鄧 宇，藺 濤，孫春清，張宏彪，張 榮，龍進(jìn)學(xué)，黃 律，文心田，曹三杰，童光志，袁世山，鄭 浩＊

（1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，四川 雅安 625014；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241；3.西昌學(xué)院動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，四川 西昌 615000；4.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，江蘇 南京 210095）

牛病毒性腹瀉病毒（Bovine viral diarrhea virus，BVDV）是單股正鏈RNA病毒，屬于黃病毒科（Flaviridea）瘟病毒屬（Pestivirus）成員，當(dāng)前被分為2個(gè)種，BVDV－1和 BVDV－2[1]。BVDV 基因組全長(zhǎng)約為12.3kb～12.5kb，由一個(gè)大的開放閱讀框（open reading frame，ORF）和5′與3′非翻譯區(qū)（untranslated region，UTR）所組成。該病毒ORF編碼約4000個(gè)氨基酸殘基組成的多聚蛋白，在病毒非結(jié)構(gòu)蛋白與宿主細(xì)胞信號(hào)肽酶作用下，加工成BVDV結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白，依次為p20（Npro）、C，gp48（Erns）、gp25（E1）、gp53（E2）、p7、p125（NS2－3（NS2，NS3））、p10 （NS4A）、p30 （NS4B）、p58（NS5A）、p75（NS5B）[2－3]。其中，E2（gp53）是 BVDVs亞型分類的依據(jù)之一，也是主要保護(hù)性抗原[4－5]。BVDV除引起牛感染外，還能引起野生反芻動(dòng)物、兔、綿羊、山羊、豬等動(dòng)物感染。豬感染BVDV會(huì)出現(xiàn)類似豬瘟的臨床癥狀與病理變化[6]，給養(yǎng)豬業(yè)帶來危害。近3年來，流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果表明，我國豬群中BVDV感染已經(jīng)比較嚴(yán)重，送檢的樣品中，部分批次樣品陽性率高達(dá)80.72%[7－9]。近4年來，我們實(shí)驗(yàn)室對(duì)來自我國11省份的豬病料樣品進(jìn)行BVDV檢測(cè)，結(jié)果也發(fā)現(xiàn)，部分豬場(chǎng)BVDV感染很嚴(yán)重，高達(dá)79.3%。我們從這些陽性病料中分離鑒定出一株BVDV SD0803，基于此，我們根據(jù)此毒株E2基因表達(dá)蛋白免疫兔制備多克隆抗體，為豬源BVDV快速診斷提供一種參考方法，為豬源BVDV病原學(xué)研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 毒株、細(xì)胞、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 豬源BVDV SD0803株由本實(shí)驗(yàn)室分離鑒定；BVDV NADL標(biāo)準(zhǔn)毒株，購自中國獸醫(yī)藥監(jiān)察所；MDBK細(xì)胞，購自美國ATCC，經(jīng)本實(shí)驗(yàn)室建立的Nested－PCR與直接免疫熒光（Direct FA）檢測(cè)均為BVDV陰性；實(shí)驗(yàn)兔，購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司。

1.1.2 主要試劑 馬血清（經(jīng)檢測(cè)BVDV抗原抗體呈陰性），PBS購自 GIBCO公司；RPMI－1640培養(yǎng)基，購自Hyclone公司；FITC標(biāo)記BVDVs抗體，購自美國 VMRD 公司；pGEX－4T－1、BL21、DH5α，購自康為世紀(jì)生物科技有限公司；EcoRⅠ和XhoⅠ，購自Thermo公司；QIAamp?Viral RNA Mini Kit，購自QIAGEN公司；AMV反轉(zhuǎn)錄酶、LA Taq聚合酶，購自寶生物工程（大連）有限公司。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)及合成 根據(jù)GenBank中公布的多個(gè)BVDV－1毒株的全長(zhǎng)序列進(jìn)行比對(duì)，用Primer Premier 6.0設(shè)計(jì)2對(duì)特異引物擴(kuò)增SD0803株E2基因，預(yù)期擴(kuò)增約1400bp，引物序列分別為：F1975，5′－CCC（TC）GG（GT）A（AG）（GA）TT（TC）GACACCAATGC－3′；R4014，5′－CTGTC ACATA（GA）CTA A（CT）CATCAG－3′；F2249，5′－GACCA（AG）ATTGGTGGCCTT ATGAGAC；R3640，5′－A（CT）T（GA）T（CT）ATG（TG）GTTA（GA）CAAGTTGCC－3′。

根據(jù)上述引物擴(kuò)增SD0803E2基因序列，采用DNA Star軟件預(yù)測(cè)分析，選擇表達(dá)蛋白抗原性、親水性較好的序列設(shè)計(jì)合成一對(duì)引物，用于擴(kuò)增表達(dá)蛋白的靶基因（sE2），預(yù)期擴(kuò)增約735bp，其引物序列 為 E2－F：5′－AGCGAATTCTTTGA ACAACT CTTCAATGGG－3′；E2－R：5′－AGCCTCGAGTT AGTACTCCCCTTTTAA CATA－3′，其中，在上下游引物分別引入EcoRⅠ和XhoⅠ限制性酶切位點(diǎn)（下劃線標(biāo)識(shí)）和3個(gè)保護(hù)性堿基，引物均由Invitrogen（上海）公司合成。

1.2.2 E2基因PCR擴(kuò)增 用 QIAamp?Viral RNA Mini Kit按照操作說明書提取SD0803株MDBK細(xì)胞培養(yǎng)上清RNA。以R4014為反轉(zhuǎn)錄引物，參照AMV反轉(zhuǎn)錄酶操作說明書，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，合成cDNA。然后分別以 F1975／R4014，F(xiàn)2249／R3640為引物進(jìn)行 RT－PCR、Nested－PCR擴(kuò)增，方法按LA Taq聚合酶說明書進(jìn)行。RT－PCR擴(kuò)增條件為：94℃預(yù)變性5min；94℃30s，55℃30s，72℃2min 35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min。套式PCR擴(kuò)增條件為：94℃預(yù)變性5min；94℃30s，58℃30s，72℃1min 30s35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min。擴(kuò)增結(jié)束后取5μL Nested－PCR反應(yīng)產(chǎn)物，用10g／L瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。用DNA膠回收試劑盒純化Nested－PCR產(chǎn)物，直接送純化產(chǎn)物至Invitrogen（上海）公司測(cè)序，分析測(cè)序結(jié)果，確定SD0803E2基因。

1.2.3 sE2基因PCR擴(kuò)增 以Nested－PCR純化產(chǎn)物為模板，以E2－F與E2－R為PCR擴(kuò)增引物，按LA Taq聚合酶說明書進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性3min；95℃30s，58℃45s，72℃45s35個(gè)循環(huán)；72℃延伸5min。反應(yīng)結(jié)束后取5μL PCR反應(yīng)產(chǎn)物，用10g／L瓊脂糖凝膠電泳，鑒定擴(kuò)增產(chǎn)物的大小正確后DNA膠回收試劑盒回收、純化。

1.2.4 重組表達(dá)載體pGEX－4T－1－sE2的構(gòu)建 純化產(chǎn)物（sE2）用限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ與XhoⅠ雙酶切后與用相應(yīng)限制性內(nèi)切酶處理的pGEX－4T－1載體連接，22℃連接過夜。65℃滅活10min后，轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞，37℃生長(zhǎng)過夜，隨機(jī)挑取克隆，提取質(zhì)粒，用EcoRⅠ與XhoⅠ對(duì)質(zhì)粒雙酶切，鑒定正確的重組質(zhì)粒送Invitrogen（上海）公司測(cè)序。

1.2.5 SD0803sE2基因誘導(dǎo)表達(dá)及表達(dá)產(chǎn)物純化將重組質(zhì)粒pGEX－4T－1－sE2接種至3mL TB培養(yǎng)基（含氨芐抗性）中37℃培養(yǎng)箱中振蕩培養(yǎng)過夜，次日取該菌液按1∶100的比例加入300mL LB培養(yǎng)基（含氨芐抗性）中，37℃振蕩培養(yǎng)至OD600為0.5～0.6時(shí)，加入1.5mmol IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。37℃誘導(dǎo)4h后收菌，表達(dá)產(chǎn)物采用文獻(xiàn)[10]所述方法，進(jìn)行純化，獲得的產(chǎn)物命名為rsE2。采用SDS－PAGE對(duì)純化蛋白進(jìn)行分析。

1.2.6 抗rsE2蛋白多克隆抗體的制備及純化 首次免疫，取rsE2蛋白與等體積的弗氏完全佐劑充分乳化，500μg／只的劑量多點(diǎn)皮下接種兔。間隔3周后，用rsE2蛋白加等體積弗氏不完全佐劑充分乳化后，加強(qiáng)免疫3次，按250μg／只劑量皮下接種兔。末次免疫后1周，兔心臟采血，分離血清，制備抗體，置－20℃保存。

利用5mg rsE2蛋白制備抗原交聯(lián)柱，抗血清經(jīng)過5000r／min離心15min，濾紙過濾后，用10倍柱體積的1×PBS平衡交聯(lián)柱，然后抗血清過柱兩次，再用含1mol／L NaCl的PBS緩沖液清洗柱子，然后用100mmol／L的1×Glycine－HCl（pH2.3）洗脫抗體，收集洗脫抗體用Tris緩沖液平衡至中性。隨后在1×PBS溶液中透析2h，再在含550mL／L甘油的PBS溶液中透析4h～8h，收取抗體，置－70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.7 多克隆抗體的鑒定

1.2.7.1 間接ELISA抗體效價(jià)的測(cè)定 參照文獻(xiàn)[11]所建立間接ELISA方法，以SD0803MDBK細(xì)胞培養(yǎng)上清作為包被抗原建立間接ELISA，檢測(cè)兔抗血清的抗體效價(jià)及特異性。

1.2.7.2 Western blot抗體特異性檢測(cè) 將rsE2蛋白進(jìn)行SDS－PAGE電泳，然后以濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)到NC膜上面；經(jīng)50g／L脫脂奶粉室溫封閉2h后，用兔抗rsE2純化抗體為一抗，F(xiàn)ITC標(biāo)記的羊抗兔IgG作為二抗，按文獻(xiàn)[10]所述方法進(jìn)行 Western blot分析。

1.2.8 BVDV 抗原的檢測(cè) 將SD0803、NADL分別接種基本長(zhǎng)滿單層的6孔板MDBK細(xì)胞，3d后，用甲酮固定，所制備的多抗為一抗，F(xiàn)ITC標(biāo)記的羊抗兔IgG為二抗，做間接免疫熒光試驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 SD0803E2及sE2基因擴(kuò)增

采用套式PCR擴(kuò)增SD0803的E2基因，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定，得到約1400bp條帶，與預(yù)期大小一致（圖1），送其產(chǎn)物測(cè)序，得到的序列為SD0803 E2基因序列。PCR擴(kuò)增sE2基因，獲得預(yù)期的735 bp條帶（圖2）。

圖1 SD0803E2基因擴(kuò)增Fig.1 Amplification of E2gene of SD0803

圖2 SD0803sE2基因擴(kuò)增Fig.2 Amplification of sE2gene of SD0803

2.2 重組表達(dá)載體pGEX－4T－1－sE2的構(gòu)建

SD0803sE2基因與pGEX－4T－1構(gòu)建重組表達(dá)載體，獲得的陽性克隆送公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果表明，sE2基因插入的位置、大小均正確，證實(shí)重組質(zhì)粒構(gòu)建成功，命名為pGEX－4T－1－sE2。

2.3 SD0803sE2基因誘導(dǎo)表達(dá)及重組蛋白的鑒定

重組質(zhì)粒pGEX－4T－1－sE2經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)，獲得的蛋白表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行純化，其中，上清Ⅰ為超聲波破碎細(xì)胞，10000r／min離心10min后收集得到的上清液；加1×PBS重懸沉淀后，加入尿素，充分溶解沉淀，相同條件超聲波破碎細(xì)胞，10000r／min離心10 min后收集的上清液，此上清為上清Ⅱ。用SDSPAGE電泳分析，獲得分子質(zhì)量約為52ku誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物，與預(yù)期大小一致（圖3）。

圖3 SD0803sE2基因表達(dá)產(chǎn)物SDS－PAGE分析Fig.3 Analysis SDS－PAGE of expression product of SD0803sE2gene

2.4 抗rsE2蛋白多克隆抗體的制備

采用建立的間接ELISA，測(cè)定末次免疫1周后分離的抗血清，其抗體效價(jià)可達(dá)1∶256000，表明制備的抗體有較高的效價(jià)。

2.5 抗體特異性鑒定

2.5.1 Western blot分析 Western blot發(fā)現(xiàn)，一抗（抗血清純化獲得的抗體）1∶1000稀釋，亦能出現(xiàn)約52ku特異性條帶（圖4），結(jié)果表明，制備的多抗具有良好的特異性與較高的效價(jià)。

圖4 抗體Western blot分析Fig.4 Analysis of antibody by Western blot

2.5.2 BVDV抗原檢測(cè) 間接免疫熒光試驗(yàn)結(jié)果，SD0803株、NADL標(biāo)準(zhǔn)株感染的MDBK細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)特異性綠色熒光，結(jié)果表明，多克隆抗體分別能特異結(jié)合MDBK后分泌產(chǎn)生的E2蛋白（圖5）。

圖5 BVDV E2蛋白在MDBK細(xì)胞中表達(dá)的免疫熒光檢測(cè)Fig.5 Detection of BVDV E2protein expressed in MDBK with immunofluorescence assay

3 討論

BVDV E2是病毒的主要保護(hù)性抗原，其編碼的蛋白gp53是囊膜糖蛋白，受糖基化的影響，分子質(zhì)量為51ku～58ku之間，介導(dǎo)免疫中和反應(yīng)、決定BVDV抗原性及其抗體、宿主細(xì)胞識(shí)別、吸附的主要部位[12－14]。gp53具有中和作用，其N端有2個(gè)抗原域（antigenic domain），一個(gè)是種內(nèi)保守的主要抗原域，另一個(gè)是不同毒株之間的特異性抗原域；其C端存在YYEP線性表位，在豬瘟病毒（Classical swine fever virus，CSFV）、邊界病毒（Border disease virus，BDV）及BVDV這3種病毒內(nèi)具有高度保守性，這一蛋白可作為特異性診斷工具[15]。最新試驗(yàn)證實(shí)，BVDV Manasi株 E2pET－（144～340）、pET－（1～300）誘導(dǎo)表達(dá)的融合蛋白均能被BVDV陽性血清識(shí)別[16]。通過去除BVDV Changchun184E2基因3′端編碼的gp53蛋白跨膜疏水區(qū)序列，可以使該蛋白在大腸埃希菌中高效表達(dá)[17]。鑒于上述研究結(jié)果，本試驗(yàn)選取gp53蛋白56～324區(qū)段（sE2）表達(dá)的蛋白免疫兔，結(jié)果表明，獲得的抗體能被SD0803、BVDV標(biāo)準(zhǔn)毒株NADL識(shí)別，這一結(jié)果證實(shí)所制備的抗體具有良好特異性和較高的效價(jià)。

構(gòu)建的表達(dá)載體采用不同濃度的IPTG、不同誘導(dǎo)時(shí)間，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在37℃條件下，加1.5 mmol／L IPTG誘導(dǎo)4h，表達(dá)的蛋白量最多。誘導(dǎo)表達(dá)的蛋白經(jīng)SDS－PAGE分析，發(fā)現(xiàn)以包涵體形式存在。由于包涵體除了含目的蛋白之外，還包含有其他成分比如細(xì)菌膜蛋白、肽聚糖、脂多糖及脂質(zhì)等。一般情況下，在包涵體溶解之前可用低濃度的尿素做變性處理，溶解包涵體，可以除去大部分雜質(zhì)。所以本試驗(yàn)中，將獲得的包涵體用尿素法進(jìn)行2次洗滌，以去除雜質(zhì)，然后利用GST蛋白標(biāo)簽柱層析法純化包涵體，從SDS－PAGE電泳結(jié)果來看，過柱純化后包涵體蛋白雜質(zhì)明顯減少，rsE2蛋白純化是成功的。

獲得的抗血清，在檢測(cè)其抗體效價(jià)時(shí)，為了避免非特異性反應(yīng)，準(zhǔn)確測(cè)定抗血清效價(jià)，我們選用BVDV SD0803MDBK細(xì)胞培養(yǎng)上清作為檢測(cè)抗原包板進(jìn)行間接ELISA。經(jīng)檢測(cè)，獲得高達(dá)1∶256000效價(jià)的抗血清。在多克隆抗體鑒定方面，采用3種方法，即間接ELISA、Western blot、免疫熒光法對(duì)多克隆抗體進(jìn)行鑒定，結(jié)果證實(shí)制備的多克隆抗體具有良好的反應(yīng)性和特異性，為下一步建立豬源BVDV特異性診斷方法奠定了基礎(chǔ)。

[1]Fauquet C.Virus taxonomy：classification and nomenclature of viruses：eighth report of the International Committee on the Taxonomy of Viruses[M].Academic Press，2005.

[2]Tautz N，Kaiser A，Thiel H J.NS3serine protease of bovine viral diarrhea virus：characterization of active site residues，NS4Acofactor domain，and protease－cofactor interactions[J].Virology，2000，273（2）：351－363.

[3]Liu L，Xia H，Wahlberg N，et al.Phylogeny，classification and evolutionary insights into pestiviruses[J].Virology，2009，385（2）：351－357.

[4]Becher P，Orlich M，Shannon A，et al.Phylogenetic analysis of pestiviruses from domestic and wild ruminants[J].J Gene Virol，1997，78（6）：1357.

[5]Becher P，Orlich M，Kosmidou A，et al.Genetic diversity of pestiviruses：identification of novel groups and implications for classification[J].Virology，1999，262（1）：64－71.

[6]Xu X，Zhang Q Y，Liang X，et al.Sequencing and comparative analysis of a pig bovine viral diarrhea virus genome[J].Virus Res，2006，122（2006）：164－170.

[7]衛(wèi)秀余，沈 強(qiáng)，余紅梅.2009年豬病診斷回顧[J].今日養(yǎng)豬業(yè)，2010（1）：34－35.

[8]宋永峰，張 志，張燕霞，等.豬源牛病毒性腹瀉病毒的流行初探[J].中國動(dòng)物檢疫，2008（7）：25－27.

[9]吳文輝，衛(wèi)秀余，余紅梅，等.豬群BVDV感染狀況調(diào)查及成因初步分析[J].上海畜牧獸醫(yī)通訊，2011（4）：35－37.

[10]奧斯帕F M，金斯頓R E.精編分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南[M].4版.北京：科學(xué)出版社，2005.

[11]鄭其升，楊耀武，周 斌，等.流行性乙型腦炎病毒E蛋白主要抗原域的原核表達(dá)與間接ELISA檢測(cè)方法的初步建立[J].中國病毒學(xué)，2004，19（5）：458－461.

[12]Harada T，Tautz N，Thiel H J.E2－p7region of the bovine viral diarrhea virus polyprotein：processing and functional studies[J].J Virol，2000，74（20）：9498.

[13]Tscherne D M，Evans M J，Macdonald M R，et al.Transdominant inhibition of bovine viral diarrhea virus entry[J].J Virol，2008，82（5）：2427.

[14]Harpin S，Hurley D J，Mbikay M，et al.Vaccination of cattlewith a DNA plasmid encoding the bovine viral diarrhoea virus major glycoprotein E2[J].J Gen Virol，1999，80（12）：3137.

[15]Yu M，Wang L F，Shiell B J，et al.Fine mapping of a C－terminal linear epitope highly conserved among the major envelope glycoprotein E2（gp51to gp54）of different pestiviruses[J].Virology，1996，222（1）：289－292.

[16]黃 新，王新華，鐘發(fā)剛.牛病毒性腹瀉病毒瑪納斯株E2基因的克隆及其主要抗原表位區(qū)的分段表達(dá)[J].中國獸醫(yī)科學(xué)，2009（4）：321－326.

[17]徐興然.牛病毒性腹瀉病病毒中國毒株E2基因的鑒定及表達(dá)E2蛋白的抗原性研究[D].吉林長(zhǎng)春：中國人民解放軍軍需大學(xué)，2002.