丁原全，劉鵬，馬乾章

（1 中國人民解放軍沈陽軍區(qū)衛(wèi)生技術(shù)干部訓(xùn)練中心，遼寧 大連 116017； 2 遼寧中醫(yī)藥大學(xué)； 3 遼寧省中醫(yī)院）

圍絕經(jīng)期卵巢功能衰退，卵泡閉鎖，卵泡數(shù)量減少［1］，體內(nèi)雌激素水平顯著降低，從而出現(xiàn)各種臨床癥狀。本研究觀察了圍絕經(jīng)期大鼠卵巢的超微結(jié)構(gòu)及補(bǔ)腎復(fù)方的干預(yù)作用，探討補(bǔ)腎復(fù)方作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 雌性Wistar大鼠，由沈陽醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。實(shí)驗(yàn)前，置遼寧省中醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心動(dòng)物室內(nèi)適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。實(shí)驗(yàn)期間同一室內(nèi)（室溫18～22℃），12 h－12 h晝夜環(huán)境條件下籠養(yǎng)，自由飲水，攝食顆粒飼料（由沈陽醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供）。

1.1.2 藥物 補(bǔ)腎復(fù)方由熟地、山藥、山萸肉、菟絲子、仙靈脾、丹參組成。補(bǔ)腎復(fù)方和六味地黃湯生藥均由遼寧省中醫(yī)院門診中藥局提供，并經(jīng)生藥檢驗(yàn)。由制劑室制作相應(yīng)濃度的水煎劑，高壓密封備用。

1.1.3 儀器 超薄切片機(jī)，瑞典LKBⅤ型；電子顯微鏡，日本JEM100CX－Ⅱ型。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組及處理 4月齡青年鼠（青年組）、18月齡老年鼠（老年組）各10只；11～12月齡鼠50只（根據(jù)陰道脫落細(xì)胞檢查，無規(guī)律性動(dòng)情周期變化，確定為圍絕經(jīng)期大鼠），隨機(jī)分為模型組、對(duì)照組及補(bǔ)腎復(fù)方高、中、低劑量組各10只。補(bǔ)腎復(fù)方高、中、低劑量組大鼠分別給予高、中、低劑量補(bǔ)腎復(fù)方20 mL／kg（相當(dāng)于人臨床一日用量的10、6、3倍量，分別含生藥5.80、3.50、1.75 kg／L），每天9：00灌胃；對(duì)照組灌服等體積六味地黃湯；模型組、青年組與老年組灌服等體積的生理鹽水。

1.2.2 超微結(jié)構(gòu)觀察 大鼠灌藥4周，于最后一次給藥后24 h，以200 g／L烏拉坦腹腔注射麻醉后，固定，剖腹迅速取卵巢，切成1 mm3大小的組織塊若干，以25 g／L戊二醛、10 g／L鋨酸雙重固定，乙醇梯度脫水，環(huán)氧樹脂Epon812包埋，超薄切片機(jī)切片，厚度5μm，醋酸鈾、檸檬酸鉛雙染色，于電鏡下觀察，并拍照。

2 結(jié) 果

各組電鏡觀察所見如下。①青年組：細(xì)胞處于增殖分化狀態(tài)，卵巢皮質(zhì)的淺表部有大量的卵泡。卵泡周圍為單層扁平的顆粒細(xì)胞。在生長卵泡中可見多層顆粒細(xì)胞，其數(shù)量多，細(xì)胞核和細(xì)胞基質(zhì)密度均勻，核大，核仁明顯，胞質(zhì)豐富。胞漿中滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、脂滴均較豐富，滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)無擴(kuò)張，線粒體分布均勻，囊泡形成較少，基質(zhì)密度高，體積小，多為管狀嵴；異染色質(zhì)聚集核膜內(nèi)側(cè)。②模型組：顆粒細(xì)胞內(nèi)線粒體嵴髓峭樣變、空變，溶酶體空泡化，并可見滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張，顆粒細(xì)胞核孔增大，高爾基體肥大，線粒體腫脹，黃體細(xì)胞出現(xiàn)凋亡。③補(bǔ)腎復(fù)方高劑量組：細(xì)胞結(jié)構(gòu)接近于青年組，細(xì)胞處于高度合成與分泌狀態(tài)，胞漿中存在大量大小均勻的脂滴，電子密度高，滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)充滿胞漿，有豐富的高爾基復(fù)合體。④補(bǔ)腎復(fù)方中劑量組：滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)豐富，中度擴(kuò)張，胞質(zhì)內(nèi)脂滴較多，電子密度不等，線粒體數(shù)目增多，體積增大，部分線粒體腫脹，核膜擴(kuò)張。⑤補(bǔ)腎復(fù)方低劑量組：顆粒細(xì)胞線粒體豐富，脂滴體積增大，滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)輕度擴(kuò)張，線粒體擴(kuò)張顯著，脂滴較多，大小不等，卵泡數(shù)量較青年組稍少，核膜擴(kuò)張，核孔增寬。⑥對(duì)照組：顆粒細(xì)胞豐富，可見少量線粒體腫脹，卵泡細(xì)胞出現(xiàn)電子密度高的脂滴，高爾基復(fù)合體豐富，核膜擴(kuò)張。⑦老年組：可見大量髓峭樣結(jié)構(gòu)，線粒體腫脹、空泡化，染色質(zhì)濃縮、邊集，基質(zhì)較薄，電子密度低，可見細(xì)胞凋亡。

模型組大鼠卵泡明顯少于青年組，閉鎖卵泡增多。應(yīng)用補(bǔ)腎復(fù)方后，生長卵泡增多，與對(duì)照組比較，補(bǔ)腎復(fù)方各劑量組卵巢的超微結(jié)構(gòu)明顯改善，表現(xiàn)在線粒體豐富、有大量的脂滴等，且呈一定的劑量效應(yīng)關(guān)系。

3 討 論

卵巢具有生殖和內(nèi)分泌功能，其超微結(jié)構(gòu)是鑒定卵巢發(fā)育狀況，評(píng)定其活力及健康狀況的重要手段之一。線粒體的形態(tài)結(jié)構(gòu)、功能變化等易受細(xì)胞內(nèi)、外環(huán)境的影響而發(fā)生明顯的變化，是細(xì)胞病變或衰老最敏感的指標(biāo)之一［2］。粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分布情況及發(fā)達(dá)程度可作為判斷細(xì)胞功能狀態(tài)和分化程度的一個(gè)指標(biāo)?；鎯?nèi)質(zhì)網(wǎng)主要分布在能合成類固醇激素的細(xì)胞，其含有合成膽固醇的全套酶系和使膽固醇轉(zhuǎn)化為類固醇激素如腎上腺激素、雄激素、雌激素的酶類，對(duì)內(nèi)外環(huán)境的變化極為敏感，是誘發(fā)凋亡的重要細(xì)胞器之一［3－4］。高爾基復(fù)合體在細(xì)胞內(nèi)膜的交通上也起重要作用。溶酶體能進(jìn)行內(nèi)源性和外源性物質(zhì)的消化，還參與機(jī)體的免疫過程、某些生理活動(dòng)和發(fā)育過程［5］。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，補(bǔ)腎復(fù)方在卵巢局部的調(diào)節(jié)中發(fā)揮著重要的作用，可使卵巢滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)增多，脂滴明顯增多，線粒體數(shù)目增多，且呈一定的劑量效應(yīng)關(guān)系，與高慧等［6］的結(jié)論基本吻合。雌激素合成的原料為膽固醇，其在體內(nèi)以脂滴的形式存在，合成雌激素過程的關(guān)鍵酶為芳香化酶，芳香化酶存在于滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上。因此，一定的條件可使膽固醇轉(zhuǎn)化成機(jī)體需要的雌激素，使卵巢的超微結(jié)構(gòu)明顯改變，從而改善卵巢的功能，有利于卵泡的生長發(fā)育，在一定程度上延緩卵巢的衰老。補(bǔ)腎復(fù)方可以直接作用于卵巢等組織，有類雌激素的治療作用，能改善卵巢組織的營養(yǎng)狀態(tài)，有效延緩卵巢組織的萎縮。

［1］BURGER H G，DUDLEY E C，ROBERSON D M，et al.Hor monal changes in the menopause transition［J］.Recent Prog Hor m Res，2002，57：257.

［2］TRIFUNOVIE A，LARSSON N G.Mitoehondrial dysf unction as a cause of ageing［J］.J Intern Med，2008，263（2）：167.

［3］CHEN X Z，DOUG LAS B K，LUO J，et al.Endoplasmie reticulu m Ca2＋dysregulation and endoplasmic reticul um sress following in vitro neuronal ischemia of Na＋－K＋－Cl－contransporter［J］.J Neurochem，2008，106（11）：1563.

［4］MONIQUE C S，BARRY J C，TAREK M S.Ischemic tolerance following low dose NMDA involves modulation of cellular stress proteins［J］.Brain Research，2009，1247（2）：212.

［5］TURK V，TURK B，GUNCAR G，et al.Lysosomal cathepsins：structure，role in antigen processing and presentation and cancer［J］.Adv Enzy me Regul，2002，42：285.

［6］高慧，楊涓，夏天，等.補(bǔ)腎調(diào)沖方對(duì)卵巢早衰大鼠性激素水平和卵巢組織形態(tài)學(xué)的影響［J］.國醫(yī)論壇，2008，23（1）：35.