謝余澄，傅 僅，楊亞麗，唐 靜

(云南省第二人民醫(yī)院病理科，昆明 650021)

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone mesenchymal stem cells,BMSCs)是骨髓來(lái)源的一類具有多向分化潛能的成體干細(xì)胞，可分化為骨、軟骨、心肌、脂肪和肝、膽管上皮等細(xì)胞。本文旨在探索BMSCs移植治療多器官功能不全綜合征(multiple organ dysfunction syndrome，MODS)組織修復(fù)病理改變。

1 材料與方法

1.1材料 35只健康新西蘭大耳白兔，3個(gè)月齡，雌雄不限，體質(zhì)量2.5～3.0 kg，由中國(guó)人民解放軍成都軍區(qū)昆明總醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供；實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)SYXK(滇)2005-0008；實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)SYXK(軍)2007-041。實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。實(shí)驗(yàn)過程中對(duì)動(dòng)物的處置符合2006年科技部《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見》的規(guī)定。將其隨機(jī)分為3組：(1)正常組5只，不做任何處理；(2)模型組15只，手術(shù)創(chuàng)傷導(dǎo)致失血性休克合并內(nèi)毒素感染性休克導(dǎo)致多器官功能不全綜合征。方法如下：大耳白兔稱體質(zhì)量， 3%戊巴比妥鈉按1 mL/kg耳緣靜脈注射麻醉。麻醉后，將兔仰臥位固定于加溫手術(shù)臺(tái)上，腹股溝備皮，消毒，逐層分離，充分暴露股動(dòng)脈和股靜脈，游離3～4 cm股動(dòng)脈。用血管夾夾閉一段動(dòng)脈，在動(dòng)脈上剪一小斜口，行股動(dòng)脈插管，并固定導(dǎo)管，連接機(jī)能實(shí)驗(yàn)轉(zhuǎn)換器，通過Rm6240BD多道生理信號(hào)采集處理系統(tǒng)監(jiān)測(cè)血壓、呼吸流量指標(biāo)變化。初步估算血容量，一般為體質(zhì)量的5%～6%，術(shù)后10 min，以放血量為血容量的35%～40%復(fù)制失血性休克模型。股靜脈插管，將60%所失血液及2倍失血量的平衡液自股靜脈1 h內(nèi)回輸復(fù)蘇，造成復(fù)蘇再灌注損傷[1]，為導(dǎo)致MODS且不致死亡提供治療。術(shù)畢，把股動(dòng)、靜脈斷端分別結(jié)扎，拔出插管。逐層縫合后放入兔籠每天進(jìn)行早晚2次觀察。根據(jù)二次打擊學(xué)說[2]，術(shù)后24 h腹腔內(nèi)注射內(nèi)毒素10 μg/kg[3]模擬人類膿毒血癥時(shí)內(nèi)毒素釋放入血的特點(diǎn)，導(dǎo)致MODS。經(jīng)歷創(chuàng)傷和感染的2次打擊，使動(dòng)物能對(duì)創(chuàng)傷和感染因素表現(xiàn)出器官功能由代償?shù)绞Т鷥數(shù)姆磻?yīng)過程。(3)模型移植治療組15只，手術(shù)創(chuàng)傷失血性休克合并內(nèi)毒素感染性休克導(dǎo)致MODS，進(jìn)行骨髓干細(xì)胞回輸治療。術(shù)前一晚，兔禁食不禁水過夜。實(shí)驗(yàn)用材料、試劑等均無(wú)菌、無(wú)熱源。

1.2臨床表現(xiàn)觀察 通過放血和回輸?shù)姆椒ㄊ寡獕壕S持40 mm Hg 1 h，體溫下降2～3 ℃，大小便失禁，血循環(huán)發(fā)生嚴(yán)重不足，皮膚紫紺。各組觀察呼吸、心率、血壓、精神狀態(tài)、肛溫、血常規(guī)、在第1、7、14、21、28天對(duì)3組抽血化驗(yàn)谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、尿素氮(BUN)、肌酐(Scr)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)、二氧化碳分壓(PaCO2)、氧分壓(PaO2)等。

1.3BMSCs的分離及培養(yǎng) 另取健康兔5只，在兔髂后上棘進(jìn)行骨髓穿刺，抽取5 mL骨髓，輕搖使之充分混勻，經(jīng)洗滌、離心，制備細(xì)胞懸液，采用密度梯度離心法聯(lián)合貼壁培養(yǎng)分離純化的方法，選出較高純度貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞，轉(zhuǎn)入37 ℃、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，經(jīng)3～4次傳代后，形成較典型的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。在模型成功制作24 h后，將體外分離、擴(kuò)增、標(biāo)記的BMSCs按照3×106cells/kg通過股動(dòng)脈沿升主動(dòng)脈至左心室進(jìn)行回輸。

1.4病理檢查準(zhǔn)備 第28天利用空氣栓塞處死正常組、模型組和模型移植治療組兔取心、肺、腎、肝、脾等器官，進(jìn)行病理檢查及切片。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)分析軟件處理，比較用χ2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1臨床表現(xiàn) 正常組兔精神好，活動(dòng)如常，毛發(fā)有光澤，飲食、飲水及大便無(wú)異常，觀察期間無(wú)死亡。模型組兔癥狀、體征變化明顯，出現(xiàn)精神萎靡，反應(yīng)遲鈍，結(jié)膜蒼白，口唇發(fā)紺，2 d后部分動(dòng)物出現(xiàn)呼吸急促，呼吸頻率大于120次/分，雙肺伴有濕羅音，部分伴有顫抖，進(jìn)食、進(jìn)水明顯減少，10 d左右毛發(fā)失去光澤，部分出現(xiàn)脫落。肛溫明顯升高或下降(小于36 ℃)，體質(zhì)量下降，白細(xì)胞最初表現(xiàn)為明顯的下降，后表現(xiàn)為持續(xù)的上升，表現(xiàn)為全身炎癥反應(yīng)的過程。觀察期間超過50%(8只)死亡。模型移植治療組經(jīng)過干細(xì)胞移植回輸治療15 d后，兔呼吸狀況得到改善，癥狀出現(xiàn)好轉(zhuǎn)，雙肺羅音消失，4周后大部分動(dòng)物基本恢復(fù)正常。手術(shù)后，各項(xiàng)生化指標(biāo)(PaO2、BUN、ALT、CK-MB)升高；打內(nèi)毒素后，升高更加明顯；移植治療組第1、7天與模型組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；第14、21、28天各項(xiàng)生化指標(biāo)明顯下降，與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.2病理檢查

2.2.1正常組兔心、肝、脾、腎結(jié)構(gòu)清晰未見異常，部分肺稍顯充血。

2.2.2模型組兔大體檢查及鏡下改變 心臟：大體檢查，體積增大，部分心室稍肥厚。鏡下見心肌細(xì)胞水腫變性。間質(zhì)充血水腫，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。以心內(nèi)膜下充血水腫為明顯，部分可見心內(nèi)膜分離。觀察期間死亡兔：心肌肌漿溶解或呈顆粒狀凝聚致染色分布不均，呈強(qiáng)嗜伊紅染色，部分橫紋模糊不清或消失，心肌出現(xiàn)大小不等的空泡，心肌凝固性壞死或液化性壞死。間質(zhì)水腫，大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。肺臟：雙肺大體檢查，飽滿腫脹，多有點(diǎn)片狀出血，有的呈灰紅色實(shí)變。鏡下：肺泡水腫，淤血，肺泡腔大量紅細(xì)胞、白細(xì)胞及細(xì)胞碎片，并見有肺實(shí)變。肺間質(zhì)水腫，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，部分以中性粒細(xì)胞聚積為主，局部組織細(xì)胞增生，可見核分裂。毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞腫脹，紅細(xì)胞淤積，形成微血栓。觀察期間死亡兔部分肺顯著水腫、部分實(shí)變明顯。肝臟：大體檢查，肝腫脹、包膜緊張，肝實(shí)質(zhì)呈暗紅，淤血明顯，部分可見黃白色壞死灶，偶有點(diǎn)狀出血。鏡下：肝細(xì)胞排列紊亂,大部分細(xì)胞變性濁腫甚至空泡樣改變，可見嗜酸性變化和毛玻璃樣變性，核固縮，有細(xì)胞凋亡，部分脂肪變性，部分可見肝細(xì)胞萎縮、點(diǎn)狀或小片狀壞死，周圍炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。肝竇淤血擴(kuò)張，門管區(qū)明顯炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，枯否細(xì)胞明顯增生。腎臟：大體檢查，腎體積增大，腫脹，呈片狀淤血性改變。鏡下：腎小球顯著淤血或缺血，部分腎小球萎縮、消失，腎小管上皮細(xì)胞濁腫，毛玻璃樣變性，部分可見上皮細(xì)胞壞死脫落，腎小管管腔變小。腎間質(zhì)充血水腫，大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。部分間質(zhì)彌漫性出血，大量紅細(xì)胞堆積，部分腎小管壞死鈣鹽沉積。脾臟：大體檢查呈暗紅色，鏡下檢查脾竇擴(kuò)張淤血。

2.2.3模型移植治療組兔大體檢查及鏡下改變 心、肺、肝、腎、脾大體檢查無(wú)明顯變化。鏡下見心肌細(xì)胞少數(shù)水腫變性；肺部分充血，部分伴少量淋巴細(xì)胞為主的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。肝輕度淤血，肝細(xì)胞稍濁腫、少數(shù)空泡樣改變，可見單個(gè)肝細(xì)胞壞死。腎部分腎小球輕度充血、近曲小管輕度水腫；脾輕度淤血。3組兔重要器官顯微鏡下病理改變比較，見彩插Ⅰ、Ⅱ圖1～4。

3 討 論

MODS是指在嚴(yán)重感染、創(chuàng)傷、大手術(shù)及心肺復(fù)蘇后等狀態(tài)下，機(jī)體同時(shí)或相繼發(fā)生2個(gè)或2個(gè)以上器官系統(tǒng)功能衰竭的臨床綜合征。MODS一直是當(dāng)今創(chuàng)傷外科和危重病醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中研究的熱點(diǎn)課題。Friedenstein等在骨髓單核細(xì)胞體外培養(yǎng)過程中觀察到一種牢固貼壁的梭狀細(xì)胞群，并建立了貼壁培養(yǎng)法。Piersma等將這類骨髓中含有的具備自我更新能力和多向分化潛能的干細(xì)胞命名為BMSCs。目前，對(duì)于BMSCs的分離純化方法主要有密度梯度離心法、貼壁培養(yǎng)/篩選法、流式細(xì)胞儀分離法(FACS)和免疫磁珠分離法(MACS)。BMSCs在特定條件誘導(dǎo)下，體外培養(yǎng)BMSCs 可向成骨細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞、骨骼肌細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、心肌細(xì)胞和脂肪細(xì)胞、神經(jīng)元樣細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞等分化[4-8]。有研究發(fā)現(xiàn)，BMSCs 可在一定條件誘導(dǎo)下能跨胚層橫向分化為肝、胰島、腎小管等細(xì)胞[9-11]。

本研究通過二次打擊成功造模，MODS模型兔消化、呼吸、神經(jīng)系統(tǒng)臨床癥狀明顯，并有超過50%死亡。心、肺、肝、腎等重要臟器顯著淤血、腫脹、變性壞死，肝細(xì)胞和腎小管空泡變性，部分腎小管壞死后鈣鹽沉積；肺實(shí)變，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，通氣功能障礙。體外分離培養(yǎng)篩選純化骨髓干細(xì)胞，并成功把BMSCs移植進(jìn)入模型組兔，經(jīng)BMSCs移植治療的MODS模型組兔的臨床癥狀、生化指標(biāo)及病理改變明顯減輕， 14 d后PaCO2、BUN、ALT、CK-MB等項(xiàng)生化指標(biāo)逐漸恢復(fù)正常。治療組兔逐漸好轉(zhuǎn)，消化功能正常，呼吸平穩(wěn)，大小便正常并全部存活。

關(guān)于BMSCs用于MODS治療未見報(bào)道，但有通過細(xì)胞分化、細(xì)胞融合和自分泌或旁分泌等機(jī)制治療血管病變、冠心病、腦梗死、肝損傷、腎病、肺損傷等的研究報(bào)道[12]。多項(xiàng)研究證實(shí)，BMSCs具有向缺血或損傷組織歸巢的特性，植入模型兔進(jìn)到缺血組織后與宿主受損組織相互作用，能夠自分泌或旁分泌一系列因子，參與移植治療后的免疫調(diào)節(jié)[13]?？墒箍寡准?xì)胞因子IL-10、FGF-2、TNF-α和Bcl-2蛋白明顯上調(diào)，提示，BMSCs誘導(dǎo)的早期肝臟和腎臟保護(hù)可能主要是通過旁分泌的抗炎功能實(shí)現(xiàn)的[14]。通過抗凋亡，誘導(dǎo)血管生成而改善梗死心肌的功能[15]，抗炎和促進(jìn)增殖及存活等效應(yīng)明顯改善缺血后心臟、肝臟及腎臟等器官功能，促進(jìn)組織修復(fù)，表明對(duì)MODS的治療可能。本研究結(jié)果提示，BMSCs移植治療的MODS模型組兔是成功的，但仍需再增加病例數(shù)及觀察項(xiàng)目，更加細(xì)致地觀察治療過程中的改變。

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