孫麗麗 （山東省諸城市畜牧獸醫(yī)管理局 262200）

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尼帕病毒病診斷技術(shù)

孫麗麗 （山東省諸城市畜牧獸醫(yī)管理局 262200）

尼帕病毒病是由尼帕病毒(Nipah virus)感染引起的人畜共患病。其特征為急性發(fā)熱性腦炎和高死亡率。病原體是副粘病毒科(Paramyxoviridae)副粘病毒亞科(Paramyxovirinae)的亨尼帕屬(Henipavirus)成員，毒力強。本文就尼帕病毒病診斷技術(shù)進行簡要概述。

1 病原學(xué)診斷技術(shù)

1.1 病毒分離 在無菌情況下處理受檢樣品。用密閉的勻漿器處理含10%(w/v)組織樣品的懸浮液，如在密閉的金屬筒中用高壓滅菌的金屬球進行研磨，或者在罩袋式勻漿器中進行研磨。樣品磨碎后，300g離心，將上清加入到培養(yǎng)的Vero細(xì)胞或兔腎細(xì)胞(RK-13)中。NiV感染細(xì)胞后，引起的CPE的特征是出現(xiàn)細(xì)胞融合現(xiàn)象：經(jīng)過24~48h，有些融合的細(xì)胞可含有60個以上的細(xì)胞核，并且融合細(xì)胞的細(xì)胞核分布在融合細(xì)胞的周圍。如果沒有出現(xiàn)CPE，應(yīng)該再盲傳2次，每次培養(yǎng)5d。

1.2 分子生物學(xué)診斷 對于Nipah病毒與Hendra病毒的診斷，PCR檢測是很常規(guī)的方法，AAHL所建立的方法，是基于Nipah病毒與Hendra病毒的M蛋白基因的保守序列所設(shè)計的引物，進行巢式PCR擴增。這種RT-PCR方法可以用于固定的或新鮮的組織樣品進行診斷，或?qū)δX脊髓液進行診斷，也可以對細(xì)胞培養(yǎng)分離物進行快速鑒定。在美國CDC使用的是另一種方法，這種PCR是基于N基因之上的，在剛開始使用的PCR方法是基于P基因。Real time–PCR具有快速、準(zhǔn)確的特點，也被應(yīng)用于對這兩種病毒的檢測，Smith等首先建立了針對Hendra病毒M基因的Real time–PCR檢測方法，可以在4h內(nèi)得到檢測結(jié)果。Guillaume等建立了針對Nipah病毒N基因的Real time–PCR檢測方法，檢測靈敏度能達(dá)1PFU的病毒量，該方法適合對自然感染樣品或流行病學(xué)樣本進行檢測。

1.3 組織病理學(xué)診斷 免疫組織化學(xué)包括免疫熒光，免疫酶染色試驗，金標(biāo)記抗體試驗等，被證實是檢測Nipah病毒最有效的方法之一。通過福爾馬林固定組織，這種方法不僅安全，而且還可以對以前采集的組織病料進行回顧性調(diào)查。免疫組化試驗檢測部位包括腦組織、肺臟、腸系膜淋巴結(jié)、腎臟等，懷孕動物還應(yīng)該送檢子宮、胎盤以及胎兒組織等。

2 血清學(xué)診斷技術(shù)

2.1 血清中和試驗 血清中和試驗在某種程度被當(dāng)作結(jié)果判定的標(biāo)準(zhǔn)方法(Golden standard)，對于通過其他試驗所得到的陽性或可疑結(jié)果，均需要通過血清中和試驗進行驗證。其操作是在P4條件下，血清和病毒在96孔中預(yù)先溫育后，再加入到有Vero細(xì)胞的孔中，血清篩選使用的稀釋度為1:2(對于血樣來源貧乏者，例如所采集的動物是瀕死的飛狐和小蝙蝠，初始的血清稀釋度可以設(shè)為1:5)，這種稀釋度偶爾會產(chǎn)生細(xì)胞毒性。培養(yǎng)3d后觀察結(jié)果，那些徹底阻止出現(xiàn)CPE的血清記為陽性。

2.2 ELISA檢測 ELISA方法以其敏感、快速和高通量的特點，非常適合作為流行病學(xué)調(diào)查和血清學(xué)篩查工具。由于Nipah病毒與Hendra病毒有交叉反應(yīng)，因此早期在馬來西亞是使用滅活的Hendra病毒來作為檢測抗原的，并建立了血清IgM、IgG的檢測方法。Ramasundram等研究表明，病人感染4d后，腦脊液中的IgM抗體陽轉(zhuǎn)率為65%，而12d后陽轉(zhuǎn)率達(dá)到100%，并可維持3個月的時間，感染后25dIgG抗體陽轉(zhuǎn)率為100%。

由于該病毒高度危險，一般的實驗室不能進行病毒的培養(yǎng)，所以使用基因工程表達(dá)的重組蛋白作為檢測抗原顯示了良好的應(yīng)用前景，在未出現(xiàn)該病毒的國家，特別適合應(yīng)用這種方法生產(chǎn)抗原來進行流行病學(xué)調(diào)查。利用原核系統(tǒng)對Nipah病毒N蛋白進行重組表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物能很好的和感染豬血清中的抗體反應(yīng)；用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)對Nipah病毒N蛋白進行表達(dá)，檢測結(jié)果提示重組N蛋白可以代替全病毒作為ELISA檢測抗原。分別在桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)和大腸桿菌中對Nipah病毒G的胞外區(qū)基因進行表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)表達(dá)的蛋白作為抗原適用于常規(guī)的Nipah病毒抗體檢測，也可以應(yīng)用于血清學(xué)的流行病學(xué)調(diào)查。盡管ELISA方法特異性較高，但其判定條件需要仔細(xì)評估，對陽性樣本現(xiàn)在通常使用血清中和實驗進行驗證，只有那些在兩個體系中均反應(yīng)的樣本才能被認(rèn)為是陽性的。采樣時需要在第一次采樣以后3周時，再抽樣檢測1次，以便留下時間使陽轉(zhuǎn)的血清得以檢出，如此反復(fù)的檢測，一直到確信感染在整個被檢測的畜群中被消除了為止。

2.3 單抗檢測 單抗具有特異性強，敏感性高的特點廣泛應(yīng)用于對病原及其特異性抗體的免疫學(xué)鑒定，目前已經(jīng)有關(guān)于針對兩種病毒單抗制備及其在診斷實驗中應(yīng)用的報道。用福爾馬林滅活的Nipah病毒作為抗原制備8株單克隆抗體，將這些單抗應(yīng)用于免疫組化實驗，其中有2株單抗只和Nipah病毒感染的豬肺臟組織反應(yīng)，而不和Hendra病毒感染的馬肺臟組織反應(yīng)，顯示這兩株單抗在鑒別診斷方面具有獨特的作用。利用其中1株針對Nipah病毒的特異性單抗，建立了一種阻斷ELISA方法，可檢測感染豬血清中的Nipah病毒抗體，結(jié)果和血清中和實驗有很好的符合率，這種方法也可以應(yīng)用于對各種動物血清抗體的檢測。利用滅活的Nipah病毒免疫小鼠，制備5株針對Nipah病毒的IgG單抗，通過Western blot鑒定了這些單抗針對的特異性結(jié)構(gòu)蛋白，其中4株是針對N蛋白的，1株是針對M蛋白的。在體外實驗中，所有的單抗均沒有中和作用，所有單抗均可用于ELISA實驗和免疫熒光實驗，但是F45G2(抗N)最適合做長時間福爾馬林固定組織的免疫熒光；三株針對N的的單抗能和Hendra病毒N產(chǎn)生交叉反應(yīng)；一株針對N的和一株針對M的單抗不和Hendra病毒產(chǎn)生交叉反應(yīng)，顯示在未來的實驗中具有鑒別診斷意義。

（2012–05–14）

S855.3

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1007-1733(2012)09-0042-02