陳福軍,于海濤,趙 斌,辛國(guó)榮,張立海,王 宇,劉 洋

(佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院,黑龍江 佳木斯 154003)

結(jié)直腸癌是最常見(jiàn)的消化道腫瘤。據(jù)統(tǒng)計(jì),結(jié)直腸癌的死亡率占每年惡性腫瘤總死亡率的10%左右,連續(xù)5年排在第3位。在每年新發(fā)癌癥患者中 ,結(jié)直腸癌同樣以10%左右的發(fā)生率牢牢占據(jù)前3位。結(jié)腸癌的發(fā)病年齡呈年輕化趨勢(shì),術(shù)后轉(zhuǎn)移率、復(fù)發(fā)率逐年升高,已經(jīng)引起疾病控制部門(mén)和臨床醫(yī)生的高度重視。結(jié)腸癌的局部浸潤(rùn)和淋巴轉(zhuǎn)移都在早期發(fā)生。因臨床癥狀發(fā)生較晚、表現(xiàn)不典型及檢查手段的局限性,使結(jié)腸癌的早期診斷愈加困難,客觀上給結(jié)腸癌的浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移提供了時(shí)間。惡性腫瘤的浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移過(guò)程是由多因素參與的復(fù)雜過(guò)程,涉及細(xì)胞游走、定植、增殖、新生血管形成、免疫監(jiān)視等多個(gè)方面,目前還沒(méi)有確切的手段可以對(duì)這個(gè)過(guò)程進(jìn)行監(jiān)測(cè)和控制。因此,本項(xiàng)目對(duì) CD44V6和 RAB5a在結(jié)腸癌中的表達(dá)及相關(guān)性研究,為結(jié)腸癌的早期診斷提供科學(xué)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 標(biāo)本收集

選取2010— 12～ 2011— 12在佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院外科接受治療的60例原發(fā)性結(jié)腸癌患者,其中男 30例,女30例 ,正常結(jié)直腸組織 20例,患者年齡 36～ 79歲 ,平均 56.8歲。術(shù)前均未接受放、化療及抗腫瘤藥物治療,所選取的標(biāo)本均為手術(shù)切除的新鮮組織。

1.2 主要儀器

WMK-08型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(山東);YL-3A回轉(zhuǎn)式切片機(jī) (上海 );HI1220攤片機(jī)、烘片機(jī)(上海);Olympus BX51型電子顯微鏡(日本);HH-W21-600型電熱恒溫水浴箱(上海);Socorex可調(diào)式加樣器(瑞士)。

1.3 主要試劑

鼠抗人 RAB5a單克隆抗體(武漢博士德生物工程有限公司 );鼠抗人 CD44V6單克隆抗體(武漢博士德生物工程有限公司);SABC試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司);DAB顯色試劑盒(福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司);0.01M枸椽酸緩沖液;0.01MPBS緩沖液(pH7.2～ 7.4)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 免疫組化實(shí)驗(yàn)

將手術(shù)切除后的結(jié)腸癌以及癌旁組織標(biāo)本置于4%中性甲醛溶液中固定,常規(guī)石蠟包埋后連續(xù)切片、采用免疫組化法 (SP法)檢測(cè) CD44V6和 RAB5a的表達(dá)情況、實(shí)驗(yàn)步驟嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行、抗原修復(fù)采用微波熱修復(fù)方法。

2.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果判定

每例切片選擇 8個(gè)高倍視野,按照 CD44V6和 RAB5a陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)占視野中總細(xì)胞數(shù)的百分比分為3級(jí):無(wú)陽(yáng)性著色或陽(yáng)性細(xì)胞數(shù) ＜10%為陰性(一);陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)在10%～ 50%之間為陽(yáng)性(+);陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)＞50%為強(qiáng)陽(yáng)性(++ )。以每例切片上相對(duì)正常的組織作為陽(yáng)性對(duì)照。只有明顯胞膜或胞漿染色的細(xì)胞判定為正常染色,如染色不連續(xù),明顯減弱或缺失則被評(píng)定為不正常染色。

2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用 SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件包分析兩獨(dú)立樣本率的差異及配對(duì)資料率的相關(guān)性,用i2檢驗(yàn),P＜0.05為差異有顯著性。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 CD44V6和 RAB5a在結(jié)腸癌中的表達(dá)

CD44V6陽(yáng)性表達(dá)呈棕黃色細(xì)顆粒狀均勻分布,主要位于細(xì)胞質(zhì)中。CD44V 6在正常細(xì)胞中低表達(dá)。RAB5a蛋白陽(yáng)性表達(dá)呈棕黃色細(xì)顆粒狀均勻分布,主要位于細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)中。RAB5a在正常細(xì)胞中低表達(dá)。見(jiàn)表1。

表1 CD44V6和 RAB5a在結(jié)腸癌、癌旁組織及正常組織的表達(dá)

3.2CD44V6和 RAB5a蛋白在結(jié)腸癌中表達(dá)的相關(guān)性研究

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在結(jié)腸癌組織中 CD44V6與 RAB5a的表達(dá)呈正相關(guān) (rs=0.410,P＜0.05),即隨著 CD44V 6表達(dá)的增加 RAB5a的表達(dá)也相應(yīng)的增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,見(jiàn)表2。

表2 CD44V6和 RAB5a蛋白在結(jié)腸癌中表達(dá)的相關(guān)性

4 討論

CD44蛋白是一種未分類(lèi)的黏附分子,機(jī)體可以通過(guò)CD44蛋白受體識(shí)別透明質(zhì)酸和膠原蛋白。近年研究發(fā)現(xiàn),CD44參與多種腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移過(guò)程。CD44V6是科學(xué)家Herrtich在研究一些分化不良的息肉中檢測(cè)以 V 6外顯子發(fā)現(xiàn)上的,由于其在腫瘤浸潤(rùn)中有增強(qiáng)的高頻率表達(dá),從而推測(cè)表達(dá) CD44V6的腫瘤細(xì)胞能夠有利于癌細(xì)胞浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移的條件[1～3]。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn) CD44V6在結(jié)腸癌中表達(dá)陽(yáng)性率明顯高于正常組織及癌旁組。CD44V6的表達(dá)與結(jié)腸癌的分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等情況有關(guān)。CD44V6促進(jìn)轉(zhuǎn)移的機(jī)理可能是它可使癌細(xì)胞獲得轉(zhuǎn)移能力,通過(guò)與遠(yuǎn)隔血管和淋巴管內(nèi)某些配體結(jié)合,使轉(zhuǎn)移至那里的癌細(xì)胞更穩(wěn)定的寄居,形成轉(zhuǎn)移癌灶。RAB5蛋白為 RAB家族成員之一 ,它的主要功能是細(xì)胞內(nèi)囊泡運(yùn)輸?shù)恼{(diào)控因子,RAB5蛋白結(jié)合 GTP時(shí)表現(xiàn)出 GTP酶的活性,包括 RAB5a、RAB5b和 RAB5c。哈爾濱醫(yī)科大學(xué)李鈺等人首次發(fā)現(xiàn) RAB5A蛋白可能與腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)[4,5]。試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn) RAB5a表達(dá)程度隨著結(jié)腸癌分化程度的降低而明顯增高,與結(jié)腸癌患者的年齡、性別、部位無(wú)關(guān)。不同分化程度結(jié)腸癌組織 RAB5a的表達(dá)程度差異有顯著性,RAB5a表達(dá)程度隨著淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、Dukes分期期別升高而明顯升高,與局部浸潤(rùn)無(wú)明顯關(guān)系。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示CD44V6和 RAB5a的表達(dá)對(duì)結(jié)腸癌的較早的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移以及不良預(yù)后有參考價(jià)值 CD44V6和 RAB5a的高表達(dá)與宮頸癌的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)有可能成為判斷結(jié)腸癌侵襲和轉(zhuǎn)移的有價(jià)值的指標(biāo)聯(lián)合檢測(cè)兩種指標(biāo)可作為早期篩查和診斷的標(biāo)志。

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