閆長(zhǎng)青，趙玉沛，劉三光，戚 誠(chéng)，張建生，王文斌

(1河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院，石家莊050011;2中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)院)

胰腺癌細(xì)胞是血管生成因子重要來源，胰腺癌細(xì)胞同時(shí)產(chǎn)生多種血管生成因子，血管生成因子表達(dá)水平可能與胰腺癌細(xì)胞增殖與侵襲密切相關(guān)［1，2］，血管生成因子之間特別是VEGF與bFGF的表達(dá)可能存在相互調(diào)節(jié)［3，4］。2011年3～6月，我們分別用VEGFsiRNA及bFGFsiRNA轉(zhuǎn)染胰腺癌細(xì)胞株sw1990、PCT-3及Panc-1，觀察VEGFsiRNA和bFGFsiRNA對(duì)胰腺癌 sw1990、Panc-1及 PCT-3細(xì)胞bFGF表達(dá)水平的影響。現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 人胰腺癌細(xì)胞株sw1990、Panc-1、PCT-3由北京協(xié)和醫(yī)院基本外科實(shí)驗(yàn)室保存。VEGFsiRNA、bFGFsiRNA、control siRNA(Fluorescein Conjugate)及siRNA Transfection Medium購(gòu)自美國(guó)SANTA CRUZ公司(sc-36868);siRNA Transfection Reagent Lipofectamine2000及總RNA提取試劑購(gòu)自美國(guó)Invertrogen公司;bFGF ELISA檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)R＆D公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 siRNA轉(zhuǎn)染胰腺癌細(xì)胞株 先參照文獻(xiàn)［2］方法進(jìn)行預(yù)試驗(yàn)觀察轉(zhuǎn)染效率。將細(xì)胞接種于6孔板，每孔2×105個(gè)細(xì)胞，加入2 mL含10%胎牛血清的無抗生素RPMI1640培養(yǎng)基，37℃、5%CO2培養(yǎng)至細(xì)胞60%～80%融合。將VEGFsiRNA、bFGFsiRNA復(fù)合物和Lipofectamine2000分別溶解與100 μL siRNA Transfection Medium。然后輕輕混合，在室溫下孵育30 min。取轉(zhuǎn)染復(fù)合物0.2 mL加0.8 mL的siRNATransfection Medium，混勻加入洗滌后的sw1990、Panc-1、PCT-3細(xì)胞。37℃、CO2培養(yǎng)箱孵育6 h;10 000 r/min離心。

1.2.2 bFGF mRNA檢測(cè) 采用RT-PCR法檢測(cè)sw1990、Panc-1、PCT-3細(xì)胞中的bFGF mRNA。先參照Trizol試劑盒說明書提取細(xì)胞總RNA。逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA后行PCR擴(kuò)增:引物由上海生工生物技術(shù)有限責(zé)任公司合成。引物序列:bFGF:5'-AGCGGCTGTACTGCAAAAAC-3'，5'-CCCAGGTCCTGTTTTGGAT-3'。β-actin:5'-GGCGGCACCACCATGTACCCT-3'，5'-AGGGGCCGGACTCGTCATACT-3'。將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。紫外燈下照相并分析。相對(duì)表達(dá)量(A)=A目的基因/Aβ-actin。

1.2.3 bFGF蛋白檢測(cè) 采用ELISA法檢測(cè)上清液中的bFGF蛋白。操作按試劑盒說明書進(jìn)行。結(jié)果以450 nm處OD值表示。所有檢測(cè)樣本重復(fù)兩次，以O(shè)D值為縱坐標(biāo)，以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)標(biāo)本樣品的OD值可在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出其濃度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件。組間比較采用采用方差分析和t檢驗(yàn)。P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 bFGF mRNA VEGFsiRNA處理后 PCT-3、Panc-1、sw1990細(xì)胞bFGF mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為0.50±0.05、0.81±0.09、0.46±0.06，bFGFsiRNA處理后分別為0.08±0.01、0.10±0.04、0.15± 0.08，對(duì)照組分別為0.42±0.02、0.62±0.03、0.22 ±0.03。VEGFsiRNA處理后Panc-1、sw1990細(xì)胞bFGF mRNA表達(dá)強(qiáng)于對(duì)照組(P均＜0.05)，VEGF-siRNA處理后PCT-3細(xì)胞bFGFmRNA表達(dá)與對(duì)照組相比P＞0.05。bFGFsiRNA處理后PCT-3、Panc-1細(xì)胞bFGF mRNA表達(dá)弱于對(duì)照組(P均＜0.05)，bFGFsiRNA處理后sw1990細(xì)胞bFGF mRNA表達(dá)與對(duì)照組相比P＞0.05。

2.2 bFGF蛋白 VEGFsiRNA處理后PCT-3、Panc-1、sw1990細(xì)胞培養(yǎng)液上清液 bFGF蛋白濃度為(490.57±125.23)pg/mL、(77.49±10.07)pg/mL、(13.35±1.63)pg/mL，bFGFsiRNA處理后分別為(142.78±13.95)pg/mL、(11.41±8.14)pg/mL、(2.26±0.65)pg/mL，對(duì)照組分別為(316.29± 57.39)pg/mL、(36.44±12.29)pg/mL、(3.87± 0.42)pg/mL。VEGFsiRNA處理后sw1990、Panc-1細(xì)胞培養(yǎng)液上清液中bFGF濃度較對(duì)照組顯著升高(P均＜0.05)，PCT-3細(xì)胞培養(yǎng)液上清液bFGF濃度與對(duì)照組相比P＞0.05。bFGFsiRNA處理后PCT-3、Panc-1、sw1990細(xì)胞培養(yǎng)液上清液中bFGF濃度較對(duì)照組顯著降低(P均＜0.05)。

3 討論

新生血管生成是實(shí)體腫瘤進(jìn)展和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的基礎(chǔ)，血管生成激活及調(diào)節(jié)受控于促/抑血管生成因子的相互作用［5］。不同的血管生成因子在各種腫瘤進(jìn)展中對(duì)新生血管的調(diào)節(jié)作用已經(jīng)得到了廣泛的研究和認(rèn)同，抗血管治療是最重要的抗腫瘤治療策略之一［6］。腫瘤血管形成是多種血管生成因子共同作用的結(jié)果，VEGF及bFGF是最重要的促血管生成因子，與胰腺癌進(jìn)展及預(yù)后關(guān)系密切。血管生成因子之間可能存在相互調(diào)節(jié)作用。本研究結(jié)果顯示，bFGFsiRNA抑制胰腺癌細(xì)胞bFGF mRNA、蛋白表達(dá)，bFGFsiRNA抑制胰腺癌細(xì)胞bFGF mRNA、蛋白表達(dá);VEGFsiRNA上調(diào)胰腺癌細(xì)胞bFGF mRNA、蛋白表達(dá)。前期研究證實(shí)bFGF在胰腺癌細(xì)胞內(nèi)表達(dá)顯著高于細(xì)胞外，VEGF在胰腺癌細(xì)胞外表達(dá)顯著高于胞內(nèi)，由此推斷bFGF可能在胰腺癌細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用，VEGF則可能更多地在胰腺癌細(xì)胞微環(huán)境方面發(fā)揮作用［3］。多數(shù)學(xué)者認(rèn)為bFGF能夠誘導(dǎo)VEGF分泌，上調(diào)VEGF表達(dá)［7，8］。Fontijn等［8］研究證實(shí)bFGF過度表達(dá)上調(diào)黑色素瘤細(xì)胞VEGF分泌從而促進(jìn)腫瘤血管形成和侵襲，這一過程是通過PI-3K及p38 MAPK途徑完成的。因此可以推斷，胰腺癌細(xì)胞在VEGFsiRNA轉(zhuǎn)染后VEGF表達(dá)受到抑制，可能通過反饋調(diào)節(jié)影響到bFGF表達(dá)，胰腺癌細(xì)胞可能在轉(zhuǎn)錄水平通過上調(diào)bFGFmRNA表達(dá)促進(jìn)VEGF表達(dá)及細(xì)胞外bFGF表達(dá)，進(jìn)而完成其腫瘤細(xì)胞侵襲及血管生成等生物學(xué)特性，其調(diào)節(jié)通路尚需進(jìn)一步研究。

胰腺癌細(xì)胞血管生成因子分泌的復(fù)雜的相互調(diào)節(jié)關(guān)系是與其腫瘤生物學(xué)特性相適應(yīng)的，與腫瘤進(jìn)展密切相關(guān)。VEGF及bFGF在胰腺癌發(fā)生、進(jìn)展、轉(zhuǎn)移的過程中發(fā)揮各自腫瘤生物學(xué)作用的同時(shí)存在重要的相互調(diào)節(jié)作用，進(jìn)而推斷參與胰腺癌發(fā)生、進(jìn)展、轉(zhuǎn)移全過程的血管生成因子之間可能存在復(fù)雜的相互影響作用，因此有必要進(jìn)一步深入的探討其相互調(diào)節(jié)機(jī)制，從而為胰腺癌及其他腫瘤的抗血管治療提供完善的治療靶點(diǎn)。在制定抗血管生成治療策略時(shí)，針對(duì)不同靶標(biāo)的聯(lián)合治療可能會(huì)獲得更好的治療效果，而深入研究探討其調(diào)節(jié)機(jī)制可能會(huì)進(jìn)一步提高聯(lián)合治療效果。同時(shí)也應(yīng)注意到本研究中不同的細(xì)胞株血管生成因子表達(dá)之間的相互關(guān)系不盡相同，因此制定聯(lián)合抗血管治療方案同時(shí)還應(yīng)考慮治療個(gè)體化及與其他治療方法協(xié)同的問題。

［1］閆長(zhǎng)青，趙玉沛，戴夢(mèng)華，等.胰腺癌患者外周血促血管生成因子濃度與疾病進(jìn)展的關(guān)系［J］.中華外科雜志，2007，45(7):496-498.

［2］戴夢(mèng)華，閆長(zhǎng)青，趙玉沛，等.胰腺癌患者外周血抑血管生成因子濃度與疾病進(jìn)展的關(guān)系［J］.中華外科雜志，2007，45(17):1199-1201.

［3］閆長(zhǎng)青，趙玉沛.血管生成因子VEGF、bFGF、endostatin在胰腺癌細(xì)胞中的表達(dá)［J］.中華外科雜志，2009，47(10):787-790.

［4］閆長(zhǎng)青，趙玉沛.VEGFsiRNA及bFGFsiRNA對(duì)胰腺癌細(xì)胞增殖和侵襲性的影響［J］.中華外科雜志，2010，48(8):610-614.

［5］Jain RK.Normalization of tumor vasculature:an emerging concept in antiangiogenic therapy［J］.Science，2005，307(5706):58-62.

［6］Eichholz A，Merchant S，Gaya AM.Anti-angiogenesis therapies: their potential in cancer management［J］.Onco Targets Ther，2010，(3):69-82.

［7］Kuhn H，Konrada J，Holtzb S，et al.Enhanced expression of VEGF following bFGF inhibition in non-small cell lung cancer cell lines［J］.Lung Cancer，2006，54(2):149-153.

［8］Fontijn D，Bosch LJ，Duyndam MC，et al.Basic fibroblast growth factor-mediated overexpression of vascular endothelial growth factor in 1F6 human melanoma cells is regulated by activation of PI-3K and p38MAPK［J］.Cell Oncol，2009，31(3):179-190.