酶聯(lián)免疫吸附法檢測HBsAg結(jié)果的影響因素探討

王一丁

（遂寧市中醫(yī)院檢驗(yàn)科，四川遂寧629000）

酶聯(lián)免疫吸附法檢測HBsAg結(jié)果的影響因素探討

王一丁

（遂寧市中醫(yī)院檢驗(yàn)科，四川遂寧629000）

目的探討不同因素對(duì)酶聯(lián)免疫吸附法檢測HBsAg結(jié)果的影響。方法采用同一批次的試劑對(duì)不同狀態(tài)的血清標(biāo)本進(jìn)行同步檢測，對(duì)結(jié)果進(jìn)行比較分析。結(jié)果A組(不抗凝血液標(biāo)本)HBsAg陽性檢出率分別為44.4%、11.1%和0%。B組(抗凝劑血液標(biāo)本)HBsAg陽性檢出率分別為0%、33.3%和0%。C組(含血細(xì)胞標(biāo)本)HBsAg陽性檢出率分別為22.2%、66.7%和100%。結(jié)論引起結(jié)果有誤的原因有外源性和內(nèi)源性，其中最主要的是標(biāo)本有溶血或者渾濁現(xiàn)象。為了最大限度地減少誤差的發(fā)生，要對(duì)血清標(biāo)本的不同情況采取相應(yīng)的處理。

酶聯(lián)免疫吸附測試；乙型肝炎表面抗原；影響因素

乙型肝炎表面抗原（HBsAg）是病毒HBV在肝細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的產(chǎn)物，也是人體感染乙肝病毒后首先出現(xiàn)的血清標(biāo)志物[1]。HBsAg陽性可見于急性乙型肝炎患者潛伏期、急性感染期、慢性乙型肝炎、無癥狀HBsAgHBV攜帶者。因此HBsAg是乙型肝炎的主要感染指標(biāo)之一。在臨床上，酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）因其靈敏度高、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)而在HBsAg檢測中被廣泛應(yīng)用。但是實(shí)際上在用此法檢測HBsAg時(shí)常常會(huì)出現(xiàn)假陽性、假陰性及重復(fù)性不好的現(xiàn)象[2]。尤其是假陽性檢查結(jié)果往往會(huì)給體檢人群帶來巨大的思想負(fù)擔(dān)，容易引發(fā)對(duì)醫(yī)療人員的投訴，造成不必要的麻煩[3]。針對(duì)此類現(xiàn)象，筆者現(xiàn)采用同一批次試劑對(duì)不同的血清標(biāo)本進(jìn)行重復(fù)檢測，以分析影響HBsAg檢測結(jié)果的因素，使其假陽性率更低，結(jié)果更加準(zhǔn)確，現(xiàn)報(bào)道如下：

1 材料與方法

1.1 一般材料選取我院2010年7月至2011年7月27例體檢人群做乙肝兩對(duì)半的靜脈血血清標(biāo)本81份。采用上?？迫A生物工程股份有限公司生產(chǎn)的乙肝酶聯(lián)免疫HBsAg診斷酶聯(lián)免疫試劑盒及Anthos1010酶標(biāo)儀和Anthos Fluido洗板機(jī)。

1.2 方法分組與檢測方法嚴(yán)格按照試劑和儀器說明書里的內(nèi)容操作。在吸取血清的過程中要小心，避免人為破壞性因素[4]。將27例健康人血液標(biāo)本分別取3管，平均分為A、B、C 3組，共81份標(biāo)本。A組27份為不抗凝血液標(biāo)本，分為3小組，每組9例，分別靜置0.5 h、1 h和2 h后，靜置后離心15 min，取出血清分別檢測HBsAg。B組27份為加抗凝劑血液標(biāo)本，平均分為3組，每組各9例，分別裝入不抗凝管、肝素鈉抗凝管和枸櫞酸那鈉抗凝管，其中不抗凝管靜置2 h后離心，再靜置15 min。C組27份為含血細(xì)胞標(biāo)本，抽取其中健康人血液標(biāo)本，取0.2 ml血細(xì)胞和1.2 ml血清稀釋成含有不同濃度血細(xì)胞的標(biāo)本，檢測HBsAg含量。

2 結(jié)果

2.1 A組A組不抗凝標(biāo)本中，凝血0.5 h、1 h、2 h的HBsAg陽性檢出率分別為44.4%(4/9)、11.1%（1/9）和0（0/9）。

2.2 B組B組分別裝入不抗凝管、肝素鈉抗凝管和枸櫞酸那鈉抗凝管的HBsAg陽性檢出率分別為0%(0/9)、33.3%（3/9）和0%(0/9)。

2.3 C組C組中隨著血細(xì)胞濃度的增高，HBsAg陽性檢出率也隨之增高，分別為22.2%（2/9）、66.7%（6/9）和100%（9/9）。

3 討論

體檢時(shí)，血液中心和血站對(duì)供血者健康檢查中要求HBsAg為陰性，因此HBsAg的結(jié)果是否準(zhǔn)確有著至關(guān)重要的意義。最常用的ELISA標(biāo)本是血清，而血漿和血清的不同之處在于前者含有纖維蛋白原和抗凝劑，一般檢驗(yàn)中均以血清作為檢測的標(biāo)本。ELISA一步法檢測乙肝兩對(duì)半可以使操作步驟簡化，縮短檢驗(yàn)時(shí)間，同時(shí)應(yīng)用高親和力的單克隆抗體或者高純度的抗原可以顯著提高檢測的特異性和敏感性[5]。

3.1 結(jié)果分析本研究中A組為不抗凝血液標(biāo)本組，結(jié)果顯示，在血液自我凝固時(shí)間為0.5 h和1 h就強(qiáng)行分離血清檢測HbsAg的假陽性率為44.4%和11.1%。有時(shí)候體檢人員為了節(jié)省時(shí)間快速檢測，經(jīng)常會(huì)在血液還沒有開始凝固的時(shí)候就強(qiáng)行分離血清，這樣很容易造成假陽性的結(jié)果誤導(dǎo)。若體檢者在次日復(fù)查同一指標(biāo)，完全可以因?yàn)檠阂呀?jīng)完全凝固，血清中不含有纖維蛋白原而檢測出陰性的結(jié)果。而血清分離不徹底的原因還會(huì)有以下一些情況：1）血清中殘留有部分纖維蛋白原，容易附著在反應(yīng)孔壁或者在氣孔凝集，兩種情況都可以將酶結(jié)合物吸附在反應(yīng)孔中無法洗滌干凈，因而產(chǎn)生假陽性結(jié)果[6]。2）纖維蛋白原反應(yīng)的微環(huán)境發(fā)生改變，會(huì)降低檢驗(yàn)的靈敏度，從而產(chǎn)生假陰性。B組為加入抗凝劑的標(biāo)本，結(jié)果顯示，肝素鈉抗凝管中HBsAg出現(xiàn)33.3%的假陽性后果，可能原因是由于各種人為因素引起標(biāo)本溶血，使紅細(xì)胞產(chǎn)生溶解，細(xì)胞內(nèi)的過氧化物酶進(jìn)入血漿，并大量吸附于細(xì)胞碎片及纖維蛋白原上，增加了加樣后微孔的洗滌難度，同時(shí)抗凝劑在抗凝過程中合成了結(jié)合物，使ELISA系統(tǒng)中的過氧化物酶顯色出現(xiàn)異常，使結(jié)果不一致[7]。因此在工作人員采血時(shí)系帶時(shí)間不要過久，抽血時(shí)放慢速度，同時(shí)保存處理好標(biāo)本，防止溶血。C組為含有血細(xì)胞的標(biāo)本。大多情況下血清為帶血細(xì)胞標(biāo)本，而其中紅細(xì)胞里的亞鐵血紅素具有過氧化物酶的活性，如果反應(yīng)孔因?yàn)榉翘禺愋晕郊t細(xì)胞，加入底物后產(chǎn)生顯色反應(yīng)，就會(huì)產(chǎn)生假陽性后結(jié)果。隨著血細(xì)胞濃度的升高，假陽性的比例也在上升。

3.2 試劑的選擇隨著科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，肝炎標(biāo)志物的檢驗(yàn)方法也在不斷更新提高。各生產(chǎn)廠家生產(chǎn)的酶聯(lián)免疫吸附試劑盒在很大程度上方便了基層單位開展日常工作。然而，即使是同一試劑盒，不同廠家生產(chǎn)的試劑靈敏度與特異性均存在一定差別。有的廠家酶標(biāo)板孔間A值差甚至大于15%，標(biāo)記酶的活性及顯色液的穩(wěn)定性不好。使用劣質(zhì)試劑必然使結(jié)果的錯(cuò)誤率上升。因此應(yīng)該選擇高質(zhì)量的試劑盒，從外源性因素上最大程度地降低錯(cuò)誤率[8]。

3.3 標(biāo)本因素的影響標(biāo)本污染：標(biāo)本受到細(xì)菌的污染，菌體內(nèi)可能含有辣根過氧化物酶，容易產(chǎn)生非特異性顯色，出現(xiàn)假陽性；標(biāo)本放置時(shí)間過久：在冰箱中存放過久的標(biāo)本，其血清IgG可聚合為多聚體，甲胎蛋白可以形成二聚體，在ELISA測定中會(huì)造成假陽性[9]。若采血后不在當(dāng)天檢測，標(biāo)本應(yīng)放在2℃～8℃的冰箱里保存。標(biāo)本若需儲(chǔ)存較長時(shí)間，則應(yīng)吸出血清放在-20℃的冰箱內(nèi)保存[10]。

3.4 操作因素工作人員在加樣時(shí)應(yīng)使用一次性吸嘴，避免交叉污染。加樣品、酶結(jié)合物和底物時(shí)都應(yīng)該將所加物質(zhì)加在ELISA板孔的底部，不應(yīng)加在孔壁上部，而且要注意不可以濺出和產(chǎn)生氣泡，否則也會(huì)影響結(jié)果的準(zhǔn)確性[11]。在人工操作時(shí)，加樣板過多會(huì)造成加樣后放入孵箱前等待時(shí)間過久，或孵育時(shí)沒有加蓋，使標(biāo)本蒸發(fā)吸附在孔壁上，或者人為延長孵育時(shí)間，使非特異性結(jié)合緊附在反應(yīng)孔周圍不好易徹底清洗干凈，造成假陽性。所以在加樣后要及時(shí)放入孵箱，標(biāo)本數(shù)量過多時(shí)要分批操作并加蓋，嚴(yán)格按照說明書控制操作時(shí)間，最大限度減少假陽性的發(fā)生。

3.5 洗滌洗滌在此法中雖不是一個(gè)反應(yīng)步驟，但卻對(duì)試驗(yàn)的成功與否至關(guān)重要。洗滌時(shí)為了洗去反應(yīng)液中沒有與固態(tài)抗原抗體結(jié)合的物質(zhì)以及反應(yīng)過程中非特異性吸附于固體載體的干擾物。洗滌時(shí)的水切勿重復(fù)反復(fù)利用，避免交叉感染現(xiàn)象的發(fā)生。要將留在孔中的殘余酶標(biāo)記物和血液成分等徹底清洗干凈，避免因清洗不徹底產(chǎn)生誤差[12]。

4 總結(jié)

通過以上分析，我們認(rèn)為在HBsAg檢測過程中注意以下幾點(diǎn)可減少假陽性的發(fā)生：1）當(dāng)天氣寒冷時(shí)，應(yīng)將血液標(biāo)本應(yīng)置于浮箱內(nèi)孵育足夠的時(shí)間，待血液標(biāo)本完全凝固后分離血清；臨床采集的血液標(biāo)本不要進(jìn)行強(qiáng)制分離，建議工作人員將采集的標(biāo)本置于37℃孵箱內(nèi)保存1～2 h[13]。2）要嚴(yán)格避免標(biāo)本出現(xiàn)溶血現(xiàn)象，血紅蛋白中含有亞鐵血紅素，有類似過氧化物酶的作用活性類似于過氧化物，因此在以辣根過氧化物酶為標(biāo)記的ELISA測定中，如果血清紅蛋白的濃度過高，很容易在溫育的過程中吸附在ELISA包板聚乙稀板孔，與加入的辣根過氧化物酶底物產(chǎn)生顯色反應(yīng)，因此在采集標(biāo)本中要盡量避免溶血。3）血清不能用于肝素鈉抗凝，因?yàn)楦嗡剽c在ELISA測定中會(huì)抑制酶的活性[14]。

綜上所述，影響HBsAg檢測結(jié)果的因素有很多。為了避免檢測結(jié)果出現(xiàn)呈假陽性而誤導(dǎo)工作人員和體檢人員，要求檢驗(yàn)人員從多方面嚴(yán)格控制質(zhì)量，以期達(dá)到最大限度地降低假陽性率。

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Influencing factors of the detection of HBsAg by ELISA.

WANG Yi-ding.Department of Clinical Laboratory, Suining Municipal Hospital of TCM,Suining 629000,Sichuan,CHINA

ObjectiveTo explore the impact of different factors on the detection of HBsAg by Enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA).MethodsSerum samples of different status were detected synchronously by the same batch of reagents through ELISA.The results were analyzed.ResultsThe positive rate pf HBsAg was 44.4%、11.1%and 0%in group A(blood samples without anticoagulation),0%,33.3% and 0%in group B(blood samples with anticoagulation),22.2%,66.7%and 100%in group C(blood cell samples).ConclusionInaccurate detection results were tend to be caused by exogenous and endogenous factors,mainly hemolysis or turbidity in the specimen.In order to minimize the occurrence of error,appropriate measures should be taken to treat the serum samples according to the individual status of the serum sample.

Enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA);HBsAg;Influencing factor

R446.61

B

1003—6350（2012）24—103—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2012.24.044

2012-10-29）

王一丁（1959—），男，四川省遂寧市人，副主任技師，本科。