夏亞穆,杜康健,夏 軍(青島科技大學(xué)化工學(xué)院,山東青島266042)

由乳酸菌制備維生素B類化合物的研究進(jìn)展

夏亞穆,杜康健,夏 軍
(青島科技大學(xué)化工學(xué)院,山東青島266042)

維生素B類化合物是人體必需物質(zhì),主要通過(guò)外源性的食物或藥物來(lái)補(bǔ)充。選育得到的乳酸菌能產(chǎn)生天然的人體易于吸收的不同類型維生素B。介紹了近年來(lái)通過(guò)乳酸菌生物合成維生素B類化合物的研究進(jìn)展,為進(jìn)一步研究產(chǎn)維生素B類化合物乳酸菌菌種選育和代謝工程改造提供參考。

乳酸菌;維生素B類化合物;代謝工程

1 前言

維生素B類化合物是人體正常代謝的必需物質(zhì),大部分不能由人體自身產(chǎn)生,很多人由于膳食營(yíng)養(yǎng)不平衡、吸收效率低而導(dǎo)致維生素B缺乏進(jìn)而引起疾病,須通過(guò)外源性的維生素B營(yíng)養(yǎng)食品或者藥物來(lái)補(bǔ)充。目前,維生素B類化合物的工業(yè)化生產(chǎn)方法主要有微生物發(fā)酵法和化學(xué)合成法[1,2],其中化學(xué)合成法路線設(shè)計(jì)復(fù)雜、副產(chǎn)品多、難以提純,而微生物發(fā)酵法成本低廉、生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)單、環(huán)境友好,尤其是利用乳酸菌合成維生素B類化合物的方法具有廣闊的發(fā)展空間和應(yīng)用前景,已成為研究的熱點(diǎn)。

乳酸菌是發(fā)酵糖類主要產(chǎn)物為乳酸的一類無(wú)芽孢、革蘭氏染色陽(yáng)性細(xì)菌的總稱,其成分相當(dāng)龐雜,目前至少可分為18個(gè)屬,共有200多種[3]。許多乳酸菌發(fā)酵能產(chǎn)生維生素B類化合物,而且不同的菌種能夠選擇性產(chǎn)生不同種類的維生素B。作者在此介紹了近年來(lái)由乳酸菌制備維生素B2、B9、B12及其它B族維生素的研究進(jìn)展。

2 由乳酸菌制備維生素B類化合物

2.1 由乳酸菌制備維生素B2

維生素B2又稱核黃素,在細(xì)胞代謝中發(fā)揮著重要的作用。核黃素缺乏會(huì)導(dǎo)致口腔、唇等部位的炎癥和機(jī)能障礙。核黃素存在于奶制品和動(dòng)物肝臟等食物中,通常以黃素單核苷酸(FMN)和黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)輔酶形式和蛋白質(zhì)結(jié)合存在,人體對(duì)其生物利用度遠(yuǎn)低于游離態(tài)核黃素[4],而乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)生的核黃素大部分是游離態(tài),因此,通過(guò)選育產(chǎn)核黃素乳酸菌菌株并將其用于發(fā)酵食物,可有效解決人體每天攝入核黃素不足的問(wèn)題。

Capozzi等[5]利用自發(fā)抗玫瑰黃色素突變體選擇法從小麥面粉中篩選到了乳酸菌,分離出2種能夠產(chǎn)生大量維生素B2的植物乳酸桿菌菌株。將篩選得到的菌株用于面包制作,高效液相色譜分析結(jié)果表明面包中核黃素的含量增加了3倍。

Jayashree等[6]從印度韋洛爾地區(qū)的幾種奶制品中篩選出48株菌株,其中乳酸桿菌MTCC8711發(fā)酵后能產(chǎn)生大量核黃素,在培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h可生成2.29 mg·L-1的核黃素。該菌株通過(guò)改造,有望成為發(fā)酵食品產(chǎn)業(yè)中一種很好的發(fā)酵劑來(lái)提高食品中核黃素的產(chǎn)量。

利用代謝工程技術(shù)是獲得產(chǎn)核黃素乳酸菌菌株的另一條途徑。Burgess等[7]以雷特氏乳酸球菌亞種NZ9000為對(duì)象,對(duì)其中的rib操縱子進(jìn)行基因互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)和缺失分析實(shí)驗(yàn)以考察其各個(gè)部分在生物合成過(guò)程中的作用,然后通過(guò)基因特異性實(shí)驗(yàn)來(lái)檢測(cè)rib操縱子中哪些基因過(guò)表達(dá)后可以提高核黃素產(chǎn)量。結(jié)果表明,當(dāng)乳酸菌的ribG、rib H、ribB、ribA 4種基因全表達(dá)時(shí),其發(fā)酵產(chǎn)物中核黃素的含量很高,達(dá)到24 mg· L-1。

基因工程技術(shù)的一個(gè)重要優(yōu)勢(shì)是能夠獲得穩(wěn)定遺傳并擁有多種功能的菌株。Sybesma等[8]以雷特氏乳酸球菌亞種NZ9000為對(duì)象,經(jīng)過(guò)基因突變選育使其由核黃素消耗菌株轉(zhuǎn)變?yōu)楹它S素生產(chǎn)菌株,基因分析發(fā)現(xiàn)這是因控制核黃素合成基因的上游調(diào)控區(qū)中有一對(duì)堿基發(fā)生變化導(dǎo)致的;同時(shí),增加乳酸菌中GTP環(huán)水解酶Ⅰ(葉酸生物合成途徑中的關(guān)鍵酶之一)的量,發(fā)酵產(chǎn)物中葉酸含量提高。

2.2 由乳酸菌制備維生素B9

維生素B9又稱葉酸,是機(jī)體細(xì)胞生長(zhǎng)和繁殖所必需的物質(zhì)。人類缺乏葉酸可引起巨紅細(xì)胞性貧血以及白細(xì)胞減少等多種疾病,孕婦對(duì)葉酸的需求量比正常人高4倍,當(dāng)葉酸缺乏時(shí),可導(dǎo)致胎兒體重低、唇腭裂、心臟缺陷等?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn),通過(guò)選育產(chǎn)葉酸乳酸菌菌株,并將其用于發(fā)酵食品,可滿足人體對(duì)葉酸的需求。

LeBlanc等[9]研究發(fā)現(xiàn),乳酸乳球菌和嗜熱鏈球菌能夠大量產(chǎn)生葉酸,嗜酸性乳酸桿菌和植物乳酸桿菌等也能產(chǎn)生葉酸;Santos等[10]研究發(fā)現(xiàn),經(jīng)過(guò)代謝工程改造的羅伊氏乳酸桿菌JCM1112能產(chǎn)生大量葉酸。劉友群等[11]對(duì)嗜酸性乳酸桿菌及乳酸乳球菌發(fā)酵合成葉酸的影響因素進(jìn)行了研究。結(jié)果表明,乳酸菌代謝合成葉酸的產(chǎn)率為17～100μg·L-1,菌種、培養(yǎng)時(shí)間、p H值、對(duì)氨基苯甲酸(PABA)質(zhì)量濃度均會(huì)影響乳酸菌合成葉酸的產(chǎn)量。與乳酸乳球菌亞種相比,嗜酸性乳酸桿菌CH-2的葉酸產(chǎn)量更高;在培養(yǎng)基中加入PABA可加快葉酸的合成,提高發(fā)酵液中葉酸的含量。

研究表明,在蔬菜發(fā)酵過(guò)程中通過(guò)選擇合適的乳酸菌作發(fā)酵劑也能夠得到大量的5-甲基四氫葉酸[12]。在10種不同的乳酸菌培養(yǎng)基中,其中一種培養(yǎng)基能得到原來(lái)2倍量的葉酸,這些葉酸是天然的,生物利用度高。

Pompei等[13]選取76株乳酸菌類的雙歧桿菌,在無(wú)葉酸的半合成的培養(yǎng)基SM7中分別培養(yǎng),結(jié)果發(fā)現(xiàn)其中17株菌株不需葉酸就能生長(zhǎng),有6株可以產(chǎn)生較多的葉酸(41～82 ng·m L-1)。

在乳酸乳球菌[14]、植物乳酸桿菌[15]和德氏乳酸桿菌保加利亞變種[16]中控制葉酸生物合成的基因已經(jīng)被鑒定。但并非每種乳酸桿菌屬都能夠產(chǎn)生葉酸,如加氏乳酸桿菌[17]、唾液乳酸桿菌[18]、約氏乳酸桿菌[16]等。

Hugenholtz等[19]研究發(fā)現(xiàn),乳酸菌釋放到體外的葉酸的量和其體內(nèi)單谷酰葉酸與多谷酰葉酸的比例有關(guān)。通過(guò)從人體或老鼠體內(nèi)獲得能表達(dá)γ-谷?；饷傅幕蚱?在Nisin調(diào)控表達(dá)系統(tǒng)(NICE System)中進(jìn)行互補(bǔ)DNA克隆,然后引入到乳酸乳球菌中表達(dá),使多谷酰葉酸水解成單谷酰葉酸,從而使乳酸菌釋放更多葉酸。

利用代謝工程技術(shù)可以提高乳酸乳桿菌[14,20]、格氏乳酸桿菌[17]和羅伊氏乳酸桿菌[10]的葉酸產(chǎn)量。通過(guò)控制乳酸桿菌中fol KE基因的超表達(dá)來(lái)編碼6-羥甲基-二氫嘌呤焦磷酸激酶(fol K)和GTP環(huán)水解酶(folE)可使細(xì)胞外葉酸產(chǎn)量提高10倍,總?cè)~酸產(chǎn)量提高3倍;與此同時(shí),fol A基因超表達(dá)的二氫葉酸還原酶可使葉酸總產(chǎn)量下降50%。除此之外,已經(jīng)檢測(cè)到fol KE和fol C超表達(dá)的結(jié)合有利于胞內(nèi)葉酸的積累[21]。另外,GTP環(huán)水解酶的超表達(dá)可能具有提高葉酸產(chǎn)量的潛力。總之,fol KE超表達(dá)與其它葉酸生物合成基因表達(dá)的適當(dāng)結(jié)合能夠顯著提高葉酸的產(chǎn)量,并且這些基因修飾的乳酸菌和天然菌株一樣安全[22]。

Wegkamp等[17]將消耗葉酸的格氏乳酸桿菌ATCC33323改造成了高效的葉酸生產(chǎn)菌株。在該菌株中,除了fol A和fol C基因外不存在其它葉酸生物合成基因,而fol A和fol C基因參與了從外界中攝取葉酸的再生和保留。將乳酸乳球菌MG1363中含有完整葉酸基因簇(fol A、fol B、fol KE、fol P、ylgG和fol C)的質(zhì)粒引進(jìn)到格氏乳酸桿菌ATCC33323中,經(jīng)過(guò)重組的菌株即轉(zhuǎn)變成葉酸生產(chǎn)菌株。

乳酸菌發(fā)酵得到的天然葉酸與化學(xué)合成的葉酸相比,不會(huì)掩蓋由維生素B12缺乏而導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)受損所引起的病癥[23]。這就使得選育高產(chǎn)葉酸的乳酸菌菌株、提高發(fā)酵食物中葉酸含量的研究更有意義。

2.3 由乳酸菌制備維生素B12

維生素B12是所有呈現(xiàn)氰鈷胺素生物活性的類咕啉的總稱。人體如缺乏維生素B12會(huì)引起造血系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)疾病。目前,維生素B12主要是由費(fèi)氏丙酸桿菌、脫氮假單胞菌等微生物合成得到,但生產(chǎn)成本高、價(jià)格昂貴,因此進(jìn)一步研究、選育優(yōu)良的產(chǎn)維生素B12菌株,對(duì)降低維生素B12生產(chǎn)成本十分重要。

一些乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)物中含有維生素B12。Taranto等[24]研究表明,乳酸菌中羅伊氏乳酸桿菌CRL1098在無(wú)維生素B12培養(yǎng)基中可以利用甘油合成1,3-丙二醇,而此代謝過(guò)程中必定會(huì)有維生素B12作為輔酶參與反應(yīng),這就證明乳酸菌類微生物可以生成維生素B12。對(duì)羅伊氏乳酸桿菌CRL1098胞內(nèi)提取物的色譜分析證實(shí),該菌株可產(chǎn)生類似維生素B12的復(fù)合物,該復(fù)合物的吸收光譜除洗脫時(shí)間不同外,其它特征均與維生素B12極其相似。Santos等[10,25]發(fā)現(xiàn)羅伊氏乳酸桿菌DCM20016、JCM1112、CRL1324和CRL1327也能夠產(chǎn)生一些類咕啉物質(zhì)。Molina等[26]研究表明:羅伊氏乳酸桿菌CRL1098產(chǎn)生的維生素B12類似物具有生物活性,可以有效避免由于缺乏維生素B12而引起的病癥。上述研究表明羅伊氏乳酸桿菌可能含有合成維生素B12的基因。Santos等[27]通過(guò)表達(dá)和鈍化編碼PocR蛋白的基因而證實(shí)此蛋白就是控制維生素B12合成的關(guān)鍵。

Madhu等[28]利用從印度食物Kanjikad中提取的植物乳酸桿菌細(xì)胞內(nèi)合成維生素B12,經(jīng)96 h的深層發(fā)酵得到維生素B1213 ng·(g培養(yǎng)基干重)-1;用氰化鈉細(xì)胞裂解液溶解細(xì)胞,再用芐醇-氯仿-水體系進(jìn)行萃取,即可提取出細(xì)胞內(nèi)的維生素B12。

利用基因突變和基因工程技術(shù)[29,30]可有效提高費(fèi)氏丙酸桿菌的維生素B12產(chǎn)量,但針對(duì)乳酸桿菌的類似研究還未開(kāi)展過(guò)。了解產(chǎn)維生素B12的乳酸菌的復(fù)合基因序列將有助于設(shè)計(jì)相應(yīng)的策略用于選育高產(chǎn)維生素B12的優(yōu)化菌株[31,32]。

2.4 由乳酸菌制備其它B族維生素

乳酸菌除了能制備維生素B2、B9和B12外,還能制備其它B族維生素,但相關(guān)研究的報(bào)道較少[33,34]。

乳酸菌中雙歧桿菌使得豆奶中維生素B1的含量提高了11%[35]。利用嗜熱鏈球菌ST5和瑞士乳酸桿菌R0052或長(zhǎng)雙歧桿菌R0175發(fā)酵大豆,維生素B1和B6的含量均得以提高[36]。這是首次利用純的瑞士乳酸桿菌和嗜熱鏈球菌培養(yǎng)基來(lái)研究發(fā)酵飲料中維生素B1和B6的含量。

3 結(jié)語(yǔ)

通過(guò)對(duì)乳酸菌類微生物菌種和培養(yǎng)條件的共同選擇可提高發(fā)酵食品中不同維生素B類化合物的含量、改善食品的品質(zhì),獲得良好的經(jīng)濟(jì)效益。隨著乳酸菌基因測(cè)序和新型工程技術(shù)的發(fā)展,利用價(jià)廉易得的乳酸菌菌株制備富含維生素B類化合物產(chǎn)品的潛力很大。

[1] 王普善.維生素行業(yè)現(xiàn)狀與發(fā)展建議(一)[J].精細(xì)與專用化學(xué)品,2007,15(5):1-4.

[2] 王普善.維生素行業(yè)現(xiàn)狀與發(fā)展建議(二)[J].精細(xì)與專用化學(xué)品,2007,15(6):11-15.

[3] 姚嵐.淺談乳酸菌與人體健康[J].畜牧獸醫(yī)科技信息,2011, (11):14-15.

[4] Singh R,Deodhar A D.Relative bioavailability of riboflavin in cow′s milk and fermented milk using rat bioassay[J].International Dairy Journal,1994,4(1):59-71.

[5] Capozzi V,Menga V,Digesu A M,et al.Biotechnological production of vitamin B2-enriched bread and pasta[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry,2011,59(14):8013-8020.

[6] Jayashree S,Jayaraman K,Kalaichelvan G.Isolation,screening and characterization of riboflavin producing lactic acid bacteria from Katpadi,Vellore district[J].Recent Research in Science Technology,2010,2(1):83-88.

[7] Burgess C,O′Connell-Motherway M,Sybesma W,et al.Riboflavin production in Lactococcus lactis:Potential for in situ production of vitamin-enriched foods[J].Applied and Environmental Microbiology,2004,70(10):5769-5777.

[8] Sybesma W,Burgess C,Starrenburg M,et al.Multivitamin production in Lactococcus lactis using metabolic engineering[J].Metabolic Engineering,2004,6(2):109-115.

[9] LeBlanc J G,Taranto M P,Molina V,et al.B-Group Vitamins Production by Probiotic Lactic Acid Bacteria//Mozzi F,Raya R, Vignolo G.In Biotechnology of Lactic Acid Bacteria:Novel Applications[M].Ames,IA,USA:Wiley-Blackwell,2010:211-232.

[10] Santos F,Wegkamp A,de Vos W M,et al.High-level folate production in fermented foods by the B12 producer Lactobacillus reuteri JCM1112[J].Applied and Environmental Microbiology, 2008,74(10):3291-3294.

[11] 劉友群,周方,趙宏飛,等.乳酸菌發(fā)酵代謝合成葉酸的影響因素[J].中國(guó)乳品工業(yè),2011,39(3):10-13.

[12] J?gerstad M,Jastrebova J,Svensson U.Folates in fermented vegetables——A pilot study[J].LWT-Food Science and Technology,2004,37(6):603-611.

[13] Pompei A,Cordisco L,Amaretti A,et al.Folate production by bifidobacteria as a potential probiotic property[J].Applied and Environmental Microbiology,2007,73(1):179-185.

[14] Sybesma W,Starrenburg M,Kleerebezem M.Increased production of folate by metabolic engineering of Lactococcus lactis[J]. Applied and Environmental Microbiology,2003,69(6):3069-3076.

[15] Kleerebezem M,Boekhorst J,van Kranenburg R,et al.Complete genome sequence of Lactobacillus plantarum WCFS1[J].Proceedings of the National Academy of Sciences,2003,100(4): 1990-1995.

[16] van de Guchte M,Penaud S,Grimaldi C,et al.The complete genome sequence of Lactobacillus bulgaricus reveals extensive and ongoing reductive evolution[J].Proceedings of the NationalAcademy of Sciences,2006,103(24):9274-9279.

[17] Wegkamp A,Starrenburg M,de Vos W M,et al.Transformation of folate-consuming Lactobacillus gasseri into a folate producer[J]. Applied and Environmental Microbiology,2004,70(5):3146-3148.

[18] Claesson M J,Li Y,Leahy S,et al.Multireplicon genome architecture of Lactobacillus salivarius[J].Proceedings of the National Academy of Sciences,2006,103(17):6718-6723.

[19] Hugenholtz J,Sybesma W,Nierop Groot M,et al.Metabolic engineering of lactic acid bacteria for the production of nutraceuticals[J].Antonie van Leeuwenhoek,2002,82(1-4):217-235.

[20] Wegkamp A,van Oorschot W,de Vos W M,et al.Characterization of the role of para-aminobenzoic acid biosynthesis in folate production by Lactococcus lactis[J].Applied and Environmental Microbiology,2007,73(8):2673-2681.

[21] LeBlanc J G,Sybesma W,Starrenburg M,et al.Supplementation with engineered Lactococcus lactis improves the folate status in deficient rats[J].Nutrition,2010,26(7-8):835-841.

[22] LeBlanc J G,van Sinderen D,Hugenholtz J,et al.Risk assessment of genetically modified lactic acid bacteria using the concept of substantial equivalence[J].Current Microbiology,2010,61 (6):590-595.

[23] Lamers Y,Prinz-Langenohl R,Bramswig S,et al.Red blood cell folate concentrations increase more after supplementation with [6S]-5-methyltetrahydrofolate than with folic acid in women of childbearing age[J].The American Journal of Clinical Nutrition, 2006,84(1):156-161.

[24] Taranto M P,Vera J L,Hugenholtz J,et al.Lactobacillusreuteri CRL1098 produces cobalamin[J].Journal of Bacteriology,2003, 185(18):5643-5647.

[25] Santos F,Vera J L,van der Heijden R,et al.The complete coenzyme B12 biosynthesis gene cluster of Lactobacillus reuteri CRL1098[J].Microbiology,2008,154(1):81-93.

[26] Molina V C,Medici M,Taranto M P,et al.Lactobacillus reuteri CRL1098 prevents side effects produced by a nutritional vitamin B deficiency[J].Journal of Applied Microbiology,2009,106(2): 467-473.

[27] Santos F,Spinler J K,Saulnier Delphine M A,et al.Functional identification in Lactobacillusreuteri of a PocR-like transcription factor regulating glycerol utilization and vitamin B12 synthesis [J].Microbial Cell Factories,2011,10(1):55-65.

[28] Madhu A N,Giribhattanavar P,Narayan M S,et al.Probiotic lactic acid bacterium from kanjikad as a potential source of vitamin B12:Evidence from LC-MS,immunological and microbiological techniques[J].Biotechnology Letters,2010,32(4):503-506.

[29] Martens J H,Barg H,Warren M J,et al.Microbial production of vitamin B12[J].Applied Microbiology and Biotechnology,2002, 58(3):275-285.

[30] Burgess C M,Smid E J,van Sinderen D.Bacterial vitamin B2,B11 and B12 overproduction:An overview[J].International Journal of Food Microbiology,2009,133(1-2):1-7.

[31] Piao Y,Kiatpapan P,Yamashita M,et al.Effects of expression of hem A and hem B genes on production of porphyrin in Propionibacterium freudenreichii[J].Applied and Environmental Microbiology,2004,70(12):7561-7566.

[32] Piao Y,Yamashita M,Kawaraichi N,et al.Production of vitamin B12in genetically engineered Propionibacterium freudenreichii [J].Journal of Bioscience and Bioengineering,2004,98(3):167-173.

[33] Shahani K M,Chandan R C.Nutritional and healthful aspects of cultured and culture-containing dairy foods[J].Journal of Dairy Science,1979,62(10):1685-1694.

[34] Alm L.Effect of fermentation on B-vitamin content of milk in Sweden[J].Journal of Bioscience and Bioengineering,1982,65 (3):353-359.

[35] Hou J W,Yu R C,Chou C C.Changes in some components of soy milk during fermentation with bifidobacteria[J].Food Research International,2000,33(5):393-397.

[36] Champagne C P,Tompkins T A,Buckley N D,et al.Effect of fermentation by pure and mixed cultures of Streptococcus thermophilus and Lactobacillus helveticus on isoflavone and B-vitamin content of a fermented soy beverage[J].Food Microbiology, 2010,27(7):968-972.

Research Progress of B-Group Vitamins Produced by Lactic Acid Bacteria

XIA Ya-mu,DU Kang-jian,XIA Jun
(College of Chemical Engineering,Qingdao University of Science and Technology,Qingdao 266042,China)

B-Group vitamins are a group of human essential substances that play important roles in cell metabolism.They can be externally obtained from food and medicine.Most lactic acid bacteria(LAB)can produce B-group vitamins which are natural,various and easy to be absorbed in human body.This review shows current research progress of B-group vitamins produced by LAB.It provides some references for the study of screening LAB strains and for the improvement of the metabolic engineering.

lactic acid bacteria;B-group vitamins;metabolic engineering

TQ 924

A

1672-5425(2012)11-0005-04

10.3969/j.issn.1672-5425.2012.11.002

山東省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(ZR2010HM023),高等學(xué)校博士學(xué)科點(diǎn)專項(xiàng)科研基金資助項(xiàng)目(20093719120004)

2012-07-16

夏亞穆(1974-),男,甘肅天水人,副教授,主要從事生物活性物質(zhì)的提取、分離、合成等研究與開(kāi)發(fā)工作,E-mail:xiayamu @qust.edu.cn。