馬瑞敏 張國軍 康熙雄

(首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京天壇醫(yī)院檢驗(yàn)科，北京 100050)

自身免疫性疾病是由于正常免疫耐受被打破，導(dǎo)致識(shí)別自身抗原的淋巴細(xì)胞增生活化而引起組織結(jié)構(gòu)和功能損害的一類疾病，其確切病因尚不清楚。Toll樣受體(Toll like receptors，TLRs)是近年來備受關(guān)注的一種模式識(shí)別受體，通過選擇性地識(shí)別病原體中病原相關(guān)分子模式(pathogen-associated molecular pattern，PAMP)的保守結(jié)構(gòu)，實(shí)現(xiàn)對(duì)入侵病原體的早期識(shí)別，激活天然免疫。TLRs信號(hào)還通過上調(diào)抗原提呈細(xì)胞(antigen presenting cell，APC)表面的共刺激分子及其分泌的炎性細(xì)胞因子，誘導(dǎo)T、B淋巴細(xì)胞向效應(yīng)細(xì)胞分化，進(jìn)而調(diào)節(jié)獲得性免疫［1-2］。TLRs信號(hào)是機(jī)體抵抗外界感染的第一道防線，但信號(hào)的過度活化也可引起級(jí)聯(lián)反應(yīng)，打破機(jī)體對(duì)自身抗原的免疫耐受，促進(jìn)自身免疫性疾病的發(fā)生發(fā)展。而隨著對(duì)TLRs研究的深入，也將對(duì)自身免疫性疾病的治療提供理論基礎(chǔ)及新的藥物靶點(diǎn)。

1 TLRs的種類及配體

TLRs是一類跨膜受體，現(xiàn)已在人和小鼠體內(nèi)共發(fā)現(xiàn)13種TLRs［3］，主要分布于免疫細(xì)胞及同外界相通的腔道上皮細(xì)胞表面，在巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞等專職抗原提呈細(xì)胞表面的表達(dá)尤其豐富。TLRs通過識(shí)別相應(yīng)的配體來激活免疫反應(yīng)。在TLRs家族中，TLR1、2、6、10 主要識(shí)別細(xì)菌脂蛋白;TLR3、4、5 分別識(shí)別雙鏈RNA、脂多糖、鞭毛蛋白;TLR7、8、9主要識(shí)別核酸分子;TLR11、12、13識(shí)別肌動(dòng)蛋白樣分子。

除外源性配體外，TLRs還可識(shí)別某些內(nèi)源性分子。熱休克蛋白60(heat shock protein 60，HSP60)是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的內(nèi)源性配體［4］。Lehnardt S 等［5］發(fā)現(xiàn)，從中樞神經(jīng)系統(tǒng)壞死或凋亡的細(xì)胞中釋放出來的HSP60可通過TLR4信號(hào)途徑誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞合成神經(jīng)毒性氮氧化合物，在野生型小鼠中，HSP60可促進(jìn)軸突脫失和神經(jīng)元凋亡，但在TLR4或其信號(hào)通路中下游蛋白髓樣分化因子88(myeloid differentiation factor 88，MyD88)突變的小鼠中則無此作用。此后發(fā)現(xiàn)的內(nèi)源性配體包括一些細(xì)胞內(nèi)分子(如 HSP70、HSP90、高遷移率族蛋白1、尿酸等)、核酸(如polyI:C、dsRNA、鳥苷類似物、DNA/抗體復(fù)合物等)、細(xì)胞外基質(zhì)成分(如透明質(zhì)酸、硫酸肝素、纖黏連蛋白)等［6］。這些危險(xiǎn)信號(hào)多來自損傷變性、壞死或凋亡的細(xì)胞，它們的發(fā)現(xiàn)提示TLRs有可能參與自身免疫耐受和免疫監(jiān)視，對(duì)自身免疫病的發(fā)生起關(guān)鍵作用。

2 TLRs信號(hào)通路和功能調(diào)節(jié)

除了TLR3和部分TLR4的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路不依賴MyD88，多數(shù) TLRs信號(hào)中都有 MyD88的參與。MyD88首先通過Toll/IL-1受體同源區(qū)(Toll/IL-1 receptor homologous region，TIR)與 TLRs相結(jié)合，接著募集下游信號(hào)分子白介素1受體相關(guān)蛋白激酶(IL-1R associated kinase，IRAK)4，IRAK-4 磷酸化激活 IRAK-1，隨后活化腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6(TNFR-associated factor 6，TRAF6)?；罨腡RAF6具有泛素連接酶的活性，能夠結(jié)合泛素結(jié)合酶，這種泛素化降解可以活化 TGF-β 激酶(TGF-β activated kinase 1，TAK1)和 TAK1結(jié)合蛋白(TAK1 binding protein，TAB)?；罨腡AK1會(huì)催化人核因子κB抑制物激酶β(human inhibitor of nuclear factor kappa-B kinase β，IKK-β)磷酸化，最終激活核因子(nuclear factor kappa-B，NF-κB)，促進(jìn)炎性因子的表達(dá)。而含Toll/IL-1受體接頭蛋白分子(Toll/IL-1 receptor-containing adaptor molecule，TRIF)和TRIF相關(guān)接頭分子(TRIF-related adaptor molecule，TRAM)則介導(dǎo)了MyD88非依賴途徑，TRIF對(duì)TLR3和TLR4的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)都相當(dāng)重要，可以活化干擾素調(diào)節(jié)因子3(interferon regulatory factor 3，IRF-3)，隨后合成干擾素 β(interferon β，IFN-β)，然后引起一些IFN誘導(dǎo)基因的表達(dá)，而TRAM僅在TLR4的途徑中發(fā)揮作用［7］。

TLRs的激活一方面可通過刺激先天性免疫應(yīng)答和提高獲得性免疫反應(yīng)來保護(hù)機(jī)體，但它引起的持續(xù)性炎性反應(yīng)也會(huì)對(duì)機(jī)體產(chǎn)生損傷，自身免疫、慢性炎癥及一些感染性疾病都與它有一定關(guān)系［8］。因此TLRs的激活必須受到嚴(yán)格的負(fù)調(diào)控，以保持免疫系統(tǒng)的穩(wěn)定?？扇苄缘腡LRs是一類胞外負(fù)調(diào)控因子，可封閉膜表面TLRs與配體的結(jié)合，抑制TLRs信號(hào)通路?？缒へ?fù)調(diào)控分子根據(jù)作用原理可分為促使連接復(fù)合體的解離，如腫瘤發(fā)生抑制物2可促使MyD88與MyD88-接頭蛋白相似物(MyD88-adaptor like，Mal)解離;干擾功能復(fù)合體的形成，如單免疫球蛋白IL-1相關(guān)受體(single immunoglobulin IL-1 related receptor，SIGIRR)可分別與IRAK和TRAF形成復(fù)合體，從而干擾后兩者形成復(fù)合物等。而胞內(nèi)也存在眾多負(fù)調(diào)控因子，主要以泛素化降解、去泛素化、競(jìng)爭性抑制等方式行使負(fù)調(diào)控功能［9］。

3 TLRs與自身免疫性疾病

3.1 TLRs與系統(tǒng)性紅斑狼瘡

系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus，SLE)是一種病程反復(fù)、累及多種器官的自身免疫性疾病，其免疫學(xué)特征主要是產(chǎn)生高滴度的自身抗體，伴隨抑制性T淋巴細(xì)胞減少及自身反應(yīng)性B淋巴細(xì)胞增多，但機(jī)制尚未完全清楚。在SLE發(fā)病機(jī)制中，TLR7和TLR9起重要作用。實(shí)驗(yàn)［10］證明，SLE患者外周血單個(gè)核細(xì)胞TLR7 mRNA、TLR9 mRNA量高于正常對(duì)照組。Papadimitraki E D等［11］發(fā)現(xiàn)活動(dòng)期狼瘡患者外周血中表達(dá)TLR9的記憶B細(xì)胞和漿細(xì)胞比例明顯高于穩(wěn)定期患者，且此種B細(xì)胞的量與血清中抗dsDNA的量呈正相關(guān)，可能是凋亡細(xì)胞釋放的內(nèi)源性核酸分子通過TLR9刺激B細(xì)胞的免疫反應(yīng)參與了SLE的發(fā)病。進(jìn)一步的體外研究［12］顯示，IgG2a在易患自身免疫性疾病的鼠AM14B細(xì)胞中表達(dá)，而DNA、含有DNA的蛋白質(zhì)或RNA及含有RNA的蛋白質(zhì)均可與IgG2a結(jié)合，進(jìn)一步同B細(xì)胞受體(B cell receptor，BCR)結(jié)合，導(dǎo)致AM14B細(xì)胞增生。該研究證實(shí)足夠數(shù)量的自身抗原與BCR結(jié)合后，通過TLR7、TLR9激活原本處于靜止?fàn)顟B(tài)的自身免疫性B細(xì)胞，產(chǎn)生自身抗體。這些自身抗體可直接攻擊組織器官發(fā)生壞死脫落，壞死的組織細(xì)胞成分又可繼續(xù)作為TLRs的配體，激活更多的B細(xì)胞，從而形成正反饋循環(huán)。而在動(dòng)物模型中，缺乏TLRs銜接蛋白MyD88的鼠則不能產(chǎn)生高滴度的自身抗體。

SLE 患者血清中干擾素 α(interferon α，IFN-α)濃度升高，而一些本身不伴有自身免疫性疾病的患者經(jīng)IFN-α治療后會(huì)出現(xiàn)抗核抗體、抗dsDNA抗體，甚至SLE綜合征。人漿細(xì)胞樣樹突細(xì)胞(plasmacytoid den-dritic cell，pDC)被認(rèn)為是產(chǎn)生 IFN-α 的主要細(xì)胞［13］。TLRs介導(dǎo)的pDC激活后，可分泌大量的IFN-α，IFN-α通過一系列反應(yīng)，刺激自身反應(yīng)性B細(xì)胞產(chǎn)生自身抗體，同時(shí)活化細(xì)胞毒性T細(xì)胞產(chǎn)生自身抗原。自身抗原、抗體構(gòu)成免疫復(fù)合物，被TLRs識(shí)別，又可誘導(dǎo)新的IFN-α 產(chǎn)生［14-15］。TLRs 還可誘導(dǎo)合成 IL-1、IL-6、IL-10、IL-12及TNF-α等，參與調(diào)節(jié)特異的免疫反應(yīng)。

3.2 TLRs與自身免疫性肝病

自身免疫性肝病系機(jī)體自身免疫反應(yīng)過度造成肝組織損傷的疾病，主要包括自身免疫性肝炎(autoimmune hepatitis，AIH)、原發(fā)性膽汁性肝硬化(primary biliary cirrhosis，PBC)、原發(fā)性硬化性膽管炎(primary sclerosing cholangitis，PSC)和變異綜合征(proteus syndrome，PS)等，其發(fā)病可能與遺傳易感性和分子模擬機(jī)制有關(guān)。近年來，TLRs在疾病中的作用受到關(guān)注。有研究［16］顯示，AIH、PBC患者膽管上皮細(xì)胞表達(dá)TLR3高于正常人，而Zhao J等［17］發(fā)現(xiàn)在PBC患者肝組織中脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)表達(dá)水平增高，對(duì)于敏感個(gè)體，LPS可能是PBC發(fā)病的一種誘導(dǎo)因素。在LPS的刺激下，PBC患者單個(gè)核細(xì)胞和膽管上皮細(xì)胞TLR4、NF-kB表達(dá)及產(chǎn)生的細(xì)胞因子明顯增多，提示TLRs信號(hào)通路可能在PBC發(fā)病中起作用。

由于天然生成的CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cells，Tregs)在維持外周免疫耐受中起重要作用，因此CD4+CD25+Tregs在自身免疫性肝病發(fā)病機(jī)制中的作用越來越受到重視。有研究［18］顯示，給野生型小鼠注射TLR2配體可導(dǎo)致Tregs數(shù)量顯著增加;Tregs暴露于TLR4配體LPS可誘導(dǎo)幾種活化標(biāo)志物(CD69、B7.1、CD44、CD38 等)的上調(diào)，并增強(qiáng) Tregs的存活和增生能力;而用LPS治療可使Tregs的免疫抑制能力增加10倍，LPS活化的Tregs可以有效控制初始CD4+T細(xì)胞活化及由此產(chǎn)生的疾病。這提示在自身免疫性肝病發(fā)病過程中，TLRs信號(hào)系統(tǒng)被激活，進(jìn)而影響Tregs功能，參與疾病的發(fā)生。

3.3 TLRs與脫髓鞘性疾病

常見的自身免疫性脫髓鞘疾病包括累及中樞神經(jīng)系統(tǒng)的多發(fā)性硬化(multiple sclerosis，MS)和累及周圍神經(jīng)系統(tǒng)的吉蘭-巴雷綜合征(Guillain-Barré syndrome，GBS)。實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦炎(experimental autoimmune encephalitis，EAE)和實(shí)驗(yàn)性自身免疫性神經(jīng)炎(experimental autoimmune neuritis，EAN)分別是其穩(wěn)定的動(dòng)物模型。這類疾病有共同的組織病理學(xué)特征，即血管周圍的單核細(xì)胞浸潤、脫髓鞘和水腫。研究［19］顯示TLR9參與EAE的發(fā)病:在細(xì)菌、病毒感染或組織損傷的情況下，TLR9與配體結(jié)合激活A(yù)PC，激活自身反應(yīng)性T細(xì)胞，使其分化為效應(yīng)細(xì)胞而導(dǎo)致EAE，隨著病程的進(jìn)展可以觀察到，TLR9和MyD88缺陷動(dòng)物則不發(fā)生EAE，提示TLR9和MyD88參與了EAE的發(fā)病。Zhang Z Y等［20］報(bào)道了在EAN鼠巨噬細(xì)胞中TLR2、CD14和HSP70都呈高表達(dá)，并與疾病嚴(yán)重程度相關(guān)聯(lián)，而以其為基礎(chǔ)的負(fù)向調(diào)控可能是控制疾病發(fā)展的免疫途徑。Deng Y N等［21］則報(bào)道了EAN鼠坐骨神經(jīng)中TLR9的高表達(dá)狀態(tài)。也有研究［22］顯示tlr4基因多態(tài)性與GBS發(fā)病易感性的關(guān)系，認(rèn)為Thr399Lle是GBS中AMAN亞型的易患基因型。而對(duì)于MS和GBS患者，TLRs在發(fā)病中所起作用的相關(guān)研究則較少。

4 TLRs與自身免疫性疾病的治療

TLRs在多種疾病的發(fā)生和發(fā)展中有著重要的作用，因此以TLRs及其信號(hào)通路為靶點(diǎn)的干預(yù)治療也引起了研究者極大的興趣。Barrat F J和同事［23］研究了一種人工合成的寡核苷酸，稱為免疫調(diào)節(jié)序列(immunoregulatory sequence，IRS)。IRS 869是 TLR9活化的抑制劑，能與其特異結(jié)合而阻斷TLR9及下游信號(hào)的激活。他們的研究顯示，給小鼠注射免疫刺激序列(immunostimulatory sequence，ISS)和 D-半乳糖胺可以引起嚴(yán)重的炎性反應(yīng)甚至在幾天內(nèi)死亡，但注射IRS 869后可明顯減輕炎癥并延長生存期，對(duì)TLR7的研究也得到了相似的結(jié)果。之后Barrat F J等［24］更進(jìn)一步研究了可以同時(shí)抑制TLR7和TLR9的寡脫氧核苷酸序列(oligo-deoxynucleotide，ODN)，這些序列可減輕炎癥，并抑制漿細(xì)胞樣樹突細(xì)胞產(chǎn)生IFN-α。給狼瘡鼠注射ODN，發(fā)現(xiàn)抗核抗體產(chǎn)生減少，狼瘡性腎炎減輕，生存期明顯延長。

在TLRs信號(hào)通路下游可作為治療靶點(diǎn)的蛋白包括MyD88、TRAF6、IRAK1和IRAK4等。兩個(gè)研究小組分別發(fā)現(xiàn)抑制MyD88可以影響通路中激酶的磷酸化和NF-kB的激活，同時(shí)影響IRAK1和IRAK4的募集反應(yīng)，這說明MyD88作為TLRs通路的中樞性介質(zhì)，其抑制劑可有效拮抗異常的TLRs信號(hào)，降低炎性反應(yīng)及 IFN-α 的產(chǎn)生［25-27］。Song K W 等［28］報(bào)道了 IRAK1和IRAK4的雙重抑制劑RO0884可有效抑制IL-1β和TNF-α的產(chǎn)生，而通過RNA干擾技術(shù)發(fā)現(xiàn)，IRAK1與TNF-α的產(chǎn)生相關(guān)，IRAK4和IL-1β的產(chǎn)生相關(guān)。這提示IRAK1/IRAK4抑制劑可阻斷異常信號(hào)通路，減少炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生，在自身免疫疾病的治療中有重要的潛在價(jià)值。

5 展望

隨著對(duì)TLRs信號(hào)通路認(rèn)識(shí)的逐步深入，基于TLRs為靶點(diǎn)的治療探討也成為研究的熱點(diǎn)。根據(jù)疾病的發(fā)病機(jī)制和發(fā)展階段選擇合適的TLRs激動(dòng)劑或阻滯劑進(jìn)行治療是有效的，但也仍有一些問題需要解決:由于機(jī)體免疫反應(yīng)的復(fù)雜性和TLRs影響的廣泛性，基于TLRs的藥物可能帶來嚴(yán)重的不良反應(yīng)，因此如何控制藥物的治療作用和不良反應(yīng)之間的平衡是此類藥物面臨的關(guān)鍵問題;很多研究結(jié)果來源于動(dòng)物模型，而TLRs在人類疾病中的作用還有待更進(jìn)一步的研究。

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