符運良，張鐵民，王林茂

(海南師范大學 物理與電子工程學院，海南 海口571158)

0 引 言

食品安全問題關系到人們的生命健康安全，得到了人們越來越多的重視。其中，食品中獸藥殘留問題是一個較突出的問題，食用過量的獸藥殘留的動物源性食品對人類的健康造成危害。世界上許多國家和組織對動物性食品中獸藥殘留都規(guī)定了最大的殘留量，如美國和歐盟規(guī)定動物的可食用組織中的磺胺獸藥殘留總量不得超過100 μg/kg［1］。目前，對于動物性食品中獸藥殘留的檢測有很多種方法，如傳統(tǒng)的微生物檢測法［2］、高效液相色譜(HPLC)法［3］、酶聯(lián)免疫法(ELISA)［4］，這些方法要么耗時間過長，或檢測精度低，儀器設備昂貴，同時，這些方法通常是一種檢測方法對應一種藥物殘留，不容易實現(xiàn)多種殘留的分析檢測。基于表面等離子共振(surface plasmon resonance，SPR)效應的生物傳感器免疫法是近年來發(fā)展的一種新的檢測方法，其具有實時監(jiān)測分子間的相互作用、無需標記、定量準確等特點，已被廣泛應用于藥物研究［5］、食品分析［6］、環(huán)境監(jiān)測［7］等領域。20 世紀 90 年代，瑞典的 Biacore公司將SPR 生物傳感器技術引入獸藥殘留分析中，目前，已生產(chǎn)出多種檢測試劑盒。國內(nèi)已有利用SPR 技術進行獸藥殘留的研究［8～9］，該技術方法具有樣品前處理相對簡單、高特異性、分析快捷、定量準確等優(yōu)勢［10］。本研究利用SPR 技術，建立磺胺二甲嘧啶的檢測方法，該方法簡單、快速、靈敏度高，重復性好，適用于大量的無標記的雞蛋或牛奶中獸藥殘留的檢測。

1 實 驗

1.1 磺胺二甲嘧啶芯片的制備

將裸金膜傳感器芯片放入儀器中，在空氣環(huán)境條件下進行格式化，然后，選擇第2 個通道，注入蒸餾水，流過芯片表面，點擊標定，出現(xiàn)SPR 曲線，待曲線穩(wěn)定后，向金膜表面流動注入1 mol/L 11-巰基十一烷酸，時間約3 h，而后，用PBS 緩沖液沖洗，信號穩(wěn)定后，在金膜表面固定一層羥基。將 0.4 mol/L EDC 和0.1 mol/L NHS(1∶1，體積比)混合后注入，活化金膜表面的羥基，形成活性酯，時間約1 h，用PBS緩沖液沖洗，注入溶液的流速均為10 μL/min，磺胺二甲嘧啶-牛血清白蛋白用醋酸緩沖液(pH =4.4)1∶50 稀釋，以10 μL/min流速注入儀器中，信號穩(wěn)定后，用PBS 緩沖液沖洗，這樣抗原便固定在金膜上;最后，將1 mol/L 乙醇胺(pH=8.5)以10 μL/min 的流速注入，封閉金膜上未被蛋白結合的活性位點，PBS 緩沖液沖洗，完成分子識別膜的制備，原理結構如圖1 所示。

圖1 SPR 傳感器結構圖Fig 1 Structure diagram of SPR sensor

1.2 抗體工作濃度的選擇

磺胺二甲嘧啶單克隆抗體，用PBS 緩沖液分別稀釋為1∶100，1∶200，1∶500，1∶1000，1∶5000 倍，與濃度分別為 1，40 mg/L磺胺二甲嘧啶的PBS 緩沖液混合后，注入芯片表面，反應10 min，比較曲線，根據(jù)檢測限的要求與檢測范圍，選擇抗體工作適當?shù)臐舛取?/p>

由于抗體濃度高時，抑制樣品的濃度也隨著增加，導致檢測的靈敏度下降，檢測限提高;抗體濃度過低，競爭的抑制樣品濃度范圍變小，但抗體濃度越低時，檢測限就越低，越有利于檢測，選擇較低濃度的工作抗體濃度1∶5000 稀釋。

1.3 建立抑制標準曲線

以工作抗體濃度與含有不同濃度(0，1.2，2.4，8，11.5 mg/L)磺胺二甲嘧啶的PBS 緩沖液，在室溫(20 ℃)下混合4 min，注入傳感器中，以信號強度為縱坐標，以時間為橫坐標，繪制競爭抑制曲線。

1.4 構建牛奶樣品濃度抑制標準曲線

將無抗牛奶(市場購買)稀釋10 倍后，離心機10000 r/min離心5 min，取中間層，加入磺胺二甲嘧啶，濃度分別為 0，0.4，0.8，5，10，50，100 mg/L，加入工作抗體，注入儀器中，以信號強度為縱坐標，以濃度的對數(shù)值為橫坐標，繪制牛奶中的磺胺二甲嘧啶濃度添加競爭抑制標準曲線。

2 實驗結果與分析

2.1 芯片表面固定磺胺二甲嘧啶抗原過程

將 0.4 mol/L EDC 和0.1 mol/L NHS(1∶1，體積比)混合后注入，活化金膜表面的羥基，形成活性酯，時間約7 min，SPR信號上升。用PBS 緩沖液沖洗，注入溶液的流速均為10 μL/min，將磺胺二甲嘧啶-牛血清白蛋白用醋酸液(pH=4.4)1:50 倍，以 10 μL /min 注入儀器中，結合信號上升，信號穩(wěn)定后，用PBS 緩沖液沖洗，這樣抗原便固定在金膜上;最后將 1 mol/L 乙醇胺(pH =8.5)以 10 μL/min 的流速注入，滅活封閉金膜上未被蛋白結合的活性位點，PBS 緩沖液沖洗，完成分子識別膜的制備，整個過程的SPR 傳感信號如圖2 所示。

圖2 芯片表面固定抗原過程Fig 2 Process of immobilization of antigen on chip surface

2.2 磺胺二甲嘧啶濃度抑制標準曲線的建立

圖3 為利用SPR 傳感器免疫法檢測PBS 中的磺胺二甲嘧啶所得的標準曲線，從上到下，濃度依次為0，1.2，2.4，8.0，11.5 mg/L。特異性抗原與抗體結合，在結合階段信號強度表現(xiàn)為上升的結合曲線，特異性結合較為穩(wěn)定，抗體與固定于芯片表面的抗原結合后，通入PBS 緩沖液達到一個相對穩(wěn)定的狀態(tài)，當通入洗脫液0.1 mol/L HCl 或0.1 mol/L NaOH 溶液，在洗脫液的作用下，才能迅速解離，基線恢復回到反應前的高度。

2.3 牛奶樣品中磺胺二甲濃度抑制標準曲線的建立

圖4 為牛奶樣品中，磺胺二甲嘧啶濃度分別為0，0.4，0.8，5，10，50，100 mg/L，加入抗體(工作濃度)，注入儀器中，以信號強度為縱坐標，濃度以10 為底對數(shù)為橫坐標，繪制得的牛奶的藥物殘留濃度標準曲線。將一定濃度的抗體與樣品混合后，如果樣品中的含有磺胺二甲嘧啶，部分抗體將被與磺胺二甲嘧啶結合，不能再與芯片表面的抗原結合，這樣導致結合到芯片表面的抗體減少，結合值SPR 信號下降。因此，通過以不同質量濃度的磺胺二甲嘧啶與一定濃度的抗體混合，就可獲得競爭抑制的標準濃度曲線。此外，測量樣品時，由測得的數(shù)據(jù)與標準樣品曲線進行比較，可計算出牛奶樣品中磺胺二甲嘧啶的殘留濃度值。由上述實驗測得的數(shù)據(jù)，Sigmoidal 即S 型非線性關系擬合得擬合方程

y=A2+(A1－A2)/(1 +(x/x0)p).

其中，A1=3 657.724 56，A2=3010.444，x0=9.503 5，P=1.506 43。質量濃度測定線性范圍為3 ～48 mg/L，可以實現(xiàn)牛奶樣品的磺胺二甲嘧啶濃度范圍的檢測，最低檢測濃度低于國家允許的標準限100 mg/L。

圖3 抗體與抗原特異性結合的響應曲線與再生過程Fig 3 Response curves and regeneration process of specific binding between antibody and antigen

圖4 牛奶中磺胺二甲嘧啶競爭抑制標準曲線Fig 4 Standard competitive inhibition curve of sulfamethazine in milk

2.4 樣品濃度回收率的測定

對5 個添加磺胺二甲嘧啶的樣品(40 mg/L)，分析其回收率，測定結果如表1 所示，回收率定義為各次樣品檢測值與檢測平均值之比值，由表可知，回收率計算為99%，相對標準偏(RDS)計算值為3.2%，小于10%，表明測量的精度較高。

表1 樣品濃度回收率Tab 1 Recovery rate of sample concentration

3 結 論

研究通過使用磺胺二甲嘧啶的單克隆抗體與SPR 生物傳感器檢測PBS 緩沖液中的磺胺二甲嘧啶，對照牛奶中添加不同質量濃度的磺胺二甲嘧啶，得到標準曲線，最低檢測限為2.4 mg/L。樣品只需簡單的稀釋、離心處理即可直接測量，可以實現(xiàn)牛奶樣品中的磺胺二甲質量濃度范圍為3 ～48 mg/L，單個樣品前處理5 min，測量約7 min，整個過程在16 min 之內(nèi)完成，能夠滿足實際檢測過程的需要，這種方法簡單快速，抗體無需標記，樣品基質的影響小，與抗原具有中等親和力的抗體和洗脫，配合適當?shù)臉悠非疤幚矸椒?，可以用以檢測抗體對應的小分子物質，具有廣泛的應用前景。

［1］ 王緒聊，吳永寧.色譜在食品安全分析中的應用［M］.北京:中國輕工業(yè)出版社，2004:270 －271.

［2］ Becerril R，Gomez L R，Goni P，et al.Combination of analytical and microbilogical techniques to study the antimicrobial activity of a new active food packaging containing cinnamon Or oregano against E.coli.and S.aureus［J］.Anal Bioanal Chem，2007，388(5/6):1003 －1011.

［3］ Peng X，Tang J.Multiresidue determination of fluoroquinolone，sulfonamide，trimethoprim，and chloramphenicol antibiotics in urban waters in China［J］.Environmental Toxicology and Chemistry，2008，27(1):73 －79.

［4］ Jin Y，Jang J W，Lee M H，et al.Development of ELISA and immunochromatographic assay for the detection of neomycin［J］.Clin Chim Acta，2006，364(1/2):260 －266.

［5］ Thill P，Newcombe A R，Odonovan K，et al.Detection and quantification of affinity ligand leaching and specific antibody fragment concentration within chromatographic fractions using surface Plasmon resonance［J］.Biotechnol Appl Biochem，2007，48(2):179 －188.

［6］ Labib M，Hedstrom M，Amin M，et al.A capacitive immunosensor for detection of cholera toxin［J］.Anal Chim Acta，2009，634(2):255 －261.

［7］ Khalavka Y，Becker J，Sonnichsen C.Synthesis of rodshaped gold nanorattles with improved Plasmon sensitivity and catalytic activity［J］.Journal of the American Chemical Society，2009，131(5):1871 －1875.

［8］ 周宏敏，歐惠超，姜 浩，等.利用表面等離子共振技術快速檢測牛奶中的磺胺甲噁唑［J］.食品科學，2010，31(6):168 －171.

［9］ 李 輝，崔大付，王于杰，等.利用表面等離子諧振生物傳感器檢測磺胺二甲嘧啶的方法研究［J］.食品科學，2007，28(6):288 －292.

［10］ 郭文林.利用表面等離子諧振免疫生物傳感器檢測動物組織中的獸藥殘留［J］.中國獸藥雜志，2004，38(11):31 －36.