血源篩查核酸檢測(cè)應(yīng)用現(xiàn)狀及研發(fā)中應(yīng)關(guān)注的問(wèn)題

北京市藥品審評(píng)中心（100053）馬書(shū)章 田曉娟 佟利家

核酸檢測(cè)（Nucleic acid testing，NAT）技術(shù)作為血液篩查的一種新方法，可顯著縮短檢測(cè)方法的“窗口期”，降低輸血感染病毒的風(fēng)險(xiǎn)，因此，該技術(shù)已成為美國(guó)、日本等發(fā)達(dá)國(guó)家血源篩查的必要手段[1][2][3][4][5]。根據(jù)我國(guó)現(xiàn)行法規(guī)要求，用于血源篩查的體外診斷試劑按照藥品管理。目前，國(guó)內(nèi)許多企業(yè)已經(jīng)開(kāi)發(fā)出成熟的NAT定量檢測(cè)產(chǎn)品，但這些產(chǎn)品均只能獲得國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局（SFDA）的臨床診斷使用許可，而臨床診斷和血液篩檢是兩個(gè)不同的應(yīng)用領(lǐng)域，血液篩查對(duì)試劑的要求比臨床診斷嚴(yán)格很多?，F(xiàn)就NAT血源篩查的研究現(xiàn)狀及企業(yè)研發(fā)過(guò)程中應(yīng)注意的問(wèn)題進(jìn)行探討。

1 NAT用于血篩的研究現(xiàn)狀

目前，廣泛應(yīng)用于臨床血液篩檢的酶免檢測(cè)（enzyme immunoassay，EIA）技術(shù)，隨著單克隆抗體的應(yīng)用及靈敏度更高的發(fā)光平臺(tái)的建立，靈敏度和特異性在不斷地改進(jìn)和提高，但每年仍有少數(shù)新發(fā)輸血后肝炎病例報(bào)道。除了方法學(xué)本身的限制，這些危險(xiǎn)主要來(lái)自：病毒感染者“窗口期”獻(xiàn)血，病毒變異，免疫靜默感染以及人工操作錯(cuò)誤。ELISA（Enzyme-Linked Immunosorbnent Assay）檢測(cè)的“窗口期”較長(zhǎng)，ELISA技術(shù)“窗口期”漏檢是當(dāng)前影響血液安全性進(jìn)一步提高的瓶頸。因此，單純ELISA檢測(cè)已不能有效地保障血液安全。

NAT檢測(cè)是直接檢測(cè)病原體核酸的一系列技術(shù)的總稱(chēng)，其靈敏度高，可檢測(cè)出標(biāo)本中極微量的核酸，在病毒感染后數(shù)天即能檢出，可大大縮短“窗口期”。免疫學(xué)檢測(cè)HBsAg、抗-HIV、抗-HCV的“窗口期”分別為56天、22天、70天[6]。在理論上，NAT技術(shù)能夠顯著的縮短病原體檢出的“窗口期”[7]。有研究表明：NAT可將HBV、HCV和HIV感染的平均“窗口期”縮短25天（縮短“窗口期”50%）、11天（縮短“窗口期”50%）和59天（縮短“窗口期”89%）[8]。此外，NAT技術(shù)的靈敏度和特異性均顯著的高于免疫學(xué)方法。盡管NAT技術(shù)從理論上并不能完全消除感染的“窗口期”，但通常在病毒核酸轉(zhuǎn)陽(yáng)之前的血液傳染性很低，可以有效地預(yù)防經(jīng)輸血傳播病毒性疾病。因此，在現(xiàn)有的科學(xué)技術(shù)條件下，NAT技術(shù)的引入可使輸血傳播病毒感染（Transfusion-transmitted viral infection，TTVI）的危險(xiǎn)性降至最低。

日本是世界上最早在全國(guó)范圍內(nèi)對(duì)血液進(jìn)行HBV、HCV、HIV NAT篩檢的國(guó)家，德國(guó)和荷蘭從1997年起就開(kāi)始NAT篩檢的嘗試，英國(guó)和法國(guó)的部分血站也從2000年起開(kāi)始了NAT血液篩檢，美國(guó)則從1999年3月開(kāi)始在FDA新藥審核程序下使用不同的試劑進(jìn)行常規(guī)血液篩檢。縱觀各國(guó)運(yùn)用NAT進(jìn)行血液篩檢的情況，日本及歐美各國(guó)多采用以羅氏公司COBAS AmpliScreen系統(tǒng)及Chiron公司的TMA技術(shù)為基礎(chǔ)的檢測(cè)方法。各國(guó)根據(jù)自身特色，正在對(duì)各種不同的技術(shù)組合進(jìn)行評(píng)估，目的是尋求一種最適合的NAT技術(shù)，既可以保障血液安全，又能保證血液的及時(shí)供給，還能做到省時(shí)省力。

我國(guó)血液制品技術(shù)管理部門(mén)從2002年開(kāi)始，先后進(jìn)行了原料血漿核酸檢測(cè)的方法學(xué)研究和4萬(wàn)份取自不同地區(qū)樣本的病原體篩查，并根據(jù)國(guó)家食品藥品監(jiān)管機(jī)構(gòu)的要求擬定了相關(guān)的技術(shù)文件[9]。在血液制品原料血漿中開(kāi)展NAT檢測(cè)的相關(guān)法規(guī)已在醞釀和討論之中。我國(guó)衛(wèi)生部于2000年3月開(kāi)始在12個(gè)省市的15個(gè)血液中心進(jìn)行核酸檢測(cè)試點(diǎn)工作，結(jié)果顯示：試點(diǎn)后血液安全性大幅提高，效果非常顯著。因此，衛(wèi)生部、財(cái)政部聯(lián)合下發(fā)文件，給予全國(guó)68個(gè)核酸實(shí)驗(yàn)室投入了1.57億元用于核酸檢測(cè)的培訓(xùn)和相關(guān)器械購(gòu)買(mǎi)，使得血液核酸檢測(cè)在更大范圍開(kāi)展，衛(wèi)生部于2011年8月在哈爾濱召開(kāi)的全國(guó)血液安全工作會(huì)議上，要求有條件采用核酸檢測(cè)技術(shù)的省份盡量采用核酸檢測(cè)方法。

2 NAT血篩試劑研發(fā)中應(yīng)關(guān)注的幾個(gè)問(wèn)題

2.1靈敏度 迄今為止正式通過(guò)美國(guó)FDA認(rèn)證可用于血液篩檢的試劑僅有2種，即Roche COBAS AmpliScreen HBV/HCV/HIV和Chiron Procleix TMA HIV-1/HCV檢測(cè)系統(tǒng)。FDA評(píng)判這些試劑是否能用于血液篩檢的標(biāo)準(zhǔn)之一：必須對(duì)50cp/mL的病毒核酸的檢出率＞95%。相當(dāng)一部分國(guó)產(chǎn)熒光定量PCR檢測(cè)試劑或許能在某些標(biāo)本上獲得20cp/mL的靈敏度，但一般都很難滿足95%檢出低病毒載量標(biāo)本的要求。2002年美國(guó)AABB年會(huì)上甚至有學(xué)者提出血液篩檢試劑的靈敏度應(yīng)該達(dá)到（5～6）cp/mL，才能保證不至于因?yàn)榛旌蠙z測(cè)而造成的漏檢，這無(wú)疑對(duì)血液篩檢NAT試劑提出了更高的要求。

核酸篩查多為混樣方式，由于在“窗口期”血液中HIV和HCV RNA的濃度比較高，這種混合檢測(cè)的方法曾經(jīng)，甚至是目前仍然被認(rèn)為是提高血液安全的可接受的方案。但如果需要進(jìn)行HBV DNA檢測(cè)，為防止低拷貝的HBV病毒陽(yáng)性血液漏檢，混合樣本數(shù)則不宜過(guò)大，應(yīng)盡可能采用小樣本數(shù)混合檢測(cè)，甚至單人份檢測(cè)。NAT檢測(cè)最初在歐洲普遍流行96人份樣本混合檢測(cè)，隨后逐漸更換成48人份、24人份混合[10]。Roche、Chiron新一代NAT檢測(cè)系統(tǒng)的標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)模式分別為6人份混合檢測(cè)和單檢。

2.2特異性 血液篩查對(duì)試劑的特異性要求較高，盡管目前應(yīng)用于臨床診斷的有些國(guó)產(chǎn)NAT試劑特異性已經(jīng)很高，但考慮到血液篩查樣本量大，容易因樣本交叉污染、人工操作失誤等因素導(dǎo)致假陽(yáng)性出現(xiàn)，加上國(guó)產(chǎn)試劑、檢測(cè)儀器的可靠性及穩(wěn)定性較差，也難以確保檢測(cè)結(jié)果的可靠性和準(zhǔn)確性。目前，除了提高國(guó)產(chǎn)試劑的特異性之外，還必須要建立完善的檢測(cè)程序。

2.3內(nèi)標(biāo)物 目前，我國(guó)診斷試劑生產(chǎn)企業(yè)生產(chǎn)的核酸檢測(cè)試劑，多采用外對(duì)照作為PCR的質(zhì)控，鮮有采用內(nèi)對(duì)照的產(chǎn)品。但作為血源篩查的HIV、HCV RNA檢測(cè)試劑，NAT檢測(cè)試劑應(yīng)有內(nèi)標(biāo)物。每個(gè)檢測(cè)管都應(yīng)有內(nèi)標(biāo)以保證陰性結(jié)果的可靠性，內(nèi)標(biāo)最好是在樣品處理時(shí)即加入，這樣能對(duì)樣品處理至核酸擴(kuò)增檢測(cè)全過(guò)程進(jìn)行監(jiān)控；內(nèi)標(biāo)最好為RNA，便于對(duì)檢測(cè)過(guò)程中是否出現(xiàn)模板RNA降解問(wèn)題進(jìn)行監(jiān)控。

2.4全自動(dòng)化操作 NAT操作步驟較復(fù)雜，影響因素較多，且對(duì)操作人員的技能要求較高。采用全自動(dòng)核酸提取、擴(kuò)增檢測(cè)，能縮短檢測(cè)時(shí)間，提高檢測(cè)效率，便于質(zhì)控，同時(shí)也有利于進(jìn)行大樣本量的篩查。Roche新一代檢測(cè)系統(tǒng)COBAS S201 MPX System實(shí)現(xiàn)了在同一反應(yīng)管中進(jìn)行HIV/HCV/HBV 3項(xiàng)聯(lián)合檢測(cè)，實(shí)現(xiàn)了混樣/加樣、核酸提取、PCR擴(kuò)增/檢測(cè)的模塊自動(dòng)化；Chiron公司新一代檢測(cè)體系PROCLEIX TIGRIS ULTRIO System在對(duì)單個(gè)標(biāo)本進(jìn)行篩查時(shí)，可以在單一的全自動(dòng)設(shè)備（TIGRIS）上進(jìn)行，此設(shè)備能完成樣品抽提、擴(kuò)增和檢測(cè)全部工作。目前，我國(guó)核酸提取設(shè)備多為半自動(dòng)化操作，提取效率較差，尚未在國(guó)內(nèi)采供血機(jī)構(gòu)廣泛應(yīng)用。因此，應(yīng)該對(duì)核酸提取、擴(kuò)增檢測(cè)的整個(gè)流程進(jìn)行優(yōu)化，縮短檢測(cè)時(shí)間，提高檢測(cè)效率，建立一整套適合我國(guó)國(guó)情的血液核酸自動(dòng)化提取、擴(kuò)增檢測(cè)系統(tǒng)。

我國(guó)現(xiàn)階段除了引進(jìn)成熟的NAT血篩技術(shù)外，還應(yīng)提高國(guó)產(chǎn)核酸檢測(cè)試劑的質(zhì)量和自動(dòng)化，完善國(guó)產(chǎn)血液NAT檢測(cè)系統(tǒng)。這樣不但可降低相應(yīng)的檢測(cè)費(fèi)用，同時(shí)還更有利于新技術(shù)在國(guó)內(nèi)的推廣應(yīng)用，進(jìn)一步提高我國(guó)血液安全水平?？傊覈?guó)地域遼闊，經(jīng)濟(jì)發(fā)展水平、工作條件等相差較大，以何種具體形式開(kāi)展血液NAT檢測(cè)是一個(gè)需要深入探討的問(wèn)題。