雷云霆,竇全文

(1.中國科學院西北高原生物研究所，青海 西寧 810001；2.中國科學院研究生院，北京 100049)

老芒麥(Elymussibiricus)和垂穗披堿草(E.nutans)是禾本科小麥族披堿草屬多年生疏叢草本植物，是青藏高原高寒區(qū)具有廣泛分布的野生資源。老芒麥和垂穗披堿草對該地區(qū)極端寒冷干旱的生態(tài)環(huán)境具有良好的適應性和廣泛的生態(tài)可塑性[1-2]，且高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)，故已經(jīng)成為該地區(qū)栽培利用的最為廣泛的當家牧草草種[3-4]。目前生產(chǎn)中，主要栽培利用的老芒麥和垂穗披堿草品種都是在搜集當?shù)匾吧N質(zhì)資源的基礎上，通過篩選、鑒定、選育而來的應用面積較廣的品種有同德老芒麥、青牧1號、川草1號等[5-7]。青藏高原分布的老芒麥和垂穗披堿草野生種質(zhì)資源，是對這兩個草種進行進一步遺傳改良的重要物質(zhì)基礎，該地區(qū)生長的這兩個物種野生種質(zhì)資源的采集、鑒定對于高寒牧草育種具有重要意義。

老芒麥和垂穗披堿草皆為花序下垂類披堿草屬物種，在經(jīng)典的分類學上，通過一些形態(tài)學特征可將這兩個物種進行很好地區(qū)分。但是，在實際野外種質(zhì)資源采集中，由于形態(tài)學特征受到生長環(huán)境的影響，對二者進行準確地區(qū)分比較困難。盧紅雙等[8]對于來源于不同地區(qū)的49份穗型下垂類披堿草進行形態(tài)學鑒定和聚類分析研究后認為，老芒麥和垂穗披堿草在長期適應進化過程中，兩個種不同的生態(tài)型在形態(tài)性狀上具有較多的性狀交叉，使得分類學的鑒定很困難。在對從美國國家植物種質(zhì)資源庫(NPGS)引進的10多份垂穗披堿草種質(zhì)利用細胞學進行鑒定時，發(fā)現(xiàn)其中有部分種質(zhì)實際上是老芒麥。由此可見，在野外種質(zhì)資源搜集中，將老芒麥和垂穗披堿草混淆是一個比較常見的問題。

在細胞學水平上，老芒麥是異源四倍體物種，染色體數(shù)為28，染色體組組成為StStHH[9]；垂穗披堿草為異源六倍體物種，染色體數(shù)為42，染色體組組成為StStHHYY[10]，其中St組來自擬鵝冠草屬(Pseudoroegneria)[11]，H組來自大麥屬(Hordeum)[12]，Y組的來源尚不清楚[13]。顯然，通過細胞學觀察，可以將這兩個物種很清楚地區(qū)分開來。但實際工作中，染色體的準確鑒定一般需要具有一定細胞學研究經(jīng)驗的研究者，而且操作過程相對費時、費力。DNA分子標記具有多態(tài)性高，無組織、器官及發(fā)育時期的特異性，不受環(huán)境條件的影響等優(yōu)點，分子標記技術(shù)已經(jīng)應用于植物遺傳育種的各個領域，尤其是基于PCR反應的分子標記技術(shù)，由于操作簡便、快速，現(xiàn)已成為眾多實驗室的常規(guī)技術(shù)手段。在眾多分子標記類型中，SSR(Simple Sequence Repeat)分子標記具有共顯性、重復性好、穩(wěn)定性高等優(yōu)點，尤其受到遺傳育種工作者的青睞。

本研究首先利用細胞學技術(shù)對老芒麥和垂穗披堿草種質(zhì)進行鑒定，然后利用普通小麥(Triticumaestivum)中開發(fā)出的SSR分子標記對老芒麥和垂穗披堿草進行多態(tài)性篩選，并對篩選出的多態(tài)性標記進行廣泛性驗證，在此基礎上，篩選出能夠鑒別老芒麥和垂穗披堿草種質(zhì)的SSR分子標記。

1 材料與方法

1.1材料 研究材料由兩部分組成，一部分材料由美國國家植物種質(zhì)庫(NPGS)引進(表1)，這部分材料被原始搜集者鑒定為垂穗披堿草，因此均被當作垂穗披堿草種質(zhì)引進；另一部分材料在青海當?shù)厮鸭?表2)，其中多葉老芒麥(Qingmu No.1)和同德老芒麥(Tongde)是高寒牧區(qū)廣泛種植的品種，其他為野外采集材料，這些材料種名鑒定由中國科學院西北高原生物研究所專門從事小麥族分類學研究的專家完成。青海當?shù)夭牧虾鸵巴獠杉牧暇鶠榉N子成熟期采集的種子，干燥環(huán)境保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2方法

1.2.1細胞學鑒定 經(jīng)過低溫破除休眠處理的披堿草種子在室溫下發(fā)芽，剪取1～2 cm胚根，冰水預處理24 h，卡諾液室溫固定2 h以上，切取根尖分生區(qū)用45%醋酸壓片。制片首先在Leica顯微系統(tǒng)相差裝置下進行觀察，選取中期分裂相良好的制片在-80 ℃冰箱冰凍處理1 h后揭片，然后利用DAPI進行套染，利用Leica顯微系統(tǒng)熒光裝置進行觀察和照相。

表1 引進的垂穗披堿草材料

表2 在青海地區(qū)搜集的披堿草屬野生材料和品種

1.2.2引物篩選與PCR擴增 從公布在國際小麥族協(xié)作網(wǎng)(www.wheat.pw.usda.gov/)的小麥基因組SSR和EST-SSR引物中挑選42對引物(引物由上海生工生物工程公司合成)。參考李景環(huán)等[14]的CTAB法提取所需披堿草屬材料總DNA。PCR反應體系和程序參照R?der等[15]的方法，通過優(yōu)化調(diào)整最終優(yōu)化的25 μL PCR擴增體系：模板DNA 1.5 μL (50 ng·μL-1)，10×PCR Buffer 2.5 μL (含Mg2+)，dNTP 2 μL (2.5 mmol·μL-1)，Taq DNA聚合酶0.2 μL(5 U·μL-1)，上下游引物均為1.0 μL (10 μmol·μL-1)；ddH2O補足體積。PCR擴增條件：94 ℃預變性5 min，94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共35個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。所有反應在Applied Biosystems PCR儀上進行。

1.2.3SSR引物PCR產(chǎn)物的檢測 擴增產(chǎn)物在8%聚丙烯酰胺凝膠上用1×TBE緩沖液進行電泳分離，經(jīng)溴化乙錠稀釋液染色后，用Vilber Leurmat自動成像系統(tǒng)照相。

2 結(jié)果與分析

2.1細胞學鑒定 觀察根尖細胞有絲分裂中期分裂相，可以很清楚地將四倍體(圖1)和六倍體(圖2)區(qū)分開來。

對引進的所有垂穗披堿草種質(zhì)進行細胞學鑒定結(jié)果表明，14份材料中有5份材料染色體數(shù)為28，與預期染色體數(shù)42不符(表3)。因此,這5份材料，雖然當初被采集者據(jù)形態(tài)學鑒定為垂穗披堿草，并被歸類為垂穗披堿草種質(zhì)，但實際上為老芒麥。這些材料的采集地分布在四川、內(nèi)蒙、青海、甘肅、新疆等不同地點，并由不同采集者鑒定。由此可見，由于老芒麥和垂穗披堿草形態(tài)上的相似性及在不同生態(tài)環(huán)境下的變異性，其種質(zhì)在形態(tài)鑒定上很容易混淆。

圖1 6號材料(PI 531644)有絲分裂中期

圖2 1號材料(PI 499450)有絲分裂中期

表3 引進垂穗披堿草材料細胞學鑒定結(jié)果

對在青海采集的披堿草材料進行細胞學鑒定結(jié)果表明，所有材料染色體數(shù)與預期相符，即同德老芒麥、多葉老芒麥及其他3種野生老芒麥材料的染色體數(shù)為28；而垂穗類披堿草材料的染色體數(shù)為42。

2.2EST-SSR多態(tài)性初步篩選 考慮到六倍體垂穗披堿草(染色體組為StHY)比四倍體老芒麥(染色體組為StH)多一組染色體Y，因此對老芒麥和垂穗披堿草多態(tài)性引物篩選中，能穩(wěn)定地在垂穗披堿草材料中擴增出可能來自Y染色體組的額外遺傳位點的產(chǎn)物，以區(qū)別于老芒麥，有可能作為區(qū)別老芒麥和垂穗披堿草較理想的分子標記。以經(jīng)過細胞學鑒定的15號材料同德老芒麥和16號材料多葉老芒麥為老芒麥代表，11號和12號材料為垂穗披堿草代表，利用已經(jīng)過前期研究在披堿草中具有擴增產(chǎn)物的42對小麥的SSR引物對這兩類材料進行多態(tài)性篩選，結(jié)果表明,42對SSR引物中，Xcwem38c可能穩(wěn)定、重復地將這兩類材料區(qū)分開，Xcwem38c在垂穗披堿草材料中擴增出的在130～180 bp的多態(tài)性條帶在老芒麥材料中缺乏(圖3)，說明其能夠較好地區(qū)分老芒麥和垂穗披堿草。

2.3EST-SSR多態(tài)性標記的進一步驗證 在對多態(tài)性標記初步篩選中僅用了兩對老芒麥和垂穗披堿草材料。對引進的垂穗披堿草種質(zhì)的細胞學鑒定結(jié)果表明，這些材料中既有垂穗披堿草又有老芒麥，由于這些材料來自于四川、內(nèi)蒙、新疆、西藏、青海、甘肅等地，在生態(tài)環(huán)境分布上跨距較大。為了進一步驗證篩選出的標記的有效性，利用Xcwem38c對這些材料進行了擴增，結(jié)果表明，在15號同德老芒麥和16號多葉老芒麥以及4、6、7、8和10號材料中沒有多態(tài)性條帶的擴增產(chǎn)物出現(xiàn)，其余材料中(除12號外)均在150 bp左右有兩條多態(tài)性條帶，而12號材料在約110和160 bp有多態(tài)性條帶，以區(qū)別于老芒麥(圖4)。

對1～14號材料的細胞學鑒定表明，4、6、7、8和10號材料為四倍體28條染色體，在本研究中這5個材料中都沒有多態(tài)性擴增產(chǎn)物，利用Xcwem38c引物對這些材料的鑒定結(jié)果與細胞學鑒定的結(jié)果非常一致。12號材料多態(tài)性條帶分子量大小有別于其他六倍體垂穗披堿草材料，表明這個材料可能與其他種質(zhì)具有較大的遺傳分化。由于這些材料生境分布上距離比較遠，而利用Xcwem38c擴增出的多態(tài)性分子標記能穩(wěn)定地將這些材料辨別，表明篩選到的SSR引物Xcwem38c能夠準確地在分子水平上將老芒麥和垂穗披堿草區(qū)分開來。

圖3 部分SSR引物擴增結(jié)果

圖4 引物Xcwem38c在14份引進材料上的擴增結(jié)果

2.4EST-SSR多態(tài)性標記在青藏高原野生材料中的廣泛性驗證 利用Xcwem38c對不同來源的老芒麥和垂穗披堿草材料進行擴增時，無論是老芒麥還是垂穗披堿草中都會在100 bp左右有一條帶在兩個物種中穩(wěn)定擴增出現(xiàn)，而在其他試驗材料中150 bp左右大多有兩條多態(tài)性條帶。為了進一步驗證SSR引物Xcwem38c的穩(wěn)定性、可靠性和廣泛性，選取具有代表性的青藏高原野生老芒麥和垂穗披堿草材料，進行PCR擴增反應(圖5)。17～20號和21～23號材料都是經(jīng)過形態(tài)學和細胞學鑒定的野生垂穗披堿草和老芒麥材料，Xcwem38c在這些野生材料中的PCR擴增結(jié)果和細胞學鑒定結(jié)果相吻合。結(jié)果表明，SSR引物Xcwem38c可以在這些材料中進行穩(wěn)定性擴增，進一步驗證篩選到的EST-SSR引物Xcwem38c能夠準確可靠地在分子水平上將老芒麥和垂穗披堿草區(qū)分開來。

3 討論與結(jié)論

垂穗披堿草和老芒麥都是披堿草屬的常見種，分類學家常常根據(jù)外部形態(tài)學性狀進行區(qū)分，垂穗披堿草形態(tài)學性狀主要表現(xiàn)為,穗狀花序緊密、小穗排列多偏向于穗軸一側(cè)等特征，而老芒麥則表現(xiàn)為穗狀花序疏松、小穗排列不偏于穗軸一側(cè)的特征[16-17]。對從美國引進的垂穗披堿草種質(zhì)的鑒定以及有關研究[4]的結(jié)果來看，在不同生態(tài)環(huán)境中老芒麥和垂穗披堿草種質(zhì)，由于對環(huán)境的適應性，形態(tài)學上的某些變異常會對這兩種草種的鑒定造成干擾。DNA分子標記是一類不依賴于形態(tài)學的遺傳標記，由于分子標記鑒定是對生物體遺傳物質(zhì)的直接鑒定，相對于形態(tài)學標記鑒定，分子標記鑒定更為直接、客觀、準確。垂穗披堿草和老芒麥在細胞學上倍性不同，在本研究中，通過細胞學鑒定以及在廣泛篩選出的小麥EST-SSR引物Xcwem38c擴增出的多態(tài)性標記可以對垂穗披堿草和老芒麥進行有效辨別。

圖5 引物Xcwem38c在野生材料上的擴增結(jié)果

本研究利用在小麥中開發(fā)出的SSR標記，進行了可區(qū)分老芒麥和垂穗披堿草的多態(tài)性標記篩選。結(jié)果表明，一些SSR標記尤其是EST-SSR標記在不同物種之間具有良好的通用性。對披堿草屬SSR標記研究較早的Sun等[18]，曾經(jīng)成功地利用小麥SSR引物對披堿草屬物種進行了種群遺傳多樣性分析；MacRitchie和Sun[19]也曾經(jīng)利用來自小麥和大麥(Hordeumvulgare)的SSR引物對細莖披堿草(E.trachycaulus)的遺傳多樣性分析，并指出，麥類SSR引物在小麥族近緣物種中具有一定的通用性；嚴學兵等[20]通過對不同來源SSR標記在中國披堿草屬植物的通用性和效率評價指出，親緣關系較近的小麥以及披堿草屬SSR引物遺傳分析的效率更高，即親緣關系越近SSR引物通用性越好。由于目前直接從老芒麥和垂穗披堿草中開發(fā)出來可供利用的SSR標記缺乏，因此利用親緣關系較近物種中已經(jīng)開發(fā)出來的SSR引物也不失為一條較好的捷徑。

老芒麥和垂穗披堿草是青藏高原高寒區(qū)重要的禾本科類牧草，DNA分子標記的應用，將有效促進這兩類牧草種質(zhì)資源的搜集、鑒定以及育種引用。隨著SSR分子標記開發(fā)技術(shù)的改進[21]，開發(fā)老芒麥和垂穗披堿草自身的SSR引物顯得更為經(jīng)濟、簡便、可行。本研究從42對小麥的SSR引物中篩選到了一對可以區(qū)分老芒麥和垂穗披堿草的引物，在今后的研究中，在開發(fā)大量老芒麥和垂穗披堿草自身的SSR引物的基礎上，可篩選出更多重復、穩(wěn)定地進行物種區(qū)分的分子標記，并有望能在分子水平上對老芒麥和垂穗披堿草種質(zhì)的不同生態(tài)型進行準確區(qū)別和鑒定。

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