龐明輝 王 康 伍 剛 張 偉 董丹丹 帥 平 梁耀澤胡 陽(yáng) 李 平 李國(guó)新*

(1.南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院普外科，廣州 510515;2.四川省人民醫(yī)院普外科，成都 610072;3.四川省人民醫(yī)院病理科，成都 610072;4.四川省人民醫(yī)院體檢中心，成都 610072)

LIN28參與形成誘導(dǎo)成體干細(xì)胞，它高表達(dá)于胚胎干細(xì)胞，隨細(xì)胞分化而逐漸低表達(dá)于分化細(xì)胞和成體組織。作為lin28的同源基因，lin28b在肝細(xì)胞癌中首先得到克隆，能夠在肝細(xì)胞癌中高表達(dá)并和細(xì)胞過(guò)度增生相關(guān)［1］。目前，lin28b被認(rèn)為是“癌胚基因”，可促進(jìn)細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化并特異高表達(dá)于部分進(jìn)展期腫瘤，如肝細(xì)胞癌和結(jié)腸癌［2］。國(guó)內(nèi)尚無(wú)lin28b表達(dá)和結(jié)腸癌關(guān)系的報(bào)道。本研究利用EnVision免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測(cè)美國(guó)Biomax結(jié)腸癌組織芯片(208例結(jié)腸癌，8例正常組織)和南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院149例手術(shù)切除石蠟切片中l(wèi)in28b的表達(dá)并進(jìn)行染色評(píng)分，行χ2檢驗(yàn)研究其表達(dá)強(qiáng)度與結(jié)腸癌臨床病理特征的關(guān)系，判斷l(xiāng)in28b在結(jié)腸癌中的臨床價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象

1)第一組研究對(duì)象:購(gòu)買西安超英生物公司代理美國(guó)Biomax的結(jié)腸癌及正常組織組合微陣列芯片(編號(hào)CO2161)，包含208例腫瘤和8例正常結(jié)腸組織的病理信息。該組織芯片樣點(diǎn)直徑1.0mm，厚度5 μm，采用中性甲醛固定。208例結(jié)腸癌中男118例，女90例，年齡24～82歲，平均年齡54.8歲，其高分化腺癌83例，中分化腺癌8例，低分化腺癌4例。Ⅰ期2例，Ⅱ期130例，Ⅲ期46例，Ⅳ期11例。發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移55例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移153例，伴遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移11例，無(wú)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移197例。詳見(jiàn)表1。

表1 臨床資料Tab.1 Clinical characteristics of patients/tumors at the time of diagnosis

2)第二組研究對(duì)象:在臨床研究倫理學(xué)會(huì)委員會(huì)批準(zhǔn)、病人知情同意的情況下，選擇在南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院普通外科2003年1月至2004年12月行手術(shù)切除的149例結(jié)腸癌組織標(biāo)本，10%甲醛固定后石蠟包埋。所有標(biāo)本均詳細(xì)記載病人基本信息，記錄腫瘤TNM分期、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移情況。其中，男性患者88例，女性61例，年齡19～85歲，平均年齡56.9歲;高分化腺癌70例，中分化腺癌67例，低分化腺癌12例，原位癌1例;TNMⅠ期25例，Ⅱ期65例，Ⅲ期42例，Ⅳ期16例;發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移52例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移97例，遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移16例，無(wú)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移133例。兩組研究對(duì)象均將高、中分化腺癌歸入分化較好組，將低分化腺癌歸入分化較差組。

3)入組與排除標(biāo)準(zhǔn):

(1)入組標(biāo)準(zhǔn):①首次因結(jié)腸癌就診，未經(jīng)治療病例;②結(jié)腸單一部位病變;③兩位以上病理醫(yī)師共同確診;④結(jié)腸癌病例有完整的隨訪資料;⑤術(shù)前均未行新輔助放化療。

(2)排除標(biāo)準(zhǔn):①非首次就診病例;②結(jié)腸多部位病變病例;③家族性腺瘤性息肉及其他結(jié)腸疾病，例如潰瘍性結(jié)腸炎、結(jié)腸結(jié)核、克隆病等病例;④患有身體其他部位惡性腫瘤的病例;⑤有身體免疫缺陷疾病，例如人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)攜帶者或獲得性免疫缺陷綜合征(acquired immunodeficiency syndrome，AIDS)患者的病例;⑥術(shù)前行新輔助放化療者。

1.2 免疫組織化學(xué)檢測(cè)

采用EnVision免疫組化技術(shù)(試劑盒購(gòu)自丹麥Dako公司)檢測(cè)組織芯片和石蠟切片中l(wèi)in28b的表達(dá)。lin28b一抗購(gòu)自英國(guó)Abcam公司，貨號(hào)ab71415，稀釋濃度1∶10，以PBS液代替一抗作陰性對(duì)照。由兩名病理科醫(yī)師在雙盲情況下對(duì)每個(gè)標(biāo)本進(jìn)行染色評(píng)分。結(jié)果按照如下標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判斷:陰性為無(wú)色，陽(yáng)性為細(xì)胞質(zhì)染色呈棕黃色。根據(jù)陽(yáng)性染色細(xì)胞百分比計(jì)分:高倍鏡下每張切片選擇10個(gè)有代表性的視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)腫瘤細(xì)胞共計(jì)數(shù)1000個(gè)細(xì)胞。0分為陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)小于或等于5%，1分為陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)10%～25%，2分為陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)25%～50%，3分為陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)大于50%，將0～2分計(jì)為低表達(dá)，3分為高表達(dá)［3］。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)數(shù)資料的比較采用χ2檢驗(yàn)。對(duì)單元格的期望頻數(shù)均大于1，但有小于1/5的單元格期望頻數(shù)小于5，采用連續(xù)性校正χ2檢驗(yàn)。采用逐步回歸法進(jìn)行多因素Logistic回歸分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

1)美國(guó)Biomax結(jié)腸癌組織芯片免疫組化結(jié)果顯示，lin28b在正常結(jié)腸黏膜組織中均未染色，但在結(jié)腸癌組織中均有染色且隨分化程度的降低，lin28b表達(dá)強(qiáng)度增加(圖1)。

圖1 Lin28在美國(guó)biomax的組合芯片中的表達(dá)(免疫組化染色)Fig.1 Expression Lin28b in colon cancer tissue microarrays detected by immunohistochemistry

2)采用χ2檢驗(yàn)分析lin28b表達(dá)強(qiáng)弱和結(jié)腸癌病理學(xué)特征之間的聯(lián)系，結(jié)果證實(shí)lin28b表達(dá)水平與腫瘤較差分化、較高TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有關(guān)(P＜0.001)，見(jiàn)表2。

表2 組織芯片lin28b表達(dá)與結(jié)腸癌臨床病理之間的關(guān)系Tab.2 Expression of lin28b and its relationship with clinical pathology in colon cancer tissue microarrays n(%)

3)為驗(yàn)證前述美國(guó)Biomax結(jié)腸癌組織芯片實(shí)驗(yàn)的可重復(fù)性，本研究組進(jìn)一步在中國(guó)南方醫(yī)院的結(jié)腸癌石蠟標(biāo)本中重復(fù)上述實(shí)驗(yàn)并得到一致的結(jié)果，顯示lin28b的表達(dá)在西方和中國(guó)人群中均與進(jìn)展期結(jié)腸癌病理學(xué)特征(腫瘤較差分化、TNM分期Ⅲ～Ⅳ期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移)有關(guān)，見(jiàn)表3。

4)由于組織芯片來(lái)源于美國(guó)Biomax公司，獲取的臨床信息有限，且無(wú)隨訪資料，所以我們僅對(duì)南方醫(yī)院收集到的149例臨床資料及隨訪信息完整的結(jié)腸癌組織切片的資料進(jìn)行了Logistic多因素回歸分析，將lin28b表達(dá)作為因變量，年齡、性別、組織分化程度、TNM分期作為自變量納入回歸方程。逐步回歸分析結(jié)果顯示，僅TNM分期是lin28b高表達(dá)的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(OR=6.583，95%CI:2.97～14.59)。

表3 組織切片lin28b表達(dá)與結(jié)腸癌臨床病理之間的關(guān)系Tab.3 Expression of lin28b and its relationship with clinical pathology in paraffin-embedded surgically resected colon cancer tissues n(%)

3 討論

lin28基因編碼一種具有冷休克結(jié)構(gòu)域和反轉(zhuǎn)錄病毒型鋅指結(jié)構(gòu)的胞漿蛋白，在秀麗隱桿線蟲(chóng)中最先發(fā)現(xiàn)，參與維持干細(xì)胞“干性”。lin28b是lin28的同源基因，位于6q21，長(zhǎng)度為752個(gè)堿基，GeneBank編號(hào)為NM_001004317。二者編碼的蛋白功能相近，在胚胎干細(xì)胞和發(fā)育組織中高表達(dá)，隨細(xì)胞分化而逐漸低表達(dá)，在腫瘤組織中則反常高表達(dá)。lin28b實(shí)質(zhì)為一種高度保守的RNA結(jié)合蛋白，大小為27 000，主要通過(guò)抑制非編碼的Let-7 microRNA家族來(lái)實(shí)現(xiàn)其促癌作用［4-7］。lin28b/Let-7通路與多種細(xì)胞生物學(xué)功能有關(guān)，與多種腫瘤發(fā)生和發(fā)展相關(guān)，其中包括結(jié)腸癌［8］。

國(guó)內(nèi)外多項(xiàng)研究認(rèn)為lin28b多高表達(dá)于分化程度低的腫瘤［9-11］。本課題組研究結(jié)果顯示lin28b在正常結(jié)腸組織中未表達(dá)，在低分化結(jié)腸腺癌組織中表達(dá)較強(qiáng)，高分化組織中表達(dá)較弱，這說(shuō)明隨腫瘤組織分化程度和lin28b表達(dá)存在負(fù)相關(guān)。Saiki Y等［12］研究發(fā)現(xiàn)lin28表達(dá)與結(jié)直腸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及Dukes分期顯著相關(guān)，本課題組的結(jié)果也證實(shí)Ⅲ、Ⅳ期結(jié)腸癌組織中l(wèi)in28b蛋白的表達(dá)顯著高于Ⅰ、Ⅱ期結(jié)腸癌。多因素Logistic回歸分析顯示TNM分期是lin28b高表達(dá)的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。因此，可認(rèn)為結(jié)腸癌TNM分期越晚，lin28b的表達(dá)越強(qiáng)。

轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)是結(jié)腸癌患者死亡的主要原因，轉(zhuǎn)移發(fā)生包括細(xì)胞與基底膜黏附、細(xì)胞外基質(zhì)的降解及細(xì)胞的遷出進(jìn)入血管［13］。Wang Y C 等［14］研究認(rèn)為lin28b高表達(dá)可增加肝癌細(xì)胞侵襲能力，蔡民等［15］證實(shí)lin28b/Let-7通路對(duì)膽囊癌細(xì)胞在降解細(xì)胞外基質(zhì)及隨后的遷移方面有著重要作用。Klemke M等［16］研究指出lin28通過(guò)抑制Let-7合成并上調(diào)Let-7下游癌基因hmga2的表達(dá)而最終促進(jìn)上皮細(xì)胞向間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化，對(duì)腫瘤轉(zhuǎn)移發(fā)生具有重要意義［17］。本課題組研究結(jié)果顯示lin28b高表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有關(guān)，提示lin28b高表達(dá)可能促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞侵襲及轉(zhuǎn)移，下一步將采用Transwell實(shí)驗(yàn)從分子水平研究lin28b對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞遷移及侵襲能力的影響。

綜上，本研究采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)干細(xì)胞相關(guān)因子lin28b在結(jié)腸癌中的表達(dá)，結(jié)果顯示lin28b的高表達(dá)與結(jié)腸癌低分化、TNM分期Ⅲ-Ⅳ期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)，其表達(dá)水平可作為判斷結(jié)腸癌患者病程進(jìn)展及預(yù)后的重要指標(biāo)，本研究結(jié)果有望為結(jié)腸癌靶向治療提供新的治療靶點(diǎn)。進(jìn)一步我們將利用完善的隨訪資料進(jìn)行l(wèi)in28b表達(dá)水平與結(jié)腸癌病人術(shù)后生存及復(fù)發(fā)方面的系列研究。

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