性影響小。對本研究來講，能否僅通過優(yōu)化各種已知的影響原核表達系統(tǒng)的相關因素來有效解決這一難題是首先應該采取的必要措施。為此，本研究針對影響rPAc可溶性表達的各種因素進行了較為系統(tǒng)的探索[7]。

溫度是影響目的蛋白在大腸桿菌中獲得高水平可溶性表達的重要因素。適合大腸桿菌生長的溫度為37～39 ℃，在此溫度下表達外源蛋白極易生成包涵體。較低的生長溫度能降低蛋白質合成的速率，使新合成的蛋白質有更充分的時間折疊，減少蛋白折疊中間體之間錯誤的相互作用，使得正確折疊的蛋白增加，有效地增加可溶性蛋白的表達量[8]；但培養(yǎng)溫度也有一個下限，一般為8～10 ℃，在此溫度以下，大腸桿菌將停止生長，蛋白也基本停止表達[9]。本實驗也證實了這一點：在18～37 ℃溫度梯度下，誘導溫度為30 ℃時，rPAc可溶性表達量達到最大。IPTG是一種有效的乳糖操縱子誘導劑，可競爭性地與阻遏蛋白結合，開放目標蛋白基因，使其得以轉錄[10]。本實驗采用不同濃度的IPTG進行誘導，結果顯示：隨著IPTG濃度的升高，rPAc可溶性表達量逐漸增加，但當IPTG濃度在1.0 mmol·L-1以上時，rPAc可溶性表達量不再發(fā)生明顯改變。這是因為當加入的IPTG量足以封閉所有阻遏蛋白位點時，其濃度即為理論上的最佳濃度。IPTG濃度過高可能會影響到細菌的生長，過低會因為濃度達不到與阻遏蛋白結合的飽和濃度而影響目標蛋白的表達。故以1.0 mmol·L-1為最佳IPTG濃度，該濃度不僅可以提高可溶性rPAc的表達量，而且可以降低成本。

菌體生長過度或過速都會加重工程菌合成系統(tǒng)的負擔，導致形成包涵體。本實驗的目的是蛋白的可溶性表達，故在實驗中考察誘導前細菌生長時間和誘導后細菌生長時間對融合蛋白表達的影響。誘導后細菌的生長時間隨不同的表達載體或啟動子而不同。對T7、Ptac和Plac等啟動子，一般僅需2～3 h。本實驗采用的表達載體是含有T7啟動子的pET表達載體。誘導時間過短會影響rPAc的積累量；誘導時間過長，可溶性rPAc積累量超過一定限度，細菌為了保護自身，減少外源蛋白對其自身的毒性，從而啟動包涵體的形成機制，可溶性rPAc表達量隨之減少[11]。在本實驗1～5 h的時間梯度中，IPTG誘導rPAc可溶性表達的最佳時間為4 h。同時，本實驗還發(fā)現(xiàn)：在IPTG誘導前，菌體密度的OD600nm對后續(xù)rPAc可溶性表達量也有很大影響。大腸桿菌在OD600nm=0.6時，基本進入對數(shù)生長期，菌體生長旺盛，增殖快；對誘導表達而言，此時易于誘導合成外源蛋白。此外，IPTG的加入以及表達產物的增加對菌體生長是有影響的，所以應選在生長最旺盛的時期進行誘導表達。提前誘導菌體太少，外源蛋白產量低；而誘導太遲則細菌過老，也不利于基因表達。因此在本實驗菌體密度OD600nm為0.2～1.0的梯度范圍內，OD600nm=0.6時誘導獲得可溶性蛋白量最多。

培養(yǎng)基pH值對提高大腸桿菌中重組蛋白可溶性表達有明顯影響，需要根據菌體和重組蛋白的特點選擇合適的pH值。一般來說，pH值距重組蛋白等電點越遠，表達的蛋白產物就越不容易形成包涵體（rPAc的等電點約是5.55）。李會成等[12]發(fā)現(xiàn)：所用工程菌的細胞生長期的最適pH值為6.8～7.4，基因表達的最適pH值為6.0～6.5。據此本實驗培養(yǎng)基pH值的選擇范圍為6.4～7.4，結果表明：當pH值為7.2時rPAc可溶性表達量最高。

根據本實驗結果，可以確定rPAc可溶性表達的最佳條件為：pH=7.2的LB培養(yǎng)基、細菌起始密度OD600nm=0.6時，用1.0 mmol·L-1的IPTG 30 ℃誘導培養(yǎng)4 h。本實驗不僅篩選出rPAc的最佳表達條件，而且每一項因素均設置了多個變化點，繪制了rPAc表達量隨不同誘導條件變化的曲線，這樣在實際表達過程中，可以根據實驗的經濟性原則選擇最佳的表達條件。雖然本文對影響rPAc可溶性表達因素的單因子作了大量的工作，但rPAc可溶性表達的工藝比較復雜，僅僅對溫度、pH值等影響因素單獨地加以考慮是不夠的，因為各種因素之間有協(xié)同和（或）抵消作用，需要對它們進行綜合考慮。下一步還需要應用能夠綜合反映各種因素水平間交互作用的正交設計等方法，進一步優(yōu)化可溶性蛋白制備的工藝處方。

目前聯(lián)合免疫策略增強防齲DNA疫苗免疫效應的機制并不明確，有待于進一步研究以促進防齲疫苗的發(fā)展。為了研究聯(lián)合免疫策略以何種方式來增強DNA疫苗的免疫效應，筆者需要觀察目的抗原基因在細胞內的表達定位及遞呈作用過程，這些研究工作都需要高效價、高特異性的抗體。為了滿足這一需求，筆者以純化的rPAc免疫小鼠后，經親和層析獲得理想的抗rPAc抗體。Western bolt分析顯示本實驗所制備的抗體雖然是多克隆抗體，但是仍有很高的特異性，可以為今后深入探索“DNA初次免疫—蛋白質加強”免疫機制提供必要的工具。

[1]詹玲． 變形鏈球菌對牙面粘附機理的研究進展[J]． 牙體牙髓牙周病學雜志,1995,5（4）：240-242．

Zhan Ling.Study on the adhesion of Streptococcus mutans to teeth surface[J].Chin J Conserv Dent,1995,5（4）：240-242．

[2]張睿,樊明文,邊專,等． DNA防齲疫苗誘導長期免疫反應及機制初探[J]． 武漢大學學報：醫(yī)學版,2008,29（2）：268-271．

Zhang Rui,Fan Mingwen,Bian Zhuan,et al.Experiment study of anti-carious vaccine inducing long-term immune responses and the mechanism[J].Medical J Wuhan University,2008,29（2）：268-271．

[3]張睿,樊明文,彭彬,等.DNA防齲疫苗聯(lián)合蛋白質疫苗誘導小鼠免疫應答的研究[J].口腔醫(yī)學研究,2008,24（3）：245-247.

Zhang Rui,Fan Mingwen,Peng Bin,et al.Study of immune response to the combined DNA vaccine and protein vaccine against caries in mice[J].J Oral Sci Res,2008,24（3）：245-247.

[4]Li Y,Jin J,Yang Y,et al.Enhanced immunogenicity of an anticaries vaccine encoding a cell-surface protein antigen of Streptococcus mutans by intranasal DNA prime-protein boost immunization[J].J Gene Med,2009,11（11）：1039-1047.

[5]謝佐理,岳松齡.變形鏈球菌185-SA表面蛋白抗原的提取與鑒定[J].廣東牙病防治,1999,7（1）：26-28.

Xie Zuoli,Yue Songling.Purification and characterization of 185 kD surface protein antigen from Streptococcus mutans[J].J Dent Prevent Treat,1999,7（1）：26-28.

[6]薩姆布魯克J,拉塞爾DW.分子克隆實驗指南[M].黃培堂,譯.3版.北京：科學出版社,2002：1723-1726.

Sambrook J,Russell DW.Molecular cloning[M].Translated by Huang Peitang.3rd ed.Beijing：Science Press,2002：1723-1726.

[7]Tsunoda Y,Sakai N,Kikuchi K,et al.Improving expression and solubility of rice proteins produced as fusion proteins in Escherichia coli[J].Protein Expr Purif,2005,42（2）：268-277.

[8]Ptitsyn OB.Kinetic and equilibrium intermediates in protein folding[J].Protein Eng,1994,7（5）：593-596.

[9]戴旭芳,連繼勤,張玉靜,等.人LNα4鏈LG3-4組件的優(yōu)化表達及活性檢測[J].中國生物制品學雜志,2006,19（2）：194-196.

Dai Xufang,Lian Jiqin,Zhang Yujing,et al.Optimization of expression of human laminin alpha 4 LG3-4 module and activity of expressed product[J].Chin J Biologicals,2006,19（2）：194-196.

[10]Donovan RS,Robinson CW,Glick BR.Optimizing the expression of a monoclonal antibody fragment under the transcriptional control of the Escherichia coli lac promoter[J].Can J Microbiol,2000,46（6）：532-541.

[11]范守城,張云茹,王孝友,等.phyA基因新型載體的構建及其在大腸桿菌中的高效表達[J].中國生物工程雜志,2005,25（1）：70-75.

Fan Shoucheng,Zhang Yunru,Wang Xiaoyou,et al.Construction of a new phytase gene expression vector and its over expression in E.coli[J].China Biotechnology,2005,25（1）：70-75.

[12]李會成,李文輝,郭軍,等.基因工程菌的發(fā)酵研究[J].生物工程進展,1997,17（2）：40-43.

Li Huicheng,Li Wenhui,Guo Jun,et al.Formentation study on the gene engineering bacterial[J].Progress Biotechnology,1997,17（2）：40-43.