ClassⅠ新城疫病毒概述

金仕強，孟春春，仇旭升，于圣青，丁 鏟，左之才

（1.四川農業(yè)大學動物醫(yī)學院，四川 雅安 625014；2.中國農業(yè)科學院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241）

新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）完整的病毒粒子由囊膜、核酸及核衣殼組成，近圓形，直徑介于120nm～300nm，在囊膜的外層呈放射狀排列的突起物稱纖突。NDV的基因組為不分節(jié)段、單股負鏈RNA，全長有15186、15192和15198個核苷酸3種形式[1]，其中前兩種基因長度NDV屬于ClassⅡ，第3種基因組長度NDV屬于ClassⅠ。ClassⅠNDV廣泛存在于野生水鳥、家養(yǎng)水禽及活禽交易市場，在分子水平上與ClassⅡNDV存在較大的差異。Class I毒株非常特殊，意義重大。在實驗室條件下，于圣青等[2]將一株ClassⅠ新城疫病毒經過氣囊盲傳9代后，再經過大腦盲傳5代，使得原本毒力為弱毒株的NDV，變?yōu)閺姸玖Χ局?，可以引起雞群100%的發(fā)病和死亡；另外，中國農業(yè)科學院上海獸醫(yī)研究所禽病實驗室也將分離到的一株ClassⅠ新城疫病毒經氣囊盲傳10代，使得該毒株由原來的弱毒株變?yōu)閺姸局辏ㄎ恼铝硗鈭蟮溃?。這種經過氣囊傳代使得毒力變強的模式是所有新城疫病毒的共性，還是只是ClassⅠ新城疫病毒的特性或者只是少數(shù)ClassⅠ新城疫病毒毒株的特性？這些毒力返強毒株會不會是造成下一次新城疫大流行的元兇呢？本文就ClassⅠNDV的研究進展作簡要綜述，以為研究新城疫病毒提供參考。

1 ClassⅠNDV的發(fā)現(xiàn)

ClassⅠNDV最早發(fā)現(xiàn)于2003年，Aldous E W等根據(jù)與單克隆抗體的結合模式，將其列入“Lineage 6”，該群體NDV與其他群體的平均差異為50%[3]。匈牙利研究人員 Czegle'di A 等[1]根據(jù)基因組長度、F基因和L基因序列，對分離自世界各國的67株NDV進行遺傳進化分析時，首次將NDV分為ClassⅠ和ClassⅡ兩個分支，并首次對ClassⅠNDV中的DE－R49／99毒株進行全基因測序，其全基因組長15198bp。隨后，在美國、韓國、日本、中國香港等國家和地區(qū)相繼都發(fā)現(xiàn)ClassⅠNDV的存在。2008年，我國動物衛(wèi)生與流行病學中心研究人員劉華雷等[4]從江蘇省某表征健康的家鴨群中分離到國內的第一株的ClassⅠNDV08－004。

2 致病性

目前有關ClassⅠNDV的報道中，絕大多數(shù)為弱毒株，其最小致死量雞胚平均死亡時間（MDT）均大于96，1日齡雛雞腦內接種致病指數(shù)（ICPI）均小于0.5。而強毒株只發(fā)現(xiàn)了2株，第一株為導致愛爾蘭1990年暴發(fā)新城疫的元兇，這也是至今為止報道的惟一一株造成新城疫流行的ClassⅠNDV強毒株[5]；第二株為于圣青等[2]在實驗條件下，將一株ClassⅠNDV，通過雛雞傳代后，使得毒力由原來MDT＞120h，ICPI＝0，IVPI＝0，變?yōu)?MDT＝56 h，ICPI＝1.88，IVPI＝2.67，對雞可造成100%的致病，呈現(xiàn)強毒株NDV毒力。

3 ClassⅠNDV的基因組及結構蛋白特性

3.1 ClassⅠNDV的基因組

ClassⅠNDV的基因組全長為15198bp，符合NDV基因組的“六堿基規(guī)則”。與ClassⅡNDV基因組為15186bp的毒株相比，ClassⅠNDV在P基因的495bp～496bp處多出TGGGAGACGGGG12個堿基（編碼的多肽為 WETG）；與基因組為15192bp的ClassⅡNDV毒株相比，除了在上述位置多出12nt外，在NP基因的非編碼區(qū)1647～1648處少了6nt，相差的6nt因毒株不同而略有不同。多出的12nt或相差的6nt的具體功能和生物學意義，目前尚無明確的定論。

3.2 ClassⅠNDV的結構蛋白

ClassⅠNDV的全基因組與ClassⅡNDV一樣，基因序列為：3'－NP－P－M－F－HN－L－5'，依次編碼核衣殼蛋白（nucleocapsid protein，NP）、磷蛋白（phosphor protein，P）、基質蛋白（matrix protein，M）、融合蛋白（fusion protein，F(xiàn)）、血凝素－神經氨酸酶蛋白（hemagglutinin－neuraminidase protein，HN）及大分子蛋白（large protein，L）。就目前報道的序列而言，ClassⅠNDV間的全基因序列和各基因片段及推導出的氨基酸序列同源性均較高，其中以L基因和L蛋白同源性最高，HN基因和P蛋白同源性較低，與ClassⅡNDV全基因組序列和各基因片段及推導出的氨基酸序列相比，兩分支間的同源性均較低。

編碼ClassⅠNDV的NP蛋白的基因全長1747bp，ORF 1470bp，編碼489個氨基酸，與ClassⅡNDV相比，與全基因組為15186bp中的NP蛋白基因組長度一致，但與全基因組為15192 bp的毒株相比，在非編碼區(qū)1647～1648處少了6 nt。ClassⅠNDV的NP基因與ClassⅡ的同源性均較低，就發(fā)表的序列比較后可以看出，兩大類NDV間的同源性均小于80%。劉曉文[6]對已發(fā)表的ClassⅠNDV及常見的ClassⅡNDV的NP基因末端序列進行比較，結果發(fā)現(xiàn)ClassⅠNDV為TTA GAA AAA AA，而 ClassⅡNDV 為 TTA GAA AAA AG，兩者相差一個堿基。NP蛋白與病毒的轉錄、復制等有關。

編碼P蛋白的基因全長1463bp，比ClassⅡNDV的長12nt，ORF 1200bp，編碼399個氨基酸。同樣，ClassⅠNDV的P基因與ClassⅡ的同源性均較低，陳云霞等[7]對分離的一株ClassⅠ新城疫病毒P基因進行了比較分析，結果表明與ClassⅡNDV的同源性在70.8%～72.4%之間。P蛋白是由于被高度磷酸化而得名，與L蛋白一起構成RNA聚合酶（P－L），對新城疫病毒RNA的合成起調節(jié)作用。P蛋白與RNA合成密切相關，同時作為NP蛋白的分子伴侶阻止未組裝的NP蛋白對非新城疫病毒RNA分子及mRNA的“非法”衣殼化。

編碼M蛋白的基因全長1241bp，這與ClassⅡNDV一致，ORF 1095bp，編碼364個氨基酸。M蛋白具有多種生物學功能：保護病毒粒子；通過與細胞膜、核衣殼間的相互作用，參與病毒的組裝與出芽，形成具有感染性的病毒粒子；另一方面也可以抑制宿主細胞RNA的轉錄和蛋白質的合成，與病毒的致病性有關。

編碼F蛋白的基因全長1792bp，ORF 1662 bp，編碼553個氨基酸，長度與ClassⅡNDV的F蛋白一致，但與ClassⅡNDV的同源性性較低。F蛋白以非活性的F0形式存在，需經歷特異性的裂解修飾過程，才能介導病毒與細胞膜的融合。F0蛋白裂解能力在一定程度上決定NDV的毒力，毒株因毒力不同而裂解位點不同。目前研究結果表明，多數(shù)強毒裂解位點處氨基酸殘基為112R－R－Q－P／KR－F117；ClassⅡNDV 弱毒株多為112G－R／K－Q－GR－L117，而 Liu X 等[8]和 Kim LM等[9]報 道 了ClassⅠNDV 弱毒株為112E／G－R／Q－Q－E／G／D－RL117，增加了112位、113位、115位氨基酸的多樣性。大多數(shù)ClassⅡNDV的F蛋白具有12個保守的半胱氨酸殘基，分別位于第25、76、199、338、347、362、370、394、399、401、424及523位，但王偉偉[10]在對某弱毒株ClassⅠNDV分析時，發(fā)現(xiàn)25位的半胱氨酸變?yōu)榈鞍彼?，并且與參考的ClassⅠNDV一致，這也就表明，25位的半胱氨酸變?yōu)榈鞍彼崾荂lassⅠNDV的特性。

編碼HN蛋白的基因全長2001bp，因終止密碼子不同，編碼的氨基酸長度不同，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)有570、572、574、580、585及616個氨基酸的 ClassⅠNDV 毒株[11－12]，除了兩株強毒外，其余均為弱毒株，這與ClassⅡNDV間有明顯的不同；而在ClassⅡNDV中發(fā)現(xiàn)有571、572、577、581和616個氨基酸的毒株。這些HN蛋白差異明顯的NDV間除了毒力有差異外，其他的生物學特性還有什么不同？目前還未見有相關的報道。HN蛋白主要有以下功能：血凝素成分負責識別易感細胞的含唾液酸的受體并使病毒粒子與之吸附；而神經氨酸酶則催化唾液酸受體水解，并促進病毒囊膜與細胞膜以及細胞與細胞的膜融合，從而促進新生的病毒粒子從感染細胞表面釋放，因此HN蛋白與毒力有著密切關系。近年來的研究表明，F(xiàn)蛋白的融合作用還需要HN蛋白的參與才能進行。

編碼L蛋白的基因全長6703bp，ORF 6615 bp，編碼2204個氨基酸，是NDV中最大的蛋白，但在NDV中的含量很低，位于核衣殼內，與P蛋白一起構成RNA依賴的RNA聚合酶，形成具有完整酶活性的復合物。在L蛋白上存在參與RNA轉錄和復制的大部分酶，包括RNA多聚酶、mRNA加帽酶、甲基轉移酶和磷酸激酶等。同時，L蛋白與病毒的毒力也有一定的關系。

4 ClassⅠNDV的基因分型及分子流行病學

4.1 ClassⅠNDV的基因分型

雖然NDV只有一個血清型，但在分子水平上根據(jù)基因組長度和F、L基因的序列可分為ClassⅠ和ClassⅡ兩類，并且這兩類NDV在抗原和遺傳上都存在較大差異[1]。Kim LM等[9]根據(jù)F基因374 bp的序列，對290株弱毒株進行遺傳分析時，首次將ClassⅠNDV分為1～9這9個基因型。

4.2 ClassⅠNDV的分子流行病學

2005年匈牙利研究人員Czegle'di A[1]發(fā)現(xiàn)了ClassⅠNDV毒株以來，世界各地相繼都有ClassⅠ毒株的報道，并且流行毒株的基因型呈現(xiàn)一定的區(qū)域性。到目前為止，分離到的ClassⅠNDV主要來自于全世界范圍的水禽、海鳥及活禽市場的泄殖腔棉拭子，偶爾在雞群泄殖腔中分離到。

Kim L M等[9]通過擴增1986年－2005年間分離至北美地區(qū)健康水禽和水鳥的268株弱毒NDV的F基因片段（374bp），進行遺傳進化分析，結果表明，ClassⅠNDV的分離率達71.5%（192／268），1～9型分別為9、14、0、12、81、2、44、6、24株，這表明北美地區(qū)的ClassⅠNDV以基因5型和7型為主，沒有基因3型。隨后該研究人員又對來自中國香港活禽交易市場的表征健康活禽的泄殖腔棉拭子及環(huán)境中共分離到23株NDV，其中ClassⅠNDV占91.3%（21／23），對 F基因374bp進行遺傳進化分析，結果表明這21株ClassⅠNDV屬于基因3型。Lee E K等[13]對2006年－2007年間分離自韓國鴨場的14株病毒進行分子流行病學調查時，發(fā)現(xiàn)有1株屬于ClassⅠNDV，屬于基因2型，并且該分離株病毒與分離至北美、德國、丹麥等國家的基因2型毒株有很高的同源性。

在國內，Liu H等[4]從表征健康的家鴨中分離到第一株ClassⅠNDV，擴增F基因的主要功能區(qū)片段進行遺傳進行分析，結果表明該毒株屬于ClassⅠ中的基因3型。隨后該研究人員又報道了從南方地區(qū)的健康家鴨中分離到一株ClassⅠNDV，經F基因47bp～420bp的遺傳進化分析，表明該株ClassⅠNDV 屬于基因2型[14]。Liu X等[8]報道了2002年－2007年間從山東、江蘇、河南、安徽、浙江、福建、上海七省的健康家鴨泄殖腔采集的棉拭子中分離到30株ClassⅠNDV，經應用F基因47bp～420bp繪制的遺傳進化樹分析，結果顯示，12株屬于基因2型，18株屬于基因3b型。

總的來說，ClassⅠNDV主要流行于野生水鳥、家養(yǎng)水禽及活禽交易市場；分子流行病學方面：北美地區(qū)的ClassⅠNDV以基因5型和7型為主，有少量的基因1型、2型、4型、6型、8型及9型，但沒有基因3型的發(fā)現(xiàn)；而亞洲地區(qū)包括韓國、中國香港及中國大陸等的ClassⅠNDV以基因2型和3型為主。

5 ClassⅠNDV的檢測

5.1 病毒的分離及初步鑒定

目前，新城疫病毒的分離及鑒定仍然是診斷新城疫最為準確的方法。將采集的樣品接種9日齡～11日齡的雞胚后，測定尿囊液的HA和HI，同時用禽流感、EDS－76等標準血清進行HI試驗，綜合進行判定。

5.2 分子水平上的鑒定

在分子水平上，由于ClassⅠNDV和ClassⅡNDV在分子上存在較大的差異，用常規(guī)鑒定ClassⅡNDV的方法來鑒定ClassⅠNDV，多以失敗告終[15]。最早用于鑒定ClassⅠNDV的是單克隆抗體技術，Aldous E W等[3]根據(jù)與特定單克隆抗體的結合模式，將其列入“Lineage6”，該群體分離的NDV毒株與其他群體分離株的平均差異為50%，后來證實該群體為ClassⅠNDV。孫英杰等[16]用ClassⅠNDV毒株9a5b作為抗原免疫接種小鼠，用間接免疫熒光法進行單克隆抗體的篩選，結果制備了僅對Oya株、9a5a株、D74株、D55株等ClassⅠNDV有反應，而對F48E9株，La Sota株、D72株、I2株、ZJ1株、D1株等ClassⅡNDV無反應的單克隆抗體2A8、3H7、3H9。

目前，常根據(jù)GenBank上已發(fā)表的ClassⅠNDV核苷酸序列，設計針對ClassⅠNDV毒株特異性的引物進行鑒定。

Kim LM等[17]應用 Wise MG等[18]建立的針對M基因設計的用于鑒定NDV的探針，對分離自中國香港的ClassⅠNDV進行檢測，結果使得大多數(shù)的ClassⅠNDV毒株未被檢測出，該研究人員又改用針對L基因設計的探針，結果可以檢測出所有的ClassⅠNDV（22株）。隨后該研究人員又對50株弱毒NDV（42株ClassⅠ，8株ClassⅡ）分別應用針對M基因和L基因引物進行RRT－PCR檢測，結果表明，應用M基因進行檢測時，三分之二（30／42）的ClassⅠNDV不能被檢測出，但用針對L基因的引物進行檢測時，所有的ClassⅠNDV均能檢測出[9]。Kim LM等[19]根據(jù) ClassⅠNDV L基因保守區(qū)設計引物，進行RRT－PCR，從而建立了一種能鑒別ClassⅠNDV的方法。通過該方法，可以對所有的ClassⅠNDV基因型毒株（共108株，涉及基因型1～2及4～9）進行檢測，并且可以從ClassⅠ基因5型和ClassⅡ基因Ⅱ型的混合NDV中檢測到ClassⅠNDV的存在；敏感性方面，可以檢測到ClassⅠNDV中基因5型、7型、8型的RNA≤1fg的樣品。

國內研究人員Liu H等[20]根據(jù)F基因（包括F蛋白裂解位點）設計引物，建立了一種區(qū)分和檢測ClassⅠ和ClassⅡNDV高度敏感性和特異性的多重RT－PCR方法。該方法只能檢測到NDV毒株（包括ClassⅠ和ClassⅡNDV的毒株），而對IBDV、IBV及禽流感病毒中的H5、H7、H9亞型沒有交叉反應。

6 展望

ClassⅠNDV最初分離自野生水鳥和水禽，但隨后就在活禽交易市場的雞群中分離到，這表明NDV可以在水禽和家禽間相互傳播；另一方面，ClassⅠNDV可以在一定的實驗條件下演變?yōu)閺姸玖Χ局?，導致雞群100%的發(fā)病和死亡，那么在自然條件下，ClassⅠNDV是否也可以演變?yōu)閺姸玖Χ局?，并導致ND的大流行？為了更好的防治ND，減少因ND造成對養(yǎng)禽業(yè)的損失，因此，有必要加強對ClassⅠNDV的檢測及ClassⅠNDV毒力演變等相關研究，盡可能消除這種潛在暴發(fā)新城疫的隱患。

[1]Czegledi A，Ujvari D，Samogyi E，et al.Third genome size category of avian paramyxovirus serotypeⅠ（Newcastle disease virus）and evolutionary implications[J].Virus Res，2006，120（1／2）：36－48.

[2]于圣青，丁 鏟，Noriko Kishida，等.新城疫病毒某水禽分離株經雞體傳代后由非致病型轉變?yōu)樗侔l(fā)型的研究[J].中國預防獸醫(yī)學報，2003，25（1）：59－64.

[3]Aldous E W，Mynn J K，Banks J，et al.A molecular epidemiological study of avian paramyxovirus type 1（Newcastle disease virus）isolates by phylogenetic analysis of a partial nucleotide sequence of the fusion protein gene[J].Avian Pathol，2003，32（3）：239－256.

[4]Liu H，Chen F，Zhao Y，et al.Genomic characterization of the first class I Newcastle disease virus isolated from the mainland of China[J]Virus Genes，2010，40（3）：365－371.

[5]Alexander D J，Campbell G，Manvell R J，et al.Characterisation of an antigenically unusual virus responsible for two outbreaks of Newcastle disease in the Republic of Ireland in 1990[J].Vet Rec，1992，130（4）：65－68.

[6]劉曉文，吳 雙，胡順林，等.ClassⅠ新城疫病毒NP基因分子特征的研究[J]中國家禽，2009，31（23）：11－14.

[7]陳云霞，劉華雷，鄭東霞，等.一株ClassⅠ新城疫病毒分離株NP和P蛋白基因分子特征和遺傳進化分析[J]中國動物檢疫，2010，28（3）：37－40.

[8]Liu X，Wang X，Wu S，et al.Surveillance for avirulent Newcastle disease viruses in domestic ducks（Anas platyrhynchos and Cairina moschata）at live bird markets in Eastern China and characterization of the viruses isolated[J].Avian Pathol，2009，38（5），377－391.

[9]Kim L M，King D J，Curry P E，et al.Phylogenetic diversity among low－virulence Newcastle disease viruses from waterfowl and shorebirds and comparison of genotype distributions to those poultry－origin isolates[J]J Virol，2007，81（22）：12641－12653.

[10]王偉偉.江蘇省新城疫病毒分子流行病學研究及鴿源分離株基因組序列的分析[D].江蘇揚州：揚州大學，2009.

[11]Hu B，Huang Y，He Y，et al.Avian influenza virus and Newcastle disease virus（NDV）surveillance in commercial breeding farm in China and the characterization of ClassⅠ NDV isolates[J].Vet Microbiol，2010，144（12）：82－86.

[12]Tsunekuni R，Ito H，Otsuki K，et al.Genetic comparisons between lentogenic Newcastle disease virus isolated from waterfowl and velogenic variants[J].Virus Genes，2009，40（2）：252－255.

[13]Lee E K，Jeon W J，Kwon J H，et al.Molecular epidemiological investigation of Newcastle disease virus from domesticducks in Korea[J]Vet Microbiol，2009，134：241－248.

[14]劉華雷，孫軍峰，趙云玲，等.Ⅰ類新城疫病毒分離株NDV08－046的基因組特性[J].中國獸醫(yī)學報，2011，31（5）：638－644.

[15]Miller P J，Decanini E L，Afonso C L.Newcastle disease：Evolution of genotypes and the related diagnostic challenges[J].Infect Gen Evolu，2010，10（1）：26－35.

[16]孫英杰，陳鴻軍，宋翠萍，等.ClassⅠ新城疫病毒強毒株主要結構蛋白特異性抗體的研制[J]中國獸醫(yī)科學，2010，40（1）：34－40.

[17]Kim L M，King D J，Suarez D L，et al.Characterization of class I Newcastle disease virus isolates from Hong Kong live bird markets and detection using real－time reverse transcription－PCR[J].J Clin Microbilol，2007，45（4）：1310－1314.

[18]Wise M G，Suarez D L，Seal B S，et al.Development of a realtime reverse－transcription PCR for detection of newcastle disease virus RNA in clinical samples[J].Clin Microbiol，2004，42（1）：329－338.

[19]Kim L M，Suarez D L，Afonso C L.Detection of a broad range of class I and II Newcastle disease viruses using a multiplex real－time reverse transcription polymerase chain reaction assay[J].JVet Diagn Invest，2008，20（4）：414－425.

[20]Liu H，Zhao Y，Zheng D，et al.Multiplex RT－PCR for rapid detection and differentiation of class I and class II Newcastle disease viruses[J].J Virol Meth，2011，171（1）：149－55.