高志民 劉 青

（國際竹藤中心 國家林業(yè)局竹藤科學(xué)與技術(shù)重點開放實驗室北 京 100102）

隨著人們對竹類植物開發(fā)利用的不斷深入，國際上對竹類植物的研究興趣日趨增強。在過去的10年中，人們對竹類植物的開發(fā)利用得到了飛速發(fā)展，這主要得益于相關(guān)技術(shù)的不斷完善，其中作為竹類植物快速繁殖的重要手段——組織培養(yǎng)技術(shù)也得到了相當(dāng)程度的發(fā)展和完善，已經(jīng)成為有效的大量獲得竹類植物種苗的可行方法，既能快速實現(xiàn)擴繁，又比分株、扦插、埋兜等傳統(tǒng)方式大大降低實際成本，對一些重要經(jīng)濟竹種的快速繁殖起到了積極的推動作用。同時，組織培養(yǎng)技術(shù)也為竹類植物的種質(zhì)保存、次生代謝物質(zhì)的深度開發(fā)利用提供了新途徑。現(xiàn)對最近10年來國外在竹類植物組織培養(yǎng)方面取得的研究新進(jìn)展進(jìn)行概述。

1 基于固體培養(yǎng)基的組織培養(yǎng)

多數(shù)成功組織培養(yǎng)繁殖的竹種是以MS為基本培養(yǎng)基，以蔗糖或葡萄糖（濃度25%～30%）為碳源，添加一定濃度的瓊脂或卡拉膠（0.5%～0.8%）作為凝固劑，通常pH 5.8～6.5，根據(jù)不同的外植體類型以及不同培養(yǎng)階段添加相應(yīng)濃度的生長調(diào)節(jié)物質(zhì)(2,4-D、6-BA、KT、TDZ、NAA、IAA及IBA等)。培養(yǎng)過程中即便是同一竹種的誘導(dǎo)分化、增殖及生根所需培養(yǎng)基的成分也存在著一定的差異，不同竹種的不同的培養(yǎng)階段所需培養(yǎng)基成分的差異則更大。因此，目前尚沒有一個廣譜性的配方適用于不同的竹種。

1.1 莖段側(cè)芽外植體繁殖

近10年來，國外應(yīng)用組織培養(yǎng)技術(shù)對竹類植物進(jìn)行繁殖研究的竹種涉及叢生竹、散生竹等20多個竹種，其中主要以叢生竹，且多數(shù)種類是“以芽繁芽” 為主。不同竹種之間組織培養(yǎng)成功的差異非常大，有的竹種比較容易成功，如以Dendrocalamus hamiltonii的單節(jié)枝段為外植體，腋芽在不添加任何生長素的MS培養(yǎng)基上10天就能發(fā)芽，芽很容易增殖且形成根莖，叢芽在MS+8 μM BAP + 1 μM NAA的培養(yǎng)基上增殖20倍，叢芽在MS+100 μΜ IBA的培養(yǎng)基中生長10天后轉(zhuǎn)至MS培養(yǎng)基生根率大于90%[1]。而對于一些竹種來說卻非常困難，對于大多數(shù)散生竹竹種僅僅是處于研究階段，如對剛竹屬的Phyllostachys bambusoides研究表明，以葉鞘為外植體，在添加8.0 mg/L 4-氨基-3,5,6-三氯吡啶羧酸的MS培養(yǎng)基上誘導(dǎo)出愈傷組織，再將愈傷轉(zhuǎn)到添加不同濃度（0，2%,4% 和 6%）的蔗糖、果糖、葡萄糖的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，黃色球形愈傷在以蔗糖為碳源且無光照的條件下能夠次生體胚發(fā)生，誘導(dǎo)生根，而在光照條件下以葡萄糖為碳源更有效。但愈傷發(fā)生和體細(xì)胞發(fā)生間的競爭決定著葉鞘細(xì)胞的分化方向[2]。

以叢生竹的莖段側(cè)芽為外植體，進(jìn)行組培擴繁成功的竹種較多，如Guadua angustifolia[3]、Dendrocalamus hamiltonii[1]、Bambusa nutans[4]、D.asper、D.giganteus、D.membranaceus、B.tulda、B.bambos、B.multiplex、Melocanna baccifera等竹種[5,6]、D.strictus[7]、B.polymorpha[8]，當(dāng)然也有少數(shù)散生竹竹種，如Phyllostachys pubescens[5]、Phyllostachys edulis[6]。不同竹種所選用的培養(yǎng)基中添加的激素種類和濃度存在著一定的差異，一般是添加生長素（IAA、NAA、IBA、2,4-D等）、細(xì)胞分裂素（6-BA、KT、BAP等），或單獨使用，或配合使用，以獲得最大增殖倍數(shù)為目的。如以Bambusa glaucescens帶節(jié)的莖段為外植體進(jìn)行腋芽增殖，應(yīng)用BA和KT都能誘導(dǎo)腋芽增殖，但2者結(jié)合的誘導(dǎo)率最高[9]。也有用莖段側(cè)芽長出的新芽，在MS+BA (1.0 mg/L)+2,4-D (1.0 mg/L)培養(yǎng)基上進(jìn)行誘導(dǎo)胚性愈傷，然后去除2,4-D，在提高BA濃度（2.5 mg/L）的培養(yǎng)基上進(jìn)行胚誘導(dǎo)，接著在富含蔗糖（8%）但不含生長調(diào)節(jié)劑的培養(yǎng)基上培養(yǎng)20 天后，胚成熟并產(chǎn)生新芽，轉(zhuǎn)化率為80%，繼續(xù)培養(yǎng)產(chǎn)生根莖，形成小苗[10]。同樣，以Drepanostachyum falcatum腋芽為外植體，通過2,4-D（20μΜ）的誘導(dǎo)在節(jié)部和立體葉片基部產(chǎn)生愈傷組織，繼而轉(zhuǎn)至含有10μM 2, 4-D + BAP(0.66 ～1.10μM)的培養(yǎng)基上培養(yǎng)產(chǎn)生胚性愈傷，在培養(yǎng)基MS +BAP (5～15 μM)上Coleoptillar stage somatic embryos 發(fā)育成生根苗[11]。

生根培養(yǎng)基多在基本培養(yǎng)基中添加一定低濃度的生長素，不同竹種之間生根能力存在較大差異，有的竹種生根比較容易，如來自Bambusa atra成年竹的腋芽在不添加外源生長素的情況下，在叢芽增殖的同時就能生根，而Dendrocalamus giganteus和D.hookeri的叢芽只有在添加IBA的生根培養(yǎng)基中才能生根，同時Dendrocalamus giganteus還需要添加生長素保護(hù)劑香豆素[12]。同一竹種的不同株齡莖段，增殖后在同一培養(yǎng)基上誘導(dǎo)生根，其生根率差異顯著。對Bambusa vulgaris ‘Striata’竹研究結(jié)果表明，應(yīng)用添加IBA（3 mg/L）的MS培養(yǎng)基，來自1年生枝條腋芽誘導(dǎo)的叢芽生根率為92%，而來自成年竹的誘導(dǎo)率僅為40%。來自Dendrocalamus giganteus幼年竹叢芽的生根率為96.7%，而來自成年竹的叢芽生根率僅為45.6%，但來自成年竹D.hookeri的叢芽生根率則比較高（88.9%）。采用在添加0.5 mg/L TDZ的繼代培養(yǎng)基，在連續(xù)光照條件下，經(jīng)過連續(xù)3次繼代后再進(jìn)行生根誘導(dǎo)，生根率可達(dá)100%[13]。

另外，通過對葡萄糖、蔗糖對生根影響的研究，證明以葡萄糖（88 mM）作為碳源，添加一定濃度的IBA（49.0μM）有助于成熟組織的生根誘導(dǎo)[14]。

1.2 種胚誘導(dǎo)繁殖

由于竹類植物特殊的生殖生物學(xué)特性，花和種子不易獲得，因此極大限制了竹類植物利用種子的胚誘導(dǎo)繁殖研究。近年來，人們利用一些獲得種子相對容易的竹種進(jìn)行了研究，雖然種子數(shù)量不多，但應(yīng)用組織培養(yǎng)技術(shù)，既可先誘導(dǎo)愈傷組織，再誘導(dǎo)芽和根的分化，即器官發(fā)生途徑；也可以不通過誘導(dǎo)愈傷組織，直接由種胚先形成芽，然后再誘導(dǎo)叢芽，由叢芽直接發(fā)育成小植株，實現(xiàn)植株的大規(guī)模擴繁。如利用Bambusa ambos var.gigantea穎果胚芽為外植體，將胚軸接種到MS + BAP (2.5～5.0μM), GA3(0.1μM) +NAA(50.0μM) + 5% 蔗糖的培養(yǎng)基上，4周后根莖（鞭）誘導(dǎo)率達(dá)到58%～100%，隨后在生長素培養(yǎng)基上生根長芽，8周后形成小苗，帶根鞭的植株移植到土壤中，實現(xiàn)快速繁殖[15]。

一般情況下，胚起源的愈傷組織容易獲得再生植株，如Dendrocalamus hamiltonii通過誘導(dǎo)愈傷組織，再由愈傷誘導(dǎo)出體細(xì)胞胚，進(jìn)而發(fā)育成植株，組培苗經(jīng)過鍛煉后移植到田間，表型觀察發(fā)現(xiàn)通過體細(xì)胞發(fā)生途徑獲得的組培苗長勢優(yōu)于以芽繁芽獲得的組培苗[16]。

2 基于液體培養(yǎng)基的組織培養(yǎng)

2.1 快速繁殖

與應(yīng)用固體培養(yǎng)基類似，基于液體培養(yǎng)基的竹類植物組織培養(yǎng)快繁也是在基本的MS培養(yǎng)基中添加適當(dāng)濃度的生長調(diào)節(jié)物質(zhì)，進(jìn)行誘導(dǎo)、增殖、生根等培養(yǎng)。如以Pseudoxytenanthera stocksii的帶芽莖段為外植體，接種在液體MS+NAA 2.68μM+ 6-BA 4.40μM中，光照60 μmol/(m2·s)，光周期12 h、28±1°C 條件下，誘導(dǎo)得到叢生芽，增殖是在液體培養(yǎng)基MS+ NAA(2.68μM)+BA (2.21μM) + ABA (283.93μM)+ 檸檬酸(118.10μM)+半胱氨酸(104.04μM)+ 谷氨酰胺(342.24μM)中進(jìn)行，每2周繼代1次，經(jīng)過45～50 天的培養(yǎng)，每個側(cè)芽可以獲得125～150 個叢芽，3～4個芽一叢在1/2 MS IBA (4.90μM)+BA(0.4 4 μ M)的液體培養(yǎng)基中生根[17]。利用Phyllostachys meyeri種子萌發(fā)后，在改良1/2 MS液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，再移植到土壤中，1.5年后莖段又重新滅菌后在1/2 MS液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，實現(xiàn)了有效增殖[18]。

2.2 懸浮培養(yǎng)與種質(zhì)保護(hù)

細(xì)胞的懸浮培養(yǎng)既可達(dá)到擴繁細(xì)胞的目的，又可用來保存種質(zhì)。在懸浮培養(yǎng)過程中，細(xì)胞自身能夠產(chǎn)生一定的激素，用UPLC—MS/MS分析了Bambusa balcooa懸浮細(xì)胞中細(xì)胞分裂素的種類及含量，結(jié)果表明用不添加任何細(xì)胞分裂素的培養(yǎng)基培養(yǎng)，懸浮細(xì)胞中產(chǎn)生的幾乎都是類異戊二烯細(xì)胞分裂素，唯一檢測到的芳香族的細(xì)胞分裂素是BA，且含量很低[19]。證明懸浮細(xì)胞自身能夠產(chǎn)生細(xì)胞分裂素，用于維持自身的生長發(fā)育，在短期內(nèi)保持細(xì)胞種質(zhì)的特性。應(yīng)用改良1/2 MS培養(yǎng)基，添加的3 μM 2,4-D成功實現(xiàn)了Phyllostachys nigra的愈傷組織誘導(dǎo)和細(xì)胞懸浮培養(yǎng)[20]。應(yīng)用液體石蠟對Dendrocalamus hamiltonii的體細(xì)胞胚浸埋保存結(jié)果表明，經(jīng)過30, 90, 180, 270和 365 天后，在含有1 mg/L BAP 和 2%蔗糖的MS培養(yǎng)基上體細(xì)胞胚的萌發(fā)率分別為79.78%，77.49%，71.22%，67.13%和59.99%[21]。這為體細(xì)胞發(fā)生組織的有效保存提供了一條新的途徑。

2.3 次生代謝物質(zhì)誘導(dǎo)與分離

在竹類植物中含有許多具有開發(fā)前景的活性物質(zhì)，但一般含量很低，直接提取獲得率非常低，細(xì)胞的懸浮培養(yǎng)給人們帶來了新的思路，通過組織培養(yǎng)技術(shù)對竹類植物的細(xì)胞進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，可以獲得優(yōu)良的細(xì)胞懸浮系，大量擴繁后用于活性物質(zhì)的分離。在添加3 μM 2,4-D的改良1/2 MS培養(yǎng)基上，成功實現(xiàn)了Phyllostachys nigra莖尖愈傷組織的誘導(dǎo)和細(xì)胞懸浮培養(yǎng)，通過熒光增白劑28 (Calco fluor White M2R)和苯胺藍(lán)染色，結(jié)果顯示愈傷葡聚糖出現(xiàn)在纖維細(xì)胞壁中，氨基酸分析顯示谷氨酰胺、γ-氨基丁酸和丙氨酸是愈傷組織中的主要氨基酸，天門冬酰胺和酪氨酸則在新生芽中大量存在[20]。從Bambusa edulis的懸浮細(xì)胞中分離獲得了堿性蔗糖酶（IT Ⅰ）和酸性蔗糖酶（ITⅡ），2者對蔗糖、棉籽糖具有β-呋喃果糖苷酶生物活性，對麥芽糖沒有活性[22]。因此，針對具有開發(fā)前景的目標(biāo)活性物質(zhì)，選擇適宜的竹種建立細(xì)胞懸浮系，對于開發(fā)特殊活性的新產(chǎn)品具有廣闊的前景。

3 討論

3.1 外植體的選擇與消毒

具有再生活力的無菌外植體是組織培養(yǎng)成功與否的關(guān)鍵因素之一，一般宜選擇生理年齡相對較小的外植體材料。由于不同外植體對殺菌劑的耐受程度存在差異，因此在消毒過程中殺菌劑及其施用時間不同，一般是以酒精（75%）與升汞（0.05%～0.2%）或次氯酸鈉（0.5%～2%）配合使用，根據(jù)不同外植體類型采用不同的滅菌時間（或濃度）和次數(shù)，其中與升汞的組合滅菌效果取良好，次氯酸鈉的效果次之。不同的季節(jié)，施用升汞滅菌的濃度存在一定的差異，如Bambusa tulda在秋冬季取外植體，用0.05%～0.1%的升汞進(jìn)行滅菌即可，而在雨季則需要施用更高濃度（0.1%～0.2%）的升汞進(jìn)行滅菌[23]。

3.2 組培快繁種苗產(chǎn)權(quán)保護(hù)

利用組織培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行竹類植物的快速繁殖，能夠在相對較短的時間內(nèi)實現(xiàn)大批量生產(chǎn)，用于生產(chǎn)實踐。在知識經(jīng)濟的今天，種苗的產(chǎn)權(quán)保護(hù)至關(guān)重要，國外已經(jīng)建立起了基于各種分子標(biāo)記的竹類植物組織培養(yǎng)繁殖個體的鑒定體系，如利用MSAP（Methylation Sensitive AFLP）鑒定Bambusa balcooa的組培苗的表型變化[24]，分別運用RAPD和ALFP技術(shù)鑒定Dendrocalamus hamiltonii[1]和Bambusa nutans[25]的組培苗的遺傳穩(wěn)定性等，這對于保障竹類植物組培種苗商業(yè)化生產(chǎn)與推廣應(yīng)用具有重要價值和現(xiàn)實意義，也是非常值得我們借鑒的。

3.3 試管開花與轉(zhuǎn)基因育種

多數(shù)竹類植物很少開花結(jié)實是阻礙其雜交育種工作的重要因素，應(yīng)用組織培養(yǎng)技術(shù)實現(xiàn)人為調(diào)控開花進(jìn)程，對于加速竹類植物的常規(guī)育種進(jìn)程具有重要的指導(dǎo)意義。對Dendrocalamuslatiflorus花序組培產(chǎn)生的綠色和白化苗繼續(xù)培養(yǎng)，在試管內(nèi)培養(yǎng)8個月后有44%的植株開花，且表型觀察花器官各部分均正常，但產(chǎn)生的花粉敗育[26]。這意味著人為調(diào)控竹類植物試管開花用于雜交育種尚需深入研究。另外，通過基因工程的技術(shù)手段來開展竹類植物的轉(zhuǎn)基因育種，有助于加速育種進(jìn)程，但需要建立完善的遺傳轉(zhuǎn)化體系，組織培養(yǎng)技術(shù)將是一個重要的環(huán)節(jié)。雖然國外已有轉(zhuǎn)化D.hamiltonii的研究，并獲得轉(zhuǎn)GUS報告基因和tlp基因的轉(zhuǎn)化子[5]，但要獲得真正實質(zhì)性的轉(zhuǎn)基因竹子還有待時日。

[1]Rajneesh K A, Janhvi M, Shyamal K N.Improved in vitro shoot multiplication and rooting ofDendrocalamus hamiltoniiNees et Arn.Ex Munro∶production of genetically uniform plants and field evaluation.Acta Physiologiae Plantarum, 2009,31(5)：961-967.

[2]Komatsu Y H, Batagin-Piotto K D, Brondani G E,Gon?alves A N, Almeida M.In vitro morphogenic response of leaf sheath ofPhyllostachys bambusoides.Jouranl of Forestry Research, 2011, 22(2)：209-215

[3]Jiménez V M, Castillo J, Tavares E, Guevara E,Montiel M.In vitro propagation of the neotropical giant bamboo,Guadua angustifoliaKunth, through axillary shoot proliferation.Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 2006, 86：(3), 389-395

[4]Negi D and Saxena S.In vitro propagation ofBambusa nutansWall.ex Munro through axillary shoot proliferation.Plant Biotechnology Report,2011, 5(1)：35-43,

[5]Sood A, Sood P, Mehta R, Kaur D, Brar J, Nadha H K, Sharma V, Bhattacharya A and Kumar R.Biotechnological approaches for propagation,conservation and improvement of important bamboos.IXth World Bamboo Congress.2012, 523-524

[6]Kumar Ad.Macroproliferation Technology For Raising Large Scale Plantations Of Sympodial Bamboos.IXth World Bamboo Congress.2012, 163-176

[7]Muivah G and Rao I U.Origin, Growth and Anatomy of the In Vitro formed Rhizome ofDendrocalamus strictusNees.IXth World Bamboo Congress.2012,589-600

[8]Arya S, Rana P K, Arya I D.Micropropagation of economically important bamboo-Bambusa polymorpha.IXth World Bamboo Congress.2012,581-587

[9]Fatima S, Rana P K.In vitro plantlet regeneration from nodal explants of field-grown culms inBambusa glaucescensWilld.Plant Biotechnology Report,2007, 1(3)：141-147

[10]Godbole S, Sood A, Thakur R, Sharma M, Ahuja P S.Somatic embryogenesis and its conversion into plantlets in a multipurpose bamboo,Dendrocalamus hamiltoniiNees et Arn.Ex Munro.Current Science,2002, 83(7)：885-889.

[11]Arya I D, Sharma R, Arya S.Somatic embryogenesis ofDrepanostachyum falcatuman important hill bamboo- a rapid means of micropropagation.IXth World Bamboo Congress.2012, 549-570

[12]Ramanayake S M S D, Maddegoda K M M N,Vitharana M C, Chaturani G D G.Root induction in three species of bamboo with different rooting abilities.Scientia Horticulturae, 2008, 118(3)：270-273

[13]Ramanayake S M S D, Meemaduma V N,Weerawardene T E.In vitro shoot proliferation and enhancement of rooting for the large-scale propagation of yellow bamboo (Bambusa vulgaris‘Striata’).Scientia Horticulturae, 2006, 110(1)：109-113

[14]Yasodha R, Kamala S, Anand K S P, Durai K P,Kalaiarasi K.Effect of glucose on in vitro rooting of mature plants ofBambusa nutans.Scientia Horticulturae, 2008, 116(1)：113-116

[15]Kapoor P and Usha R I.In vitro rhizome induction and plantlet formation from multiple shoots inBambusa bambosvar.gigantea Bennet and Gaur by using growth regulators and sucrose.Plant Cell,Tissue and Organ Culture, 2006, 85(2)：211-217

[16]Sood A, Ahuja P S, Sharma M, Sharma O P, Godbole S.In vitro protocols and field performance of elites of an important bambooDendrocalamus hamiltoniiNees et Arn.Ex Munro.Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 2002, 71(1)：55-63.

[17]Sanjaya, Rathore T S, Rai R V.Micropropagation ofPseudoxytenathera stocksiiMunro.In Vitro Cellular& Developmental Biology - Plant, 2005, 41(3)∶333-337

[18]Shinjiro O, Harutsugu Kashiwagi and Yasuo Kato.In vitro node culture of seedlings in bamboo plant,Phyllostachys meyeriMcClure.Plant Biotechnology,2008, 385(4)：381-385

[19]Van den A S, Bormans P, Peeters H, Gielis J, Prinsen E.Cytokinin dynamics in cell suspension cultures ofBambusa balcooaRoxburgh using UPLC-ESI/MS/MS.IXth World Bamboo Congress.2012, 539-547

[20]Shinjiro O.Callus and cell suspension culture of bamboo plant,Phyllostachys nigra.Plant Biotechnology, 2005, 22(2)：119-125

[21]Kaur D, Ogra R K, Bhattacharya A, Sood A.Changes in sugar levels during slow growth ofDendrocalamus hamiltoniisomatic embryos due to liquid paraffin overlay.In Vitro Cellular & Developmental Biology -Plant, 2012, 48(1)：120-126

[22]Liu C C, Huang L C, Chang C T, Sung H Y.Purification and characterization of soluble invertases from suspension-cultured bamboo (Bambusa edulis)cells.Food Chemistry, 2006, 96(4)：621-631

[23]Mishra Y, Patel P K, Yadav S, Shirin F, Ansari S A.A micropropagation system for cloning ofBambusa tuldaRoxb.Scientia Horticulturae, 2008, 115(3)∶315-318

[24]Gillis K, Gielis J, Peeters H, Dhooghe E, Oprins J.Somatic embryogenesis from matureBambusa balcooaRoxburgh as basis for mass production of elite forestry bamboos.Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 2007, 91(2)：115-123

[25]Mehta R, Sharma V, Sood A, Sharma M, Sharma R K.Induction of somatic embryogenesis and analysis of genetic fidelity of in vitro-derived plantlets ofBambusa nutansWall., using AFLP markers.European Journal of Forest Reseach, 2011, 30(5)∶729-736

[26]Lin C S, Liang C J, Hsaio H W, Lin M J, Chang W C.In vitro flowering of green and albinoDendrocalamus latif l orus.New Forests, 2007, 34(2)：177-186