申愛榮， 譚著明, 曾糧斌

(1.湖南省林業(yè)科學(xué)院， 湖南 長(zhǎng)沙 410004； 2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院麻類研究所， 湖南 長(zhǎng)沙 410205)

蛹蟲草人工液體發(fā)酵的研究進(jìn)展

申愛榮1， 譚著明1, 曾糧斌2

(1.湖南省林業(yè)科學(xué)院， 湖南 長(zhǎng)沙 410004； 2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院麻類研究所， 湖南 長(zhǎng)沙 410205)

概述了近年來蛹蟲草在菌種選育、液體發(fā)酵上的研究進(jìn)展，探討了蛹蟲草今后研究重點(diǎn)，以期為蛹蟲草人工發(fā)酵產(chǎn)業(yè)化發(fā)展提供參考。

蛹蟲草; 人工液體發(fā)酵; 研究進(jìn)展

蛹蟲草(Cordycepsmilitaris)又稱北冬蟲夏草，屬麥角菌科(Clavicipitaceae) 蟲草菌屬(Cordyceps)。蛹蟲草中含有多種能提高人體免疫力的生物活性物質(zhì)，如蛹蟲草菌素(cordycepin)、蟲草多糖(cordycepic polysaccharide)和蟲草酸(cordycepic acid)等。它的主要化學(xué)成分與冬蟲夏草基本相同，對(duì)于生長(zhǎng)環(huán)境的要求較冬蟲夏草低，可以通過液體發(fā)酵生產(chǎn)菌絲體，或人工大規(guī)模固體培養(yǎng)獲得子實(shí)體。雖然蛹蟲草可以通過人工固體培育獲得子實(shí)體，但與液體深層發(fā)酵相比所需時(shí)間長(zhǎng)，耗時(shí)耗力，而液體深層發(fā)酵培養(yǎng)基來源豐富，條件易于控制，生產(chǎn)周期較短，產(chǎn)量穩(wěn)定[1]。因此，近年來蛹蟲草液體深層發(fā)酵取得了迅速的發(fā)展。筆者綜述了近年來蛹蟲草在菌種選育和液體深層發(fā)酵上的研究進(jìn)展，以期為蛹蟲草人工發(fā)酵產(chǎn)業(yè)化發(fā)展提供參考。

蛹蟲草中糖、脂肪和蛋白質(zhì)的總含量高達(dá)60%以上，且蛋白質(zhì)含量較高，脂肪含量較低，可滿足人們對(duì)高蛋白低脂肪的滋補(bǔ)保健品的要求[1]。蛹蟲草中還含有18種氨基酸、30 多種微量元素和多種維生素，以及含量高于冬蟲夏草的甘露醇、蟲草素、腺苷等活性成分，尿嘧啶、尿苷、腺嘌呤、多糖、甘露醇、蟲草素、甾類、超氧化物歧化酶( SOD) 等生物活性物質(zhì)的高含量,使得蛹蟲草具有抗腫瘤、抗菌、保護(hù)肝腎及呼吸系統(tǒng)、抗氧化、調(diào)節(jié)免疫力以及調(diào)節(jié)內(nèi)分泌與抗疲勞的藥理作用, 對(duì)慢性支氣管炎、肝炎、高血壓、心臟病、腎炎、腎衰、癌癥及消除疲勞、緊張等有顯著的冶療和預(yù)防作用[1-2]。

1 蛹蟲草菌種的選育

菌種選育是篩選高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)蛹蟲草生產(chǎn)菌株的關(guān)鍵。菌種的選育方法比較多，常用的方法有菌落形態(tài)觀察法、海選法、化學(xué)誘變、物理誘變、原生質(zhì)體融合和基因改良。袁雪芬[3]通過從子實(shí)體上分離菌株的菌落形態(tài)觀察，并從中選取部分進(jìn)行子實(shí)體產(chǎn)生實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，菌落顏色為杏橙色且氣生菌絲較少的菌株搖培后菌絲球較小而且密集，出草率及產(chǎn)量均高。孫軍德等[4]通過對(duì)5株蛹蟲草的菌絲形態(tài)、生長(zhǎng)速率、液體培養(yǎng)生物量和胞外多糖、人工栽培和子實(shí)體中活性物質(zhì)蟲草多糖與蟲草素的對(duì)比研究，篩選出優(yōu)良的蛹蟲草菌株。胡事君等[5]闡述了菌種與培養(yǎng)方法相互篩選的技術(shù)方案。陳宏偉等[6]通過大量篩選菌株，篩選出來富鍺能力最強(qiáng)的菌株28號(hào)和14號(hào)，在鍺濃度為500μg/mL時(shí)，生物量分別為15.09mg/mL和13.84mg/mL，有機(jī)鍺轉(zhuǎn)化率可分別達(dá)到2.3%和1.9%。翟景波等[7]采用亞硝基胍進(jìn)行誘變，成功選育出1株高產(chǎn)蛹蟲草誘變菌株H4025。王陶等[8]采用離子束注入蛹蟲草，選育出富鍺能力強(qiáng)的10號(hào)菌株，在鍺濃度為200mg/L時(shí)，菌絲體內(nèi)的鍺含量，比誘變前增加61.25%。周禮紅等[9]通過對(duì)蛹蟲草原生質(zhì)體進(jìn)行紫外誘變, 篩選到1株優(yōu)良的菌株CMM-81, 蟲草菌素含量是出發(fā)菌株的2倍, 經(jīng)過連續(xù)15 代傳代培養(yǎng), 蟲草菌素和腺苷的含量保持穩(wěn)定。熊承慧等[10]通過真菌轉(zhuǎn)化方法將來源于構(gòu)巢曲霉的GPx基因分別轉(zhuǎn)化到已經(jīng)退化菌株的ZYF和能夠正常結(jié)實(shí)的CM01兩株不同的蛹蟲草菌株中進(jìn)行過量表達(dá)。在轉(zhuǎn)入谷朧甘膚過氧化物酶后，ZYF菌株可恢復(fù)子實(shí)體生長(zhǎng)的能力，而CM01菌株能夠在繼代過程中持續(xù)維持性狀穩(wěn)定性。

2 蛹蟲草液體深層發(fā)酵

蛹蟲草菌絲體的液體深層發(fā)酵是發(fā)展蛹蟲草產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)的新途徑，因其菌絲體生長(zhǎng)快，生產(chǎn)周期短，可大規(guī)模工廠化生產(chǎn)，開發(fā)前景好。蛹蟲草菌絲體的生長(zhǎng)和其代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生與蛹蟲草發(fā)酵培養(yǎng)基的配方及發(fā)酵條件的控制有著直接關(guān)系，因此要在蛹蟲草的液體深層發(fā)酵上取得突破，首先需要做好蛹蟲草菌種的選擇，其次是篩選出適合該菌種的發(fā)酵培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件。從20世紀(jì)90年代起，研究人員在菌種的分離和篩選、培養(yǎng)方式、培養(yǎng)條件、培養(yǎng)過程中次生代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生和動(dòng)力學(xué)變化等方面進(jìn)行了大量的研究。同時(shí)還在菌種誘變(包括化學(xué)誘變，原生質(zhì)體融合和基因改良)、液體深層發(fā)酵、次生代謝產(chǎn)物的提取和純化、與代謝產(chǎn)物相關(guān)的基因的克隆及調(diào)控、蛹蟲草子實(shí)體的人工培養(yǎng)、蛹蟲草產(chǎn)品的開發(fā)等方面進(jìn)行了深入的研究和探討，為蛹蟲草的人工發(fā)酵和人工栽培開拓了新思路。

2.1 培養(yǎng)基的優(yōu)化

培養(yǎng)基配方對(duì)蛹蟲草液體培養(yǎng)生產(chǎn)有效成分如蟲草素、腺苷、SOD、菌絲體等有著明顯的影響。溫魯?shù)萚11]認(rèn)為蠶蛹粉、豆粕和豆粉都是蛹蟲草液體發(fā)酵培養(yǎng)基中很好的氮源，碳源水平為3%～4%，振蕩培養(yǎng)8d，每瓶可產(chǎn)蟲草素和腺苷10mg以上。尹萍等[12]對(duì)北蟲草菌的液體發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行了優(yōu)化，研究表明發(fā)酵培養(yǎng)基以蔗糖2%，蛋白胨1%，KH2PO40.10%為主，在接種量5%、培養(yǎng)溫度25℃、轉(zhuǎn)速150r/min的條件下振蕩培養(yǎng)4d，菌絲體產(chǎn)量較高。汪宇等[13]通過選擇碳、氮、無機(jī)鹽的三因素三水平正交試驗(yàn)，對(duì)蛹蟲草2001-A深層發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化。最適培養(yǎng)基組成為玉米粉2%、蛹粉0.5%、MgSO40.05%。菌絲體干重可達(dá)0.812g/50mL(4d)。雷坤等[14]以發(fā)酵液中蟲草素的含量作為指標(biāo)，優(yōu)化得出蛹蟲草Fjnu-01菌株產(chǎn)蟲草素的最適碳源為蔗糖+玉米粉，最適合氮源為蛋白胨，最適生長(zhǎng)因子為VB1，最適pH為6.4。最適培養(yǎng)基配方為：蔗糖2.80%；玉米粉0.54%；蛋白胨1.91%；KH2PO40.28%；MgSO40.15%；VB10.11‰。

2.2 發(fā)酵條件的研究

發(fā)酵條件如發(fā)酵初始pH值、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間等對(duì)蛹蟲草的發(fā)酵產(chǎn)物影響顯著。陳晉安等[15]提出蛹蟲草液體深層發(fā)酵的適宜的培養(yǎng)條件為：發(fā)酵溫度25℃，發(fā)酵初始pH值7.0，發(fā)酵周期6d。還提出在搖瓶條件下通氣量對(duì)菌體生長(zhǎng)的影響相對(duì)較小。周廣麒等[16]研究出蛹蟲草在30L生物反應(yīng)器中發(fā)酵條件：初始溫度22℃，初始pH值6.3～6.5，攪拌速度180r/min，通風(fēng)量1.21m3/h，發(fā)酵72h和96h，蛹蟲草菌絲體(干)產(chǎn)量分別為38.6g/L和42.3g/L。王英臣[17]分析不同因素對(duì)胞外多糖得率的影響，確定蛹蟲草胞外多糖發(fā)酵培養(yǎng)條件為：pH值6.5，溫度20℃；此條件下蛹蟲草胞外多糖得率為1.188g/100mL，菌絲體干重為1.221g/100mL。鄭婷婷等[18]研究出蛹蟲草菌絲體液體搖瓶最佳培養(yǎng)條件為接種量10%(v/v)，發(fā)酵初始pH值7.0，發(fā)酵溫度27℃，發(fā)酵時(shí)間96h。楊杰等[19]以蛹蟲草菌絲生物量為指標(biāo)，對(duì)發(fā)酵罐培養(yǎng)工藝進(jìn)行優(yōu)化，確定最佳接種量為20 瓶(500mL)/罐(60L)，裝液量為35L/罐，通氣量為0.9m3/h，最適的起始pH值6.45?？党萚20]考察不同液體發(fā)酵方式對(duì)蟲草素積累的影響，發(fā)酵16d后，08Y1菌株在黑暗振蕩培養(yǎng)條件下，蟲草素積累達(dá)1015.0mg/L。另外，國(guó)外的Park[21]和Kim[22]等也對(duì)蛹蟲草液體深層發(fā)酵最適條件和胞外多糖的最適生產(chǎn)條件進(jìn)行了相應(yīng)的摸索。

2.3 外源添加物

外源添加物如嘌呤類似物、鄰苯二甲酸二丁酯、金屬離子等能顯著增加蛹蟲草發(fā)酵產(chǎn)物中某種成分的產(chǎn)量。王蕾等[23]比較8種營(yíng)養(yǎng)添加物對(duì)蟲草發(fā)酵過程中蟲草素積累的影響，結(jié)果表明：添加腺苷、腺嘌呤、丙氨酸、L-天冬氨酸、甘氨酸5種物質(zhì)，對(duì)蟲草素合成的促進(jìn)作用均較明顯，均能有效提高蛹蟲草液體發(fā)酵蟲草素的產(chǎn)量。李祝等[24]研究表明：選用濃度為6%的鄰苯二甲酸二丁酯分別在08-03搖瓶培養(yǎng)到24h和120h時(shí)加入，繼續(xù)培養(yǎng)到196h，收集菌絲體，蟲草菌素總產(chǎn)量分別比未添加鄰苯二甲酸二丁酯的對(duì)照組提高了7.48倍和7.09倍。杜雙田等[25]以蛹蟲草菌株CM-003為試材，采用常規(guī)瓶栽法研究不同質(zhì)量濃度亞硒酸鈉對(duì)蛹蟲草長(zhǎng)勢(shì)、子座產(chǎn)量及子座硒含量的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著亞硒酸鈉質(zhì)量濃度的增加，蛹蟲草的長(zhǎng)勢(shì)評(píng)分和子座產(chǎn)量呈先增加后減小的趨勢(shì)，子座硒含量呈逐漸增加趨勢(shì)?？党萚20]考察了添加前體物質(zhì)(腺嘌呤1g/L+甘氨酸16g/L)，發(fā)酵16d后檢測(cè)蟲草素和腺嘌呤含量。結(jié)果表明：08Y1菌株在黑暗振蕩培養(yǎng)條件下，蟲草素積累達(dá)1015.0mg/L，腺嘌呤利用率達(dá)98.5%，說明黑暗振蕩培養(yǎng)并添加前體物質(zhì)是提高蟲草素產(chǎn)量的有效方法。

2.4 發(fā)酵產(chǎn)物的分離

通過液態(tài)深層培養(yǎng)可以快速生產(chǎn)蛹蟲草菌絲體，還可通過優(yōu)化發(fā)酵條件，提高其生物活性物質(zhì)的含量，方便目的組分的提取[21]。張紅霞等[27]用高效液相色譜法同時(shí)檢測(cè)了5株北冬蟲夏草菌株發(fā)酵液中蟲草素和腺苷的含量，并系統(tǒng)地研究了各種發(fā)酵條件對(duì)蟲草素和腺苷含量的影響。結(jié)果表明，蟲草素和腺苷在所設(shè)色譜條件下得到了很好的分離，二組分的線性關(guān)系良好，其中蟲草素峰保留時(shí)間為11.443min，腺苷峰保留時(shí)間為9.054min；蟲草素的回收率為103.22%，RSD=4.4%，腺苷的回收率為98.42%，RSD=3.2%；蟲草素和腺苷的線性范圍分別為0.49～98μg/mL，0.46～92μg/mL。

3 展望

目前，關(guān)于蛹蟲草液體深層發(fā)酵的研究比較系統(tǒng)和深入，但仍存在不足之處。首先，蛹蟲草本身不具抗菌能力，易受到雜菌的污染，而且蛹蟲草液體深層發(fā)酵周期相對(duì)較長(zhǎng)，一般10～15d，長(zhǎng)的多達(dá)20d，子實(shí)體培養(yǎng)周期更長(zhǎng)，長(zhǎng)達(dá)幾個(gè)月，要完全保障其不受污染，需要加強(qiáng)對(duì)蛹蟲草專用液體發(fā)酵器的研制和開發(fā)，而現(xiàn)階段該方面研究很不夠，所用的發(fā)酵器主要是市面上能購(gòu)買的生物發(fā)酵罐，價(jià)格昂貴，且清洗困難，尤其是到菌絲生長(zhǎng)后期，罐內(nèi)菌液粘度大，耗能大；其次蛹蟲草菌種分離過程中菌體消亡嚴(yán)重，繼代培養(yǎng)退化嚴(yán)重，菌種在培養(yǎng)3～5代即會(huì)出現(xiàn)嚴(yán)重退化，需要不斷復(fù)壯，加大了菌種保存的難度；再次，對(duì)蛹蟲草液體深層發(fā)酵過程的動(dòng)態(tài)變化知之甚少，缺乏該方面的研究和對(duì)發(fā)酵過程的動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)。

因此，今后研究應(yīng)該在以下幾個(gè)方面加強(qiáng)。首先，加強(qiáng)蛹蟲草專用發(fā)酵器的研發(fā)，設(shè)計(jì)生產(chǎn)出價(jià)格低廉的且適合蟲草等長(zhǎng)周期連續(xù)發(fā)酵的新型發(fā)酵罐。其次利用物理化學(xué)誘變、原生質(zhì)體融合和基因改良進(jìn)行菌種的選育，篩選一批高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的生產(chǎn)菌株用于工廠化生產(chǎn)。同時(shí)加強(qiáng)發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵條件的優(yōu)化，加強(qiáng)發(fā)酵過程的動(dòng)態(tài)監(jiān)控研究，提高菌種對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)基的利用率，為蛹蟲草的合理開發(fā)和利用打下堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

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(文字編校：楊 駿,龔玉子)

ResearchadvancementofartificialfermentationofCordycepsmilitaris

SHEN Airong1, TAN Zhuming1， ZENG Liangbin2

(1.Hunan Academy of Forestry Changsha 410004, China; 2.Institute of Bast Fiber Crops, CAAS, Changsha 410205, China)

The research advancement were reviewed in the breeding, liquid fermentation and discussed the future research emphasis ofCordycepsmilitaris, to look forC.militarisfermentation industrial development to provide reference.

Cordycepsmilitaris; artificial liquid fermentation; research advancement

2012 — 09 — 15

2012 — 10 — 12

中央財(cái)政林業(yè)科技推廣項(xiàng)目([2011]XT 003)。

申愛榮(1980 — )，女，湖南省邵東縣人，助理研究員，主要從事森林微生物資源利用方面的研究。

TQ 920.1

A

1003 — 5710(2012)05 — 0142 — 04

10. 3969/j. issn. 1003 — 5710. 2012. 05. 039